劉純新，于麗娜，楊力，聶晶磊，陳琳，殷雅丹

中國環(huán)境科學研究院，環(huán)境保護部化學品登記中心，北京 100012

化學品快速生物降解性經(jīng)典測試方法的要點比對

劉純新，于麗娜，楊力*，聶晶磊，陳琳，殷雅丹

中國環(huán)境科學研究院，環(huán)境保護部化學品登記中心，北京 100012

通過分析六種經(jīng)典快速生物降解性測試方法的試驗原理、操作特點以及限制因素，指出最好根據(jù)受試物對活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值，選擇試驗方法、受試物濃度和接種物濃度。比對了各方法在受試物適用濃度范圍、接種物來源和前處理、無機培養(yǎng)基的配制和預處理、質(zhì)量控制等方面的要求，指出快速生物降解性測試嚴禁接種物在接種前接觸受試物；接種微生物的來源可能對試驗結(jié)果影響很大；各方法需要的接種物濃度不同，建議采用平板計數(shù)方法確定并調(diào)整細菌數(shù)；對接種物和培養(yǎng)基進行有效的預處理，可減少空白值。應注意防止濾膜過濾和離心過程產(chǎn)生的有機碳干擾DOC的分析。列舉了測試過程中常見的問題，強調(diào)應根據(jù)降解曲線分析試驗結(jié)果；盡快研發(fā)跨區(qū)域、多來源的標準接種物。

化學品；快速生物降解性；測試方法；操作要點；比對

化學品快速生物降解性是受試物(有機物)在限定時間內(nèi)與接種微生物接觸，表現(xiàn)出的生物降解能力[1]，是鑒別化學物質(zhì)的環(huán)境危害性和持久性，進行分類和標簽[2]，評價和控制環(huán)境風險[3]的基本指標。若通過標準方法得到的測試結(jié)果表明該受試物在環(huán)境中可被迅速地生物降解，則列為“易生物降解”類物質(zhì)[1]。國際上普遍采用經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)的六種經(jīng)典快速生物降解性測試方法[4]，分別為：溶解性有機碳(DOC)消減試驗(301A)，二氧化碳(CO2)產(chǎn)生試驗(301B)，改進的MITI試驗(I)(301C)，密閉瓶試驗(301D)，改進的OECD篩選試驗(301E)和呼吸計量法試驗(301F)。歐盟在2008年實施的《關(guān)于化學品注冊、評估、許可與限制(REACH)法規(guī)》和EC 4402008法規(guī)[5]將這六種經(jīng)典方法寫入技術(shù)法規(guī)(相當于我國的強制性國家標準)的C.4部分，要求進口到歐盟成員國的化學品提交這些測試數(shù)據(jù)。

我國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局和國家標準化管理委員會于2008年分別將OECD的六種經(jīng)典方法等同轉(zhuǎn)化為六項國家標準[8-13]，概述各方法技術(shù)要點的GBT 27850—2011《化學品 快速生物降解性 通則》于2012年8月1日實施[14]。OECD于2006年在“301B：二氧化碳(CO2)產(chǎn)生試驗”基礎(chǔ)上推出的新方法“310：密閉瓶二氧化碳(頂空試驗)法”[15]，目前尚未轉(zhuǎn)化為我國標準。

2011年12月1日實施的《危險化學品安全管理條例》[16]規(guī)定，環(huán)境保護主管部門負責組織化學品的環(huán)境危害性鑒定和環(huán)境風險程度評估。2011年10月《國務院關(guān)于加強環(huán)境保護重點工作的意見》(國發(fā)〔2011〕35號)要求把環(huán)境風險評估作為危險化學品項目評估的重要內(nèi)容[17]。作為履行上述職責的基礎(chǔ)，快速生物降解性數(shù)據(jù)的科學性、可靠性更加受到各方面的關(guān)注。但由于種種原因，目前一些測試機構(gòu)出具的快速生物降解性測試數(shù)據(jù)質(zhì)量不高，影響了鑒定和評估結(jié)果的科學性。

