郭秉榮，楊 嵐，劉佳麗，秦雪梅，高曉霞

(山西大學(xué)1.中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，2.化學(xué)化工學(xué)院，山西太原 030006)

抑郁癥是由多種因素引起的情感障礙性疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)。目前，臨床對抑郁癥的診斷主要是使用量表結(jié)合臨床進(jìn)行評定，如漢密頓抑郁量表(Hamilton depression scale，HAMD)和抑郁自評量表(self-rating depression scale，SDS)等，但尚缺乏客觀、可量化的抑郁癥診斷方法和標(biāo)準(zhǔn)。很多學(xué)者對抑郁癥患者的腦[1]及外周血[2－3]進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)的異常與抑郁程度有密切關(guān)系，且外周血的神經(jīng)遞質(zhì)可反映腦中神經(jīng)遞質(zhì)的狀態(tài)，外周血神經(jīng)遞質(zhì)的變化可作為抑郁癥評定的重要參考指標(biāo)。因此，探尋與抑郁癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的血液中的神經(jīng)遞質(zhì)將有望為抑郁癥的客觀準(zhǔn)確診斷提供有效手段。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，慢性不可預(yù)知應(yīng)激(chronic unpredictable stress，CUS)模型是一種被廣泛采用的大鼠抑郁模型，它不僅模擬了人類抑郁的核心癥狀，即快感缺乏，同時(shí)也模擬了重癥抑郁障礙的其他癥狀表現(xiàn)，如運(yùn)動(dòng)能力及社會(huì)交往能力下降、探索行為能力下降、侵犯攻擊能力缺陷、性行為能力下降等等[4]。目前對抑郁模型是否成功建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)，多使用曠場數(shù)據(jù)或者糖水消耗數(shù)據(jù)[5－6]，也有學(xué)者通過對抑郁造模過程中不同天數(shù)的糖水偏愛及曠場數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和研究。這也只是模擬了臨床上對抑郁癥判定時(shí)的評價(jià)量表，需要找到更客觀、更具體、更易量化的指標(biāo)來評價(jià)抑郁癥。抑郁癥單胺假說以及其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，抑郁大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)有顯著變化[7]，有學(xué)者研究了大鼠抑郁樣過程中大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化[8]，但未見對大鼠抑郁樣過程中大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的研究。本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用代謝組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠氨基酸代謝異常[9－10]，依據(jù)前期工作和相關(guān)文獻(xiàn)，本研究觀察CUS造模過程中不同時(shí)間血清中10種內(nèi)源性成分的含量變化規(guī)律及其與抑郁癥的相關(guān)性，以期用客觀的指標(biāo)描述CUS造模過程，尋找潛在臨床診斷指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀和熒光檢測器，美國安捷倫公司。去甲腎上腺素(norepinephrine， NE)，批 號 169-9402，5-羥 色 胺 (5-hydroxytryptamine，5-HT)，批號111656-200401，多巴胺(dopamine，DA)，批號100070-200405，均中國藥品生物制品檢定所;高香草酸(homovanillic acid，HVA);3，4-二羥基苯乙酸(3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)均 Alfa Aesar;腎上腺素(epinephrine，E);5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindole-3-acetic acid，5-HIAA)均 Sigma;左旋多巴(levodopa，L-DOPA)，生工生物;酪氨酸(tyrosine，Tyr)，色氨酸 (tryptophan，Trp)均日本Solarbio。醋酸鈉，分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司;檸檬酸，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠;乙二胺四乙銨二鈉，分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠;辛烷磺酸鈉，高純試劑，華北地區(qū)特種化學(xué)試劑開發(fā)中心;娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 動(dòng)物及分組與造模

16只Sprague-Dawley(SD)成年雄性健康大鼠，清潔級，體質(zhì)量(200±20)g(±s)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證號:SCKX-2006-0008。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周，置于自然晝夜節(jié)律光照條件下，自由進(jìn)食、飲水，每日觸摸動(dòng)物以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作。光照:12 h光/黑暗循環(huán)，早8:00開燈，晚8:00關(guān)燈。根據(jù)體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=8)和模型組(n=8)。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)[9]，模型組采用CUS配合孤養(yǎng)的造模方法(表1)。刺激方法包括:①禁食24 h;②禁水24 h;③4℃冰水游泳5 min;④50℃熱應(yīng)激5 min;⑤夾尾1 min(于距離大鼠尾根部2 cm處);⑥電擊足底(電壓為22 V，每隔30 s刺激1次，持續(xù)10 s，共15次);⑦ 潮濕墊料和傾斜45°(12 h);⑧束縛4 h(以礦泉水瓶作為束縛裝置，使大鼠頭部在礦泉水瓶的開口端，不影響其呼吸為宜);⑨陌生物品(如塑料片、瓶蓋、碎布等，12 h);⑩ 噪聲刺激(60 Hz，1 h)。模型組從第1天開始孤養(yǎng)，且每天上午8:00給予一種刺激，順序隨機(jī)，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，應(yīng)激持續(xù)21 d。正常對照組群養(yǎng)且不給于任何刺激。

