鐘會清，劉智明，倪藝榕，熊紅蓮，郭周義

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和中醫(yī)藥與光子技術(shù)國家中醫(yī)藥管理局三級實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631)

0 引言

拉曼光譜技術(shù)(Raman)是從物質(zhì)的分子振動光譜來識別和區(qū)分不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種技術(shù)，具有快速、簡單、無損、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的重要手段，被公認(rèn)為是研究分子結(jié)構(gòu)和功能的有效方法之一［1］。由于拉曼光譜對生物組織病理微小的分子和結(jié)構(gòu)的變化有很好的敏感性，很高的空間分辨率，不會導(dǎo)致自發(fā)熒光和光漂白作用，對水不敏感，樣品易準(zhǔn)備等特性，使得拉曼光譜技術(shù)能應(yīng)用于檢測人體組織結(jié)構(gòu)、生理或疾病狀況，從而在分子水平上預(yù)測、診斷人體的健康狀況(包括各種癌癥)已成為物理學(xué)家與醫(yī)學(xué)家夢寐以求的愿望［2-5］。國內(nèi)外學(xué)者已廣泛開展了拉曼光譜在人體組織，包括各種組織癌變［6-9］、血液［10-12］、皮膚疾?。?3-15］等的檢測與診斷。然而，由于各種生物組織具有高散射性，因此不利于對深層組織的成像，使得拉曼光譜技術(shù)只能用于淺表組織區(qū)域。

為了改善光在組織中的滲透深度，多重散射必須降低。在1997年俄羅斯Tuchin研究小組利用近紅外光譜儀檢測了光透明劑作用后眼球組織，發(fā)現(xiàn)光透明及對反射光強(qiáng)的減少起作用，進(jìn)而推斷光透明劑具有控制組織光學(xué)參數(shù)的作用［16］。隨后很多光學(xué)儀器被用來檢測光透明物質(zhì)對其光學(xué)特性的影響，例如:光學(xué)相干層析成像技術(shù)(Optical coherence tomography，OCT)［17，18］，二次諧波成像［19］，近紅外光譜技術(shù)［20］等。本論文采用光透明劑---二甲基亞砜對拉曼光譜光學(xué)特性的影響進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料和樣品的制備

新鮮豬皮組織(未去脂肪)來自合格的宰豬場，實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)蒸餾水清洗和除毛處理后，密封(防止自然失水)后保存在4℃的環(huán)境下不超過12 h，并在實(shí)驗(yàn)前將樣品置于常溫下30 min，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了防止皮膚組織樣品在實(shí)驗(yàn)過程中自然失水導(dǎo)致皮膚形態(tài)和性質(zhì)發(fā)生變化，實(shí)驗(yàn)中皮膚組織保持表皮朝上置于培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿中注入磷酸鹽(Phosphate buffer saline，PBS)緩沖液，使皮膚樣品下端浸入PBS緩沖液，同時表皮暴露在空氣中。共切15個面積為2.5 cm ×2.5 cm，平均厚度為(2.0 ±0.65)cm的組織，在處理前和處理后的10 min，20 min，30 min，60 min都利用顯微共聚焦拉曼光譜儀進(jìn)行檢測。

pH7.4 的 PBS溶液的配制:將 1.0 g KCl，40 g NaCl，1.2 g KH2PO4，18.16 g NaHPO4.12H2O(以上四種試劑均由天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn))，溶于400mL雙蒸水中，并調(diào)至 pH7.4，最后定容至500mL，得到10×PBS母液。使用前稀釋10倍即得1×PBS溶液，置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，濃度為100%)是購于天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用的5%DMSO是按照100%DMSO與蒸餾水按體積5∶95的比例配制的。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)選用Renishaw inVia Reflex型顯微共聚焦拉曼光譜儀(英國Renishaw公司)，20倍鏡頭，波長為785 nm的半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源，其到達(dá)樣品上的功率約50 mW，積分時間10 s，采集次數(shù)2次，光譜波數(shù)范圍為385～1539 cm-1，采用背向接收的方式采集樣品的拉曼信號。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

采用Origin數(shù)據(jù)分析處理軟件及inVia Reflex型顯微拉曼光譜儀自帶的分析處理軟件WIRE3.2對數(shù)據(jù)進(jìn)行累加處理及譜峰分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

