謝 輝，邵建明，王冠蕾

(承德石油高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)工程系，河北承德 067000)

花椒(Zanthoxylum BungeanumMaxim)是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylumlinn)植物花椒或青椒的成熟干燥果皮，具有溫中助陽，散寒燥濕，行氣止痛，殺蟲止癢和抗氧調(diào)味的功能，是我國傳統(tǒng)調(diào)味料和中藥［1］。經(jīng)測定花椒含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、脂肪酸及黃酮等化學(xué)成分［2］。

目前對花椒提取物的藥理學(xué)活性研究主要集中在其揮發(fā)油和生物堿等方面，藥理實(shí)驗(yàn)證明花椒揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、殺病菌和防霉菌作用，對農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾、桃蚜和楊毒蛾等亦有防治效果［3－6］;花椒生物堿在抑制血小板凝集、抗瘧疾、鎮(zhèn)痛、止癢和抑制口腔致病菌等方面均顯示了一定生物活性［7］，這些研究暗示著花椒中化學(xué)成分在作為天然藥物、化妝品、食品添加劑和生物農(nóng)藥等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。本文以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉為受試菌株，對花椒總生物堿的抑菌活性進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步明確花椒生物堿的抗菌譜，為花椒在醫(yī)藥、食品防腐上的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉。

1.1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基):馬鈴薯浸出液200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

細(xì)菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH7.2 ～7.5。

1.2 方法

1.2.1 花椒總生物堿的提?。?］

市售花椒粉碎后干燥至恒重，稱取粉末200 g，加入70%乙醇，料液比1∶10，用稀鹽酸調(diào)pH至3，60℃冷凝回流提取3 h。過濾后減壓回收乙醇，水提液用氨水調(diào)pH至9～10，再用氯仿萃取水層至水層對碘化鉍鉀反應(yīng)呈陰性，合并氯仿液，減壓濃縮后常溫晾干得花椒總生物堿1.04 g，用20%甲醇水溶液超聲溶解配制成500 mg/mL的花椒總生物堿溶液，過濾除菌后4℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 濾紙片法測定抑菌圈直徑［9］

將活化培養(yǎng)的不同菌種制成菌懸液，然后加入0.2 mL菌懸液至冷卻的相應(yīng)培養(yǎng)平板中，涂布均勻。將直徑6 mm濾紙片浸入500 mg/mL的花椒總生物堿溶液中稍晾干后放入培養(yǎng)皿，對照為浸入20%甲醇水溶液的濾紙片，使濾紙片與培養(yǎng)基完全接觸。供試菌種平行接種3個(gè)培養(yǎng)平板。所有平板置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h，霉菌于28℃培養(yǎng)48 h，酵母于30℃培養(yǎng)24 h，取出觀察，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑(含濾紙片直徑)，求平均值。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定［10］

采用試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度，取若干滅菌試管，以適合菌種生長的液體培養(yǎng)基將花椒總生物堿溶液進(jìn)行一系列對倍稀釋，濃度分別為 250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95 mg/mL，同時(shí)設(shè)空白對照和甲醇溶液對照。加入相應(yīng)供試菌懸液0.05 mL至各試管。所有試管置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24 h，霉菌于28℃培養(yǎng)48 h，酵母于30℃培養(yǎng)24 h，取出觀察判定結(jié)果，以含藥量低且肉眼觀察無可見菌生長的試管含藥量為藥物對該菌的MIC。

1.2.4 熱處理對花椒總生物堿抑菌活性的影響［9］

以大腸桿菌為指示菌，將500 mg/mL花椒總生物堿分別置40，60，80，100℃水浴和121℃濕熱條件下，熱處理30 min，對照置于25℃，用濾紙片法來測定其抑菌圈直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 花椒總生物堿的抗菌譜

花椒總生物堿對供試菌種的抑制作用測定結(jié)果如表1所示，從表1中可以看出，花椒總生物堿對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉均具有一定的抑制效果;對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)，對釀酒酵母和黑曲霉的抑制作用稍弱。

表1 花椒總生物堿的抑菌直徑

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定

花椒總生物堿對五種供試菌種的最小抑菌濃度測定結(jié)果如表2所示，從表2中可以看出，花椒總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.91 mg/mL，對枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度為7.81 mg/mL，對黑曲霉的最小抑菌濃度為15.63 mg/mL，對釀酒酵母的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL，這表明花椒總生物堿對細(xì)菌的抑制作用較強(qiáng)，對酵母的抑制效果相對較弱。

表2 花椒總生物堿對供試菌的最小抑菌濃度測定

2.3 熱處理對花椒生物堿抑菌活性的影響

以大腸桿菌為指示菌，測定不同溫度處理后花椒總生物堿的抑菌活性變化如圖1所示，由圖可知，花椒總生物堿經(jīng)過不同溫度處理后，其對大腸桿菌的抑菌圈直徑變化不大，經(jīng)過121℃濕熱處理后仍具有較高的抑菌活性，這表明花椒總生物堿的抑菌活性基本不受溫度的影響。

3 結(jié)論

借助濾紙片法，以抑菌圈直徑大小為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對花椒總生物堿的抑菌作用進(jìn)行分析，結(jié)果顯示花椒總生物堿對細(xì)菌，釀酒酵母和黑曲霉具有抑菌作用，表明花椒總生物堿的抗菌譜較寬，花椒總生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.91 mg/mL，對枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度為7.81 mg/mL，對黑曲霉的最小抑菌濃度為15.63 mg/mL，對釀酒酵母的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明花椒總生物堿的抑菌活性基本不受溫度的影響。

［1］ 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第四十三卷第二分冊［M］.北京:科學(xué)出版社，1997.

［2］ 畢君，曹福亮.花椒屬植物化學(xué)有效成分與開發(fā)利用研究進(jìn)展［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2008，22(3):9－13.

［3］ 崔俊，李孟樓.花椒開發(fā)利用研究進(jìn)展［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2008，22(2):9－14.

［4］ 干信，吳士筠，高雯琪.花椒揮發(fā)油抑菌作用研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(21):128－130.

［5］ 趙媛.青花椒提取物對桃蚜和小菜蛾的生物活性研究［D］.石家莊:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［6］ 弭向輝.花椒揮發(fā)油的提取分離及其抗菌和抗腫瘤作用研究［D］.南京:南京師范大學(xué)，2004.

［7］ 石雪萍，關(guān)榮琴，張鳴鏑，等.花椒屬植物生物堿研究進(jìn)展［J］.中國野生植物資源，2010，29(4):1－7.

［8］ 貝玉祥，董秀華，李干鵬，等.紫堇中總生物堿體外清除活性氧自由基及抗氧化作用研究［J］.食品科技，2008(4):189－191.

［9］ 江潔芳.花椒中抑菌活性成分提取工藝的研究［J］.中國調(diào)味品，2011，36(3):30－32.

［10］ 趙東亮，郁建平，周曉秋，等.博落回生物堿的抑菌作用研究［J］.食品科學(xué)2005，26(2):45－47.