針對常見的問題，結(jié)合制訂測試方法標準，對OECD的六種經(jīng)典測試方法的技術(shù)要點進行比對研究。其中，儀器設(shè)備、試驗用水、受試物前處理、取樣等操作要點參見文獻[18]。筆者重點討論六種經(jīng)典方法的受試物濃度范圍、接種微生物的選擇、培養(yǎng)基成分等操作要求和注意事項，以期引起同行的關(guān)注。

1 對受試物濃度范圍的要求

六種經(jīng)典測試方法由于原理和所用儀器設(shè)備的不同，對受試物濃度的限制因素多，要求也不同(表1)。

表1 六種快速生物降解性測試方法的受試物濃度

1)理論上受試物濃度為2～10 mgL，但對于大多數(shù)受試物，當濃度超過5 mgL時，瓶中溶解氧不能滿足降解需要；2)對ThOD值低的物質(zhì)。

301A和301E兩種方法只能測試易溶于水、難揮發(fā)、不易吸附的物質(zhì)。反應容器用鋁箔封口，內(nèi)外空氣可以自由交換，通過在恒溫振蕩器上振蕩維持試驗溶液中的溶解氧[18]。受復氧速率和DOC分析精度等因素限制，反應容器中受試物的DOC濃度應控制在10～40 mgL[8,12,19]。

301B用脫CO2的空氣曝氣，復氧速率和溶解氧濃度可以得到保證。該方法用Ba(OH)2或NaOH溶液吸收生化反應產(chǎn)生的CO2，通過滴定剩余堿液或測定無機碳計算CO2的濃度，進而計算受試物的降解率。如果反應容器中有機碳濃度過低，將影響測試精度；如果有機碳濃度過高，將增加CO2吸收瓶的數(shù)量，以及Ba(OH)2或NaOH的用量。因此，該方法反應容器中受試物的有機碳濃度(DOC或總有機碳TOC，難溶物質(zhì)以懸浮液計)應控制在10～20 mgL。對于難溶物質(zhì)，試驗過程中通過磁力攪拌保持懸浮狀態(tài)[9]。

經(jīng)典的301C采用專用的MITI測定儀，配備六個燒瓶在密閉條件下進行磁力攪拌，通過電解瓶電解CuSO4溶液產(chǎn)生的氧氣補充消耗的溶解氧。該方法可測試難溶于水、易吸附及易揮發(fā)的化學物質(zhì)；但對于易揮發(fā)性物質(zhì)，應注意盡量減小試驗燒瓶上部氣體空間的體積；因采用電解法連續(xù)供氧系統(tǒng)，因此該方法基本不受溶解氧變化的限制?？蛇x擇較高的受試物濃度，一般地，受試物濃度設(shè)定為100 mgL(難溶物質(zhì)以懸浮液計)[10]。

301D以BOD瓶作為反應容器，瓶中充滿試驗液體后密閉，無外界供氧。受瓶中液體溶解氧的總量限制，且為保證溶解氧測定精度，應始終保持DO濃度≥0.5 mgL，受試物濃度一般控制在2～5 mgL，對于不易降解或理論需氧量(ThOD)低的物質(zhì)，可提高到5～10 mgL。對于缺乏毒性信息，且未預先測試活性污泥呼吸抑制作用[20-21]的受試物，為得到可靠的測試結(jié)果，最好選擇2和5 mgL兩個受試物濃度同時進行試驗。只要其中一個濃度的試驗在10 d觀察期或14 d達到通過水平，即可認為該受試物具有快速生物降解性。對于含氮的受試物，需校正硝化作用的影響[11,18]。