2.1 豬皮膚組織和DMSO的拉曼光譜

在圖1(A)中854 cm-1為脯氨酸吡硌環(huán)C-C鍵振動峰，937 cm-1拉曼峰歸屬于豬皮組織中分子的C-C建骨架的伸縮振動，1003 cm-1拉曼峰歸屬于豬皮組織中苯基苯丙氨酸等。圖1(B)為DMSO的拉曼光譜的譜圖，其主要特征峰有680 cm-1，為 C-S伸縮譜;1014 cm-1、1419 cm-1處分別為S-O伸縮譜和CH3的振動譜，因?yàn)檫@兩個信號易受豬皮峰影響，而680 cm-1信號很強(qiáng)，因此之后我們對680 cm-1來觀察其在皮膚組織的滲透情況，以及對皮膚組織937 cm-1和1003 cm-1來觀察DMSO對皮膚組織的光透明性質(zhì)的變化。

Fig.1 (A)Raman spectrum of porcine skin;(B)DMSO between 395 and 1539 cm-1.The dashed lines indicate the spectral signatures for the porcine skin and the spectral signature for DMSO.680 cm-1is the most different spectral signature comparing DMSO with porcine skin圖1 (A)和(B)分別為豬皮組織和DMSO在385～1539 cm-1區(qū)域的譜圖，其中虛線標(biāo)注了皮膚的特征峰和DMSO，其中在(B)680 cm-1是DMSO與豬皮組織區(qū)別最大的特征峰

Fig.2 Raman spectra of porcine skin at(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm after topically application of 5%DMSO at different time intervals圖2 離體豬皮膚組織經(jīng)5%DMSO處理前、后在不同時間(0 min，10 min，20 min，30 min，60 min)及不同深度(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm 的拉曼光譜的變化

2.2 DMSO作用于離體豬皮膚組織前后的不同深度的拉曼光譜的變化

為了研究DMSO對豬皮組織拉曼光譜的影響及其隨時間的變化，我們對經(jīng)5%DMSO處理前(0 min)和后10 min，20 min，30 min，及60 min的豬皮不同深度(100μm，200μm，300μm，400μm)的拉曼光譜進(jìn)行比較(如圖2)。從圖中發(fā)現(xiàn)，總趨勢是:皮膚組織的拉曼光譜強(qiáng)度隨著檢測深度的增加而逐漸降低，信噪比也逐漸降低。在表面下400μm處0 min時，其拉曼信號強(qiáng)度非常小，圖像信噪比也很低，937 cm-1和1003 cm-1處的峰幾乎被熒光背景所覆蓋。在經(jīng)5%DMSO溶液處理之后，拉曼峰937 cm-1和1003 cm-1，的強(qiáng)度比處理前有了很大程度的改善，圖像信噪比也明顯提高了。此外，在沒有施加5%DMSO前在拉曼譜圖上消失拉曼峰1126 cm-1和1426 cm-1在施加5%DMSO后又重新出現(xiàn)。同時圖2(a-d)顯示，各層隨著處理時間的加長，5%DMSO對豬皮組織的拉曼光譜的效果也不斷的改善，其中在處理后60 min時，是各層拉曼信號最強(qiáng)。

2.3 DMSO作用于離體豬皮膚組織前后在不同深度其幾個峰強(qiáng)的變化

為了更好的分析5%DMSO對豬皮組織的拉曼光譜的影響，我們對圖2進(jìn)行了進(jìn)一步的量化比較，統(tǒng)計了皮膚組織在施加5%DMSO前、后(10 min，20 min，30 min，60 min)時距皮膚表面以下不同深度處各個主要特征拉曼峰(680 cm-1，937 cm-1和1003 cm-1)強(qiáng)度的變化。圖3顯示:各層在經(jīng)5%DMSO處理后豬皮組織的各個峰及DMSO的特征峰的強(qiáng)度隨著時間的推移而不斷增強(qiáng)，并在60 min時強(qiáng)度達(dá)到最大。

Fig.3 The Raman peak intensities of porcine skin at(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm corresponding to the Raman spectra in Fig.2，The line styles represents a characteristic peak of the DMSO(680 cm-1)and porcine skin Raman spectra(937 cm-1and 1003 cm-1)，respectively圖3 分別表示DMSO(680 cm-1)和豬皮組織(938 cm-1，1003 cm-1)的特征峰在與圖2相對應(yīng)的(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm 不同層隨時間的變化情況

3 結(jié)論

通過對離體豬皮組織不同深度經(jīng)5%DMSO處理前、后不同時間的拉曼光譜進(jìn)行分析研究，以及對豬皮組織的拉曼光譜隨時間變化進(jìn)行了實(shí)時監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)豬皮組織的拉曼光譜在處理后的60 min效果最好。結(jié)果表明:5%DMSO處理后的豬皮組織的拉曼光譜的信噪比有很大的提高，各特征峰的強(qiáng)度相對于處理前也有非常大的增強(qiáng)。這種增強(qiáng)效果幾乎是隨著施加5%DMSO的時間增加而加強(qiáng)。

［1］THOMAS G J.Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies［J］.Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，1999，28:1-27.

