邱芳萍， 王長周， 季曉楓

（長春工業(yè)大學 化學與生命科學學院，吉林 長春 130012）

林蛙是我國東北地區(qū)集藥、食于一體的珍貴蛙種，養(yǎng)殖量和商品量逐年增加，據(jù)不完全統(tǒng)計，全省年產(chǎn)蛙量在十億余只，蛙油產(chǎn)量200 t左右，蛙油年產(chǎn)值10億元左右，而蛙油僅占整蛙的15%，其它部位（腦、皮、肉和骨）作為廢棄物或飼料，資源浪費，污染嚴重而林蛙皮中含有豐富的蛋白質、氨基酸、膠原蛋白、抗菌肽和透明質酸等生物活性物質，具有重要的應用價值及較大的開發(fā)利用潛力。

作者以長白山林蛙皮為原料，經(jīng)酶解和膜分離手段等一系列工藝過程，建立了酶解最佳工藝的數(shù)學模型，制備出具有特殊分子結構、功能復雜多樣的生物活性物質，對其溴代苯小鼠肝損傷及SOD、GSH-Px活力的影響進行了研究，以此證明：LWT可以作為新型的化妝品及保健品的原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明小鼠：雌性，體重25～30 g，吉林大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK-（吉）2008-0005；LWT：長春工業(yè)大學功能食品與生物技術研究所制備，批號：20101210；血紅蛋白，SOD，MDA，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒：南京建成生物技術公司產(chǎn)品；丙烯酰胺，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產(chǎn)品；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

日普利RPL-D2000 COLUMN HBATER高效液相色譜：山東魯南瑞虹化工儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-8C型電泳儀：北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝 蛙皮→溶脹→酶解→過濾→脫腥→活性炭脫色→膜分離純化→濃縮→冷凍干燥→微黃色粉末狀LWT

1.3.2 水解度的測定 采用游離氨基氮甲醛快速滴定法[2]測定林蛙皮的水解度。

1.3.3 酶解工藝的優(yōu)化 采用數(shù)理統(tǒng)計和數(shù)據(jù)擬合分析方法對LWT酶解過程中的加酶量、酶解溫度、酶解時間、pH、料液質量體積比5因素進行優(yōu)化，建立LWT酶解過程中影響因素與水解度關系的數(shù)學模型。

1.3.4 相對分子質量測定 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳[3]的方法測定LWT的相對分子質量。

1.3.5 純度檢測 高效液相色譜分析條件[4]：紫外-可見光檢測器；色譜柱：C18，250 mm×4.6 mm；流動相：v（乙腈）∶v（水）∶v（三氟乙酸）=20∶80∶0.1；波長：220 nm；流量：1 mL/min；柱溫：30 ℃；質量濃度：1 mg/mL；進樣量：15～30 μL。

1.4 抗氧化活性實驗

取健康雌性昆明小鼠，隨機分為對照組、模型組及LWT低劑量組 （200 mg/kg）、中劑量組（600 mg/kg）、高劑量組（1 800 mg/kg），每組各 15 只。3 個LWT組給予不同劑量連續(xù)等體積灌胃，對照組和模型組動物灌胃給予同等容量的生理鹽水。

末次給藥后，摘眼取血，分別SOD活力和GSH-Px活力[5]，除對照組，其余各組灌胃給0.47 mg/kg溴代苯油，對照組給予色拉油，灌胃量為0.2 mL/20 g。經(jīng)一系列處理后，測定丙二醛質量分數(shù)和SOD活力和GSH-Px活力及勻漿液蛋白質質量分數(shù)。溶血液和肝組織的MDA質量分數(shù)采用硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法[6]測定，血紅蛋白、蛋白質質量分數(shù)、SOD、GSH-Px活力的測定參照試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 最佳酶解條件的確定

采用數(shù)理統(tǒng)計和數(shù)據(jù)擬合分析方法建立酶解工藝優(yōu)化條件的數(shù)學模型，把加酶量作為水解度的重要影響因子，其他酶解條件可以作為次要影響因子。由一元插值可確定pH、酶解溫度、酶解時間3個變量與加酶量均有線性關系，可做如下假設：x為林蛙皮在酶解反應中加酶量的大小，且為水解度的第一影響因子；xi（i=1，2，3）為 x 的影響因子（其中，x1為酶的 pH，x2為酶解溫度，x3為酶解時間）；y 為林蛙皮酶解反應后的水解度，這里其為目標函數(shù)；由實驗數(shù)據(jù)得到如下關系曲線，見圖1～3。

圖1 酶解溫度與加酶量的關系Fig.1 Relations between add enzymequantityand enzymatic hydrolysis temperature

圖2 加酶量與pH的關系Fig.2 Relations between add enzyme quantity and pH

圖3 酶解時間與加酶量的關系Fig.3 Relations between addenzymequantityand enzymatic hydrolysis time

根 據(jù) 上 面 數(shù) 據(jù) 可 知 ：x1=k1x+b1；x2=k2x+b2；x3=k3x+b3；其中 ki=1，2，3，b=1，2，3 為常數(shù)。