301F與301C原理相似，都是受試物在密閉條件下進行磁力攪拌，用CO2吸收劑吸收產(chǎn)生的CO2。二者不同之處在于，301F根據(jù)所使用呼吸計的廠家、型號的不同，可測量電解產(chǎn)生的氧氣量，也可測量容器內(nèi)氣體壓力的變化；能連續(xù)測量并記錄，也能定期、間歇測定。因此301F受試物濃度(難溶物質(zhì)以懸浮液計)與301C相似，一般為100 mgL，但ThOD要保持在50～100 mgL[13]。如果使用無供氧裝置的BOD測定儀(WTW Oxitop 110C或Lovibond ET99724A系列)作為呼吸計，要特別注意試驗液體體積、預留頂空氧氣的量，在保證溶解氧濃度的前提下，計算受試物濃度。對于含氮的受試物，計算ThOD時需校正硝化作用的影響。

2 各測試方法對接種物來源的要求

2.1 301A、301B和301F接種物的來源

301A、301B和301F方法原則上都可采用多種來源的接種微生物：活性污泥、污水處理廠出水、地表水、土壤，或以上幾種的混合物。建議采用平板計數(shù)等方法，對采集的地表水進行菌落計數(shù)，確保接種后的試驗培養(yǎng)基中細菌數(shù)為107～108個L[8-9,13,19]。

2.1.1 活性污泥接種物

選擇以處理生活污水為主、正常運轉(zhuǎn)的普通活性污泥法的城市污水處理廠或中試規(guī)模的處理設(shè)施，從曝氣池中取新鮮的活性污泥樣品[19]作為接種物。

2.1.2 其他來源的接種物

可選擇以處理生活污水為主的污水處理廠或中試規(guī)模的處理設(shè)施，從二沉池中取未經(jīng)滅菌處理的二級出水作為接種物。

也可采集河水、湖水等地表水樣品作為接種物。若菌落計數(shù)達不到要求，可采用過濾或離心等方式進行濃縮。

由于不同來源的接種物中微生物種類存在差異，對于某些受試物，得出的快速生物降解性測試結(jié)果差異較大。鑒于處理生活污水的污水處理廠的活性污泥中微生物種類豐富，且采用活性污泥得出的測試結(jié)果更適用于評價該受試物排放后對水環(huán)境的影響，因此，301A、301B和301F首選活性污泥作為接種物。

2.2 301C接種物的來源

301C最大的特點是采用標準化的復合接種物。經(jīng)典的301C由日本通產(chǎn)省[19]提出，采用日本化學物質(zhì)測試中心提供的標準接種物。該標準接種物是每個季度在日本十個場所(兩個內(nèi)海、一個湖泊、一個化工廢水處理廠以及分別位于日本南部、中部、北部的三個城市污水處理廠和三條河流)采集地表水、土壤和活性污泥，混合、培養(yǎng)而成[19,22-23]。該標準接種物中的微生物種類多，活性相對穩(wěn)定，適應范圍廣，能夠代表日本各區(qū)域的微生物特性，日本的測試機構(gòu)大多采用301C和標準接種物測試化學品的快速生物降解性。我國相關(guān)單位相應開展了一些研究，但目前尚未推出標準的接種物；采用301C的實驗室往往在所在城市選10個地點，采集微生物作為接種物。

2.3 301D接種物的來源

301D由于BOD瓶內(nèi)外沒有氣體交換，受BOD瓶中液體溶解氧的總量限制，要求細菌數(shù)為104～106個L，只能接種采自生活污水處理廠未經(jīng)滅菌處理的二級出水或地表水，首選二級出水[11]。如果加入細菌濃度過高的污水，或直接用活性污泥接種，由于內(nèi)源呼吸耗氧量大，測試過程中空白對照組的溶解氧濃度下降超過1.5 mgL，或試驗組瓶中溶解氧濃度低于0.5 mgL，會掩蓋受試物的降解情況或影響受試物的降解反應，導致試驗失敗。

2.4 301E接種物的來源

301E要求選擇以處理生活污水為主的污水處理廠或中試規(guī)模的處理設(shè)施，從二沉池中取未經(jīng)滅菌處理的二級出水進行菌落計數(shù)，確保接種后的每L試驗培養(yǎng)基中細菌的數(shù)量級為105[12]。