Tab.1 Schedule ofchronic unpredictable stress(CUS)items

1.3 大鼠體質(zhì)量、曠場和糖水偏愛率的檢測[10]

分別于造模前(d0)、造模d7，d14和d22，稱大鼠體質(zhì)量，進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)和糖水偏愛實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 曠場實(shí)驗(yàn)

將單只大鼠置于長寬各100 cm、高50 cm光潔敞箱中央，敞箱底面劃分為25個(gè)等邊方格，內(nèi)面用黑漆涂滿，觀測大鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)情況:觀察指標(biāo)包括中央格停留時(shí)間(自大鼠被放入中央格至其三爪跨離該格的時(shí)間，以s計(jì))、水平穿越格數(shù)(以穿越底面方格數(shù)為其水平得分，穿越1格為1分)、直立次數(shù)(兩前肢離地或爬墻壁)、理毛時(shí)間。并在徹底清潔敞箱后再進(jìn)行下一只大鼠的得分測定。

1.3.2 糖水偏愛實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前2 d對所有大鼠進(jìn)行1%蔗糖水訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)(即先糖水喂養(yǎng)48 h)，接著禁水24 h，每只大鼠準(zhǔn)備糖水和自來水，稱質(zhì)量。通過測定飲水瓶的總量來計(jì)算4 h糖水消耗量和自來水消耗量，計(jì)算糖水偏愛率。糖水消耗偏愛率(%)=糖水消耗/總水消耗量(糖水+自來水)×100%。

1.4 HPLC-FD檢測神經(jīng)遞質(zhì)

1.4.1 血清樣品的采集、處理

分別于造模d0，d6，d9，d12，d15早晨給予刺激前和d22同一時(shí)間，采用眼眶取血的方式采集血液 0.5 ml，置于 EP 管中，靜置 30 min，4℃15100×g離心10 min，分離血清，儲(chǔ)存于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)，取100 μl血清樣品，置2 ml EP管中，加入100 μl 6%高氯酸溶液，渦旋，4℃15100×g離心10 min，取上清，進(jìn)行高效液相色譜儀分析。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別 稱 取 5-HT，NE，E，DA，L-DOPA，5-HIAA，HVA，DOPAC，Tyr和Trp標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，以高氯酸 0.1 mol·L－1和 EDTA-2Na 0.2 mmo·lL－1混合溶液配制成濃度分別為2.36，3.55，10.04，4.50，12.53，8.32，5.98，14.15，11.42 和 11.65 mmol·L－1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，貯存于－20℃冰箱內(nèi)。測定時(shí)配制成濃度分別為4.31，57.33，5.46，5.42，0.81，1.15，64.28，1.25，30.41 和 34.62 μmol·L－1的混標(biāo)溶液，搖勻，進(jìn)行高效液相色譜儀分析。

1.4.3 色譜條件

色譜柱:Agilent SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相(mmol·L－1):甲醇∶緩沖液(含醋酸鈉40、檸檬酸30、EDTA-2Na 0.2、辛烷磺酸鈉0.4，pH 3.8)=14∶86(V/V)，流速:1.0 m·lmin－1;柱溫25℃;熒光檢測波長:λex=300 nm，λem=330 nm;進(jìn)樣量:20 μl。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)激對大鼠體質(zhì)量、曠場和糖水偏愛率的影響

如表2所示，與正常對照組相比，在造模前(d0)與造模期間d7，模型組大鼠的體質(zhì)量、糖水偏愛率、曠場實(shí)驗(yàn)均無顯著差異;在造模期間d14后，直立次數(shù)有顯著降低(P＜0.05);在造模期間d22時(shí)，與正常對照組相比，模型組大鼠的體質(zhì)量、穿格數(shù)、直立次數(shù)和糖水偏愛率顯著降低(P＜0.05)，說明21 d造模成功。