［2］HANLON E B，MANOHARAN R，KOO T W，et al.Prospects for in vivo Raman spectroscopy［J］.Physics in Medicine and Biology，2000，45(2):R1-R59.

［3］PETRY R，SCHMITT M，POPP J.Raman spectroscopy-A prospective tool in the life sciences［J］.Chemphyschem，2003，4(1):14-30.

［4］ELLIS D I，GOODACRE R.Metabolic fingerprinting in disease diagnosis:biomedical applications of infrared and Raman spectroscopy［J］.Analyst，2006，131(8):875-885.

［5］MOVASAGHI Z，REHMAN S，REHMAN I U.Raman spectroscopy of biological tissues［J］.Applied Spectroscopy Reviews，2007，42(5):493-541.

［6］HAKA A S，SHAFER-PELTIER K E，F(xiàn)ITZMAURICE M，et al.Diagnosing breast cancer by using Raman spectroscopy［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102(35):12371-12376.

［7］STONE N，KENDALL C，SHEPHERD N，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for the classification of epithelial pre-cancers and cancers［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2002，33(7):564-573.

［8］HUANG Z W，MCWILLIAMS A，LUI H，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for optical diagnosis of lung cancer［J］.International Journal of Cancer，2003，107(6):1047-1052.

［9］LIU R M，XIONG Y，TANG W Y，et al.Near-infrared surfaceenhanced Raman spectroscopy(NIR-SERS)studies on oxyheamoglobin(OxyHb)of liver cancer based on PVA-Ag nanofilm［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2013，44(3):362-369.

［10］GNIADECKA M，WULF H C，NIELSEN O F，et al.Distinctive molecular abnormalities in benign and malignant skin lesions:studies by Raman spectroscopy［J］.Photochemistry and Photobiology，1997，66(4):418-423.

［11］INGLE T，DERVISHI E，BIRIS A R，et al.Raman spectroscopy analysis and mapping the biodistribution of inhaled carbon nanotubes in the lungs and blood of mice［J］.Journal of Applied Toxicology，2013，33(10):1044-1052.

［12］BOYD S，BERTINO M F，YE D X，et al.Highly sensitive detection of blood by surface enhanced Raman scattering［J］.Journal of Forensic Sciences，2013，58(3):753-756.

［13］STONE N，KENDALL C，SMITH J，et al.Raman spectroscopy for identification of epithelial cancers［J］.Faraday Discussions，2004，126:141-157.

［14］CASPERS P J，LUCASSEN G W，PUPPELS G J.Combined in vivo confocal Raman spectroscopy and confocal microscopy of human skin［J］.Biophysical Journal，2003，85(1):572-580.

［15］GONZALEZ F J，CASTILLO-MARTINEZ C，MARTINEZ-ESCANAME M，et al.Noninvasive estimation of chronological and photoinduced skin damage using Raman spectroscopy and principal component analysis［J］.Skin Research and Technology，2012，18(4):442-446.

［16］TUCHIN V V.Light scattering study of tissues［J］.Uspekhi Fizicheskikh Nauk，1997，167(5):517-539.

［17］TUCHIN V V，XU X Q，WANG R K.Dynamic optical coherence tomography in studies of optical clearing，sedimentation，and aggregation of immersed blood［J］.Applied Optics，2002，41(1):258-271.

［18］HE Y H，WANG RKK.Dynamic optical clearing effect of tissue impregnated with hyperosmotic agents and studied with optical coherence tomography［J］.Journal of Biomedical Optics，2004，9(1):200-206.

［19］LACOMB R，NADIARNYKH O，CAREY S，et al.Quantitative second harmonic generation imaging and modeling of the optical clearing mechanism in striated muscle and tendon［J］.Journal of Biomedical Optics，2008，13(2):021109.

［20］MATSUI A，LOMNES S J，F(xiàn)RANGIONI J V.Optical clearing of the skin for near-infrared fluorescence image-guided surgery［J］.Journal of Biomedical Optics，2009，14(2):024019.