不同地區(qū)的城市污水處理廠，微生物相會存在差異。同一城市處于不同運行狀態(tài)的污水處理廠，微生物相的差異也很大。若采用主要處理工業(yè)廢水的污水處理廠的活性污泥作為接種物，得出的降解率可能會偏低。采集接種物之前，應詳細調(diào)查備選污水處理廠運行是否穩(wěn)定，及其所處理的生活污水、工業(yè)廢水的成分和所占比例。

各測試方法接種微生物的來源和接種物濃度如表2所示。

表2 各測試方法接種微生物的來源和接種物濃度

1)SS為懸浮固體；2)以每個季度在日本10個場所收集的地表水、土壤和活性污泥，混合、培養(yǎng)1～3個月而成。

3 接種物前處理

所有快速生物降解性測試方法的接種物都不對受試物進行馴化。在正式試驗的接種前，嚴格避免接種物與受試物接觸[19]。

3.1 301A、301B和301F接種物的前處理

3.1.1 活性污泥接種物

從曝氣池中取新鮮的活性污泥樣品后，在運輸和處理過程中應一直曝氣，保持有氧狀態(tài)。用細篩濾除粗糙顆粒后，沉淀或離心分離(一般以相當于104ms2或1 100g的轉(zhuǎn)速，離心10 min)，將浮在表面的雜質(zhì)除去。用試驗培養(yǎng)基清洗(將活性污泥與試驗培養(yǎng)基充分混合后，沉淀或離心分離，去掉懸浮物和上層液體；用過量的試驗培養(yǎng)基懸浮洗過的活性污泥，再沉淀或離心；重復這一操作直到洗凈、不含抑制細菌的物質(zhì)為止)，使活性污泥在試驗培養(yǎng)基中濃度為3～5 gL，曝氣培養(yǎng)直至使用。

也可用勻漿器以中等速度將活性污泥攪拌2 min，使其分散均勻(SS濃度為3～5 gL)，沉淀30 min，用試驗培養(yǎng)基清洗[8]。

為減少試驗的空白值，提高試驗精度，一般活性污泥應在試驗溫度下〔(22±2) ℃〕，在試驗培養(yǎng)基(無受試物)中曝氣培養(yǎng)5～7 d。試驗前應從懸浮污泥中抽取一份樣品，測定活性污泥的干重。

如果活性污泥不是取自普通活性污泥法的污水處理廠，而是取自其他工藝的高效污水處理廠，或估計含有抑制細菌的物質(zhì)，應在去除懸浮物后，用試驗培養(yǎng)基仔細清洗活性污泥，直到不含多余的有機物或抑制性物質(zhì)[19]。

3.1.2 其他來源的接種物

如果采集未滅菌的二級出水，在運輸中應保持有氧狀態(tài)。樣品沉淀1 h或用粗濾紙過濾后，保持上清液或濾出液在有氧狀態(tài)直至使用。

如果采集地表水樣品(如河水、湖水)，去除懸浮物和沉淀物后，保持有氧狀態(tài)直至使用。

3.2 301B接種物的前處理

301B的接種物，除了按3.1節(jié)操作外，還應在試驗開始前，在試驗容器中加入接種物和培養(yǎng)基后，用脫CO2的空氣長時間曝氣，除去其中溶解的CO2后，再加入受試物或參比物。

3.3 301C接種物的前處理

我國目前尚無符合301C要求的標準接種物，不同測試機構(gòu)往往自行選點采集活性污泥等作為接種物。因此，應按301C對接種物培養(yǎng)和前處理、試驗溫度〔(25±1) ℃〕、pH、營養(yǎng)成分、曝氣間隔的具體要求操作[10,22-23]。