2.2 應(yīng)激對大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

由表3可知，與正常對照組相比，模型組大鼠血清中NE的含量在造模d9顯著降低(P＜0.05)，HVA和5-HT的含量在造模d15顯著降低(P＜0.05);模型組大鼠血清中5-HIAA的含量在 d6，d15和d22顯著降低(P＜0.05)，在造模d9和d12顯著差異消失，模型組大鼠血清中Tyr的含量只在造模d6出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)，在造模d9～d22顯著差異消失;模型組大鼠血清中Trp，L-DOPA，DA，DOPAC和E的含量均未出現(xiàn)顯著差異。由結(jié)果可知，5-HIAA和Tyr較敏感，大鼠在受到急性刺激后即改變明顯，且受到急性刺激后的改變是可以自愈的，但在慢性應(yīng)激持續(xù)到15 d后，5-HIAA仍會(huì)出現(xiàn)顯著降低，而且降低的程度逐漸增大。因此，5-HIAA和Tyr作為比較敏感的兩個(gè)指標(biāo)，可以在行為學(xué)指標(biāo)尚未出現(xiàn)顯著差異時(shí)就顯示出模型組大鼠和正常對照組大鼠的區(qū)別。在造模過程中與正常對照組相比，模型組大鼠血清中Trp，L-DOPA，DA，DOPAC和E的含量雖在d22均有降低的趨勢，但均無顯著差異，因此，這5種內(nèi)源性成分不能作為抑郁癥的判斷指標(biāo)。

Tab.2 Effect of chronic stress on body mass，sucrose preference and open-field activity scores

Tab.3 Content of neurotransmitters in serum of UCS model rats

2.3 情志指數(shù)的提取及神經(jīng)遞質(zhì)與其的相關(guān)性分析

運(yùn)用SPSS16.0軟件，以模型組中動(dòng)物行為學(xué)指標(biāo):大鼠體質(zhì)量(X1)、直立次數(shù)(X3)、糖水偏愛率(X2)和穿格數(shù)(X4)4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，找出其綜合效應(yīng)指標(biāo)，即情志指數(shù)(Y1)。分析結(jié)果如表4，其中累計(jì)貢獻(xiàn)率不低于80%且保留特征值大于1的主成分有一個(gè)，即情志指數(shù)(Y1)。且模型組情志指數(shù)與其4個(gè)觀測指標(biāo)間的關(guān)系式為Y1=－0.919X1+0.907X2+0.958X3+0.879X4。由此可以計(jì)算出造模過程中模型組動(dòng)物的情志指數(shù)。

將不同時(shí)間模型組神經(jīng)遞質(zhì)與其情志指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，找出與情志指數(shù)變化相關(guān)性較高的神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)，以期用作輔助診斷抑郁癥的生化指標(biāo)。分析結(jié)果如表5，其中相關(guān)系數(shù)大于0.80的有3種，NE，5-HT，HVA與情志指數(shù)(Y1)的相關(guān)系數(shù)分別為0.94(P=0.05)，0.88(P=0.11)，－0.82(P=0.18)，相關(guān)性好，且顯著性較高。利用相同的計(jì)算方法，對正常組動(dòng)物的行為學(xué)與神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)也進(jìn)行了分析，不存在上述的相關(guān)性，在一定程度上可以作為抑郁癥診斷與治療的潛在生物標(biāo)志物。

Tab.4 Total variance explained on behavior scores of UCS model rats

Tab.5 Correlation coefficient between characteristic index and neurotransmitters of UCS model rats

3 討論

目前關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制有很多假說，其中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說堪稱經(jīng)典。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括5-HT和兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE，DA，E及它們的代謝產(chǎn)物5-HIAA，HVA，DOPAC等。在本實(shí)驗(yàn)室的前期代謝組學(xué)的工作中[9]找到的標(biāo)志物中除了以上神經(jīng)遞質(zhì)外，還發(fā)現(xiàn)Trp與Tyr與抑郁癥也有密切的關(guān)系。Tyr可在酪氨酸羥化酶的作用下生成L-DOPA，然后通過多巴脫羧酶作用生成DA，DA的側(cè)鏈β碳原子可再次羥化生成NE，經(jīng)N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化生成E。另外，DA在神經(jīng)元內(nèi)還可代謝生成DOPAC和HVA;Trp在色氨酸羥化酶的作用下生成5-羥基色氨酸，再經(jīng)芳香族氨基酸脫羧酶的作用脫去羧基生成5-HT，在單胺氧化酶作用下生成5-HIAA。