由上面的數(shù)據(jù)可確定如下：k1=5，b1=5.5，k2=25，b2=32.5，k3=2.5，b3=1.25。

從上面可得到x1與x之間的關系。

水解度是這里最為重要的指標，y=f（x）是目標函數(shù)。

y受兩個因素的影響，一是加酶量的多少x（它與 xi，i=1，2，3 之間的關系已經(jīng)討論過），二是料液質量體積比。結果見圖4，圖5。

圖4 料液質量體積比與水解度之間的關系Fig.4 Relations between hydrolyzing degree and ratio of solid to liquid

圖5 加酶量與水解度之間的關系Fig.5 Relations between add enzymequantityand hydrolyzing degree

根據(jù)圖4，曲線可由代數(shù)方程表示：令y=axk+b

水解度與酶解溫度、酶解時間、pH值、酶量的大小均有直接的關系，通過實驗給出的數(shù)據(jù)分析，當溫度在50°、酶解時間約3.0、pH值時：

設水解度為 y（%），加酶量為 x（%），利用最小二乘法可得酶量與水解度之間的模型為：

如圖 6（a），（b）所示：

圖6 加酶量與水解度之間的關系模型Fig.6 Relational model between enzyme quantity and hydrolyzing degree

圖6（a）是在加酶量1.5%范圍內的局部情況，圖6（b）較圖6（a）的范圍擴大了到了加酶量為10%的情況，分析上述結果，當加酶量在0.5%時，水解度可達到6.02%，當酶量在0.58%時，水解度可達到6.038%，當加酶量在0.6%時，水解度可達到6.04%，當酶量在1.2%時，水解度可達到6.10%，當酶量在8%時，水解度可達到6.247%。顯然，當酶量x＞0.58時，水解度增加趨于平緩。

綜上分析，確定最佳酶解條件為：加酶量0.55%～0.58%，酶解時間 3.0 h，酶解溫度 50℃，pH 9.0，料液比1 g∶3 mL，經(jīng)試驗驗證，酶解工藝條件與模型條件吻合。

2.2 相對分子質量分布

聚丙烯酰胺凝膠電泳結果見圖7。

圖7 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.7 Polyacrylamide gel electrophoresis figure

電泳結果顯示，該LWT的相對分子質量在3 500以下，兩個不同質量濃度的加樣量基本上在同一相對分子質量水平上。

2.3HPLC圖譜

高效液相色譜圖表明LWT純度較高，結果見圖8。

圖8 LWT高效液相色譜圖Fig.8 HPLC figure of LWT

2.4LWT對小鼠血液中SOD、GSH-Px活力的影響

LWT低、中、高劑量組小鼠血液中SOD與GSH-Px活力與對照組相比較有所提高，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），實驗結果見表 1。

表1 LWT對小鼠血液中SOD、GSH-Px活力的影響Table 1 Influence of LWT on the SOD and GSH-Px vitality in mice blood

2.5 LWT對小鼠肝臟組織中MDA質量分數(shù)及SOD、GSH-Px活力的影響

模型組與對照組比較肝臟組織中MDA質量分數(shù)明顯升高（P＜0.05）。LWT高劑量組小鼠肝組織中MDA質量分數(shù)與模型組相比顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；LWT高劑量組小鼠肝組織中SOD活力與模型組相比較顯著升高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；GSH-Px活力各組之間無顯著性差異 （P＞0.05），實驗結果見表 2。

表2 LWT對小鼠肝臟組織中MDA質量分數(shù)及SOD、GSH-Px活力的影響Table 2 Influence of LWT on the MDA content and the SOD and GSH-Px vitality in liver tissue

3 結語

對長白山林蛙進行了綜合利用研究，運用數(shù)學建模優(yōu)化酶解工藝條件，得到最佳酶解條件為：加酶量0.55%～0.58%，酶解時間3.0 h，酶解溫度50℃，pH 9.0，料液質量體積比 1 g∶3 mL，在此條件下制備出LWT。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜分析方法，證明了該LWT的相對分子質量均在3 500以下，且純度較高。

通過小鼠實驗，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，最后得出結論：LWT具有顯著降低小鼠肝組織中MDA含量和顯著升高小鼠肝組織中SOD活力的作用，LWT的抗氧化動物實驗結果為陽性，具有抗氧化作用。

林蛙由于生長環(huán)境和習性，其安全性、保濕性、抑菌抗菌性，抗氧化、抗衰老等方面都有獨特的天然優(yōu)勢，是適用于新型化妝品基料的綠色材料。該LWT可以作為新型化妝品和保健品的原料，具有較大的開發(fā)潛力和較高的應用價值。

[1]何照范，張迪清.保健食品化學及其檢測技術[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1997.

[2]夏其昌，張祥民，周仲駒，等.蛋白質電泳技術指南[M].北京：化學工業(yè)出版社，2007.

[3]Bunger H，Kaufner L，Pisonu.Quantitative analysis of hydrophobic pulmonary surfactant protein by high-performance liquid chromatography with light-scattering detection[J].J Chromatoger A，2000，870（1-2）：363-369.

[4]VishnuduttP，Bin G，Byoung-Joon S.Molecularmechanisms of al-coholic fatty liver[J].Alcohol Clin Exp Res，2009，33（2）：191-205.

[5]Negre-SalvayreA，CoatrieuxC，Ingueneau C，et al.Advanced lipid peroxidation end products in oxidative damage to proteins：Potential rolein diseases and therapeutic prospects for the inhibitors[J].British Journal of Pharmacology，2008，153（1）：6-20.