3.4 301D和301E接種物的前處理

301D和301E，采集污水處理廠未經(jīng)滅菌處理的二級出水，并在運輸中保持有氧狀態(tài)。用粗濾紙過濾除去懸浮物后，濾出液在試驗溫度下曝氣5～7 d。

4 各測試方法培養(yǎng)基的配制和處理的要求

4.1 培養(yǎng)基的配制

4.1.1 無機營養(yǎng)鹽貯備液

先按配方要求配制無機營養(yǎng)鹽貯備液，再通過稀釋制備試驗培養(yǎng)基。同一試驗所用培養(yǎng)基應為同一批配制。試驗前，先用分析純試劑制備四種貯備液，包括：1)由磷酸鉀鹽和鈉鹽與NH4Cl配制的緩沖溶液(a)；2)CaCl2溶液；3)MgSO4溶液；4)FeCl3溶液。為便于保存FeCl3貯備液，可向每升貯備液加入0.4 g的EDTA，或加入1滴(0.05 mL)濃鹽酸。如貯備液中出現(xiàn)沉淀則不能使用。

301A、301B、301D、301E和301F五種方法要求試驗的pH維持為7.4±0.2，緩沖溶液(a)的pH為7.4，采用的鈉鹽為二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)。301C最適pH為7.0，緩沖溶液(a)的pH為7.2，采用的鈉鹽為十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)[19]；NH4Cl的配比也與另外五個方法不同。

4.1.2 試驗培養(yǎng)基

在試驗開始時，用貯備液和蒸餾水制備試驗培養(yǎng)基。雖然301A、301B、301D、301E和301F的貯備液相同，但由于301D的接種微生物濃度低，試驗培養(yǎng)基中N、P、K、Na等四種無機營養(yǎng)元素濃度只相當于301A、301B、301E和301F等四種方法的110。因此在配制301D的試驗培養(yǎng)基時，要特別注意緩沖溶液(a)的添加量，即按每L試驗培養(yǎng)基加入1 mL緩沖溶液(a)的比例配制[11]；而配制301A等四個方法的試驗培養(yǎng)基時，相應的緩沖溶液(a)的量為10 mL。

301E中，要求按每L試驗培養(yǎng)基加入污水處理廠二級出水的濾出液0.5 mL的比例接種，接種微生物少，接種帶入的微量元素和生長因子少，因此該試驗培養(yǎng)基需另外補充Mn、B、Mo、Zn等微量元素和酵母浸膏溶液[12]。

301C試驗的最佳pH與其他方法不同，不但緩沖溶液的成分配比不同，而且要求在配制試驗培養(yǎng)基時，按每L試驗培養(yǎng)基分別加入四種貯備液各3 mL的比例操作[10]。

六種快速生物降解性測試方法試驗培養(yǎng)基成分和濃度如表3所示。

表3 六種快速生物降解性測試方法試驗培養(yǎng)基成分和濃度

1)301E方法每L培養(yǎng)基中加微量元素溶液和維生素溶液各1 mL。

4.2 試驗培養(yǎng)基的前處理

正式試驗前，有些方法需要進行前處理。301B要求用脫CO2的空氣或人工配制的標準氣(氧氣與氮氣體積比為20∶80)對試驗培養(yǎng)基曝氣[9]，驅(qū)除溶解的CO2(注意在試驗過程中，如果用工業(yè)純氧代替脫CO2的空氣，或代替配制的標準氣曝氣，雖然可以簡化操作，但由于在純氧曝氣條件下，培養(yǎng)基中溶解氧濃度會顯著提高，微生物的代謝狀態(tài)與在空氣曝氣條件下不同[24]，將影響測試結(jié)果的可比性)。

301D要求在試驗溫度〔(22±2)℃〕下對試驗培養(yǎng)基高強度曝氣20 min以上，使溶解氧飽和，然后靜置20 h達到穩(wěn)定狀態(tài)后，測定溶解氧濃度[11]。用虹吸管移液和裝瓶時應保持試驗培養(yǎng)基處于溶解氧飽和且無氣泡釋放的狀態(tài)。