測定神經(jīng)遞質(zhì)多采用熒光分光光度法[11]、HPLC-FD[12－14]和 HPLC-ECD[15－16]，而且同時(shí)測定的指標(biāo)最多為8個(gè)。本研究通過考察色譜系統(tǒng)可以同時(shí)測定10種物質(zhì)，所得色譜圖中10個(gè)峰都達(dá)到了基線分離，峰型都很穩(wěn)定，無雜質(zhì)干擾峰。本實(shí)驗(yàn)室前期已完成了方法學(xué)考察研究，線性良好，精密度、穩(wěn)定性和回收率都符合規(guī)定。本研究中DA和DOPAC的含量測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差較大，可能是DA和DOPAC在血清中的含量低而且大鼠組內(nèi)個(gè)體差異較大造成的。

神經(jīng)遞質(zhì)之間有錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為[17]，大腦神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)突觸間的濃度相對或絕對不足會(huì)導(dǎo)致整體精神活動(dòng)和心理功能的全面性低下狀態(tài)。羅海鷗等[1]的研究表明，抑郁癥患者腦內(nèi)5-HT和NE的水平降低與抑郁程度有密切關(guān)系，丁桂霞等[17]的研究和張媛媛[18]的研究表明大鼠經(jīng)過慢性應(yīng)激刺激后，抑郁癥模型大鼠皮質(zhì)、海馬、紋狀體和下丘腦NE，5-HT和DA及其代謝產(chǎn)物、合成前體的含量明顯降低，表明腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的含量與抑郁癥有密切的關(guān)系。但是，對腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)測定時(shí)需破壞性取樣，無法用于臨床測定。

肖紅等[2]的研究表明，抑郁癥患者外周血中神經(jīng)遞質(zhì)可反映腦中神經(jīng)遞質(zhì)的狀態(tài)，楊慧敏等[3]的研究表明，抑郁癥患者外周血中5-HT，DA和NE的水平低于正常人。本研究結(jié)果表明，抑郁癥模型大鼠血液中5-HT，NE和DA含量顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道[7－8，19]的研究結(jié)果一致，且和腦組織的測定結(jié)果一致[17－18]，說明大鼠血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度與腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化趨勢相同，可用血液代替腦組織來監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)的變化。本研究不僅驗(yàn)證了單胺假說，而且揭示了神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化過程。

另外，本實(shí)驗(yàn)室前期[20]及近期進(jìn)行了文拉法辛實(shí)時(shí)判斷和進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)對海馬和血清進(jìn)行檢測。文拉法辛是5-HT和NE的再攝取抑制劑，是DA的弱抑制劑，是常用的抗抑郁藥。結(jié)果表明，大鼠經(jīng)ig給藥21 d后，與模型組相比，海馬中NE，5-HT含量均顯著提高;血清中NE，5-HT和HVA含量均顯著提高，DA雖未表現(xiàn)出顯著提高，但是其代謝產(chǎn)物HVA的含量顯著提高。在一定程度上，可以證明本研究篩選出的指標(biāo)NE，5-HT和HVA可作為抑郁癥診斷評定的重要的潛在生物標(biāo)志物，與抑郁癥關(guān)系密切。臨床研究表明[21]，抑郁癥患者經(jīng)文拉法辛治療后，血漿中NE和5-HT濃度均顯著提高，一定程度上也可以為本研究佐證。

但是，其是否具有代表性、是否是抑郁癥特有指標(biāo)，還需進(jìn)行進(jìn)一步藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，給予NE，5-HT和HVA的單體來考察NE，5-HT和HVA是否為抑郁癥的特異性標(biāo)志物，或者從分子藥理學(xué)的水平考察其影響的酶或基因。

本研究利用CUS配合孤養(yǎng)模型成功建立抑郁大鼠模型，研究了大鼠行為學(xué)和血清中10種內(nèi)源性成分在大鼠抑郁樣行為形成過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并對行為學(xué)進(jìn)行主成分分析及它們之間進(jìn)行了相關(guān)性分析。從大鼠行為學(xué)的動(dòng)態(tài)變化可以看出造模14 d后大鼠開始出現(xiàn)抑郁狀態(tài)，造模21 d抑郁模型造模成功;從神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化過程中可以看出5-HIAA和Tyr可作為抑郁癥初期判斷的重要指標(biāo)，NE，5-HT和HVA的變化在一定程度上可以定量地反映大鼠的抑郁狀態(tài)及程度。神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)性分析的結(jié)果均證明了5-HT和NE是經(jīng)典的與抑郁癥相關(guān)的指標(biāo)，而且說明了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝產(chǎn)物也與抑郁癥有密切的關(guān)系，可作為抑郁癥的生物標(biāo)志物。本研究深入了解CUS配合孤養(yǎng)模型的認(rèn)識(shí)以及為尋找預(yù)防和診斷抑郁癥的定量指標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。

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