5 判定試驗有效的條件

如果這六種經(jīng)典方法的試驗結(jié)果在穩(wěn)定期、10 d觀察期或28 d試驗結(jié)束時，各平行組間受試物去除量的最大差別小于20％；并且參比物在14 d的降解率達到通過水平，才能認為有效。只要上述任一條件未滿足，試驗應重做[14]。

嚴格地講，不能僅憑受試物降解率數(shù)值低，就斷定受試物在環(huán)境中不能被生物降解，而是需要通過測試其固有生物降解性[22,25-26]或模擬環(huán)境降解試驗[27-30]來進一步確定其生物降解性。

5.1 301A和301E的有效性

301A和301E試驗中，若含有受試物和參比物的毒性對照組在14 d內(nèi)DOC的去除率小于35％，可認為受試物對細菌有抑制性。應適當降低受試物濃度(不能低于檢出限，不能影響DOC測定的精確性)，重新試驗。

對于301A，還可提高接種物濃度(SS濃度應小于30 mgL)，重新試驗。

5.2 301B的有效性

試驗開始時，試驗容器中受試物懸浮液的無機碳(IC)濃度必須少于總碳(TC)濃度的5％；試驗結(jié)束時，接種物空白組中，每L培養(yǎng)基產(chǎn)生的CO2總量通常不超過40 mg，如果超過70 mg，應認真檢查接種物的內(nèi)源呼吸情況、是否帶入多余的有機物、反應容器的氣密性、脫CO2曝氣系統(tǒng)、試驗操作的全過程以及全部數(shù)據(jù)。

如果含有受試物和參比物的毒性對照組在14 d內(nèi)CO2的產(chǎn)生量少于ThCO2的25％，可認為受試物對細菌有抑制性?？蛇m當降低受試物濃度和或提高接種物濃度(SS濃度應小于30 mgL)，重新試驗。

5.3 301C和301F的有效性

如果反應容器中的pH低于6.0或高于8.5，并且受試物氧消耗量少于ThOD的60％，應適當降低受試物濃度，重新試驗。

以苯胺為參比物的程序?qū)φ战M在7和14 d后，用氧消耗量計算出的苯胺降解率應分別超過40％和65％。否則，應重新試驗。

5.4 301D的有效性

28 d試驗結(jié)束時，接種物空白組的溶解氧與試驗開始時相比，損耗不應超過1.5 mgL。若超過該值，需要檢查各容器、導管和試驗瓶的清洗、培養(yǎng)基的配制和曝氣、接種物的細菌數(shù)、試驗操作是否帶入還原性物質(zhì)等。

在試驗過程中，試驗瓶中溶解氧的殘余濃度始終應不低于0.5 mgL。如果溶解氧濃度過低，溶解氧測定精度降低，而且好氧微生物的活動將受到抑制，影響測試結(jié)果。

如果含有受試物和參比物的毒性對照組在14 d內(nèi)生物降解耗氧量達不到ThOD的25％，可認為受試物對細菌有抑制性。應適當降低受試物濃度，重做試驗。

6 常見問題及處理措施

6.1 概念和思路不清楚，試驗方案設(shè)計不當

化學品快速生物降解性測試(特別是301C、301D、301F)與廢水生化需氧量(BOD)測試有相似之處，但在測試目的、原理、周期、操作等方面差別很大。如果301C和301F使用自動BOD測定儀(如WTW OxiTop 110C、Lovibond ET99724A系列)作為呼吸測定儀，照搬測定BOD(2 d+5 d)的做法，加烯丙基硫脲(allylthiourea)抑制硝化作用[31-32]，且不核算受試物的ThOD、頂空氧氣量，容易導致試驗失敗。應注意，每一種化學品的降解性測試都相當于一項研究課題，要根據(jù)受試物的物理、化學、毒理等方面的性質(zhì)，對試驗方案和操作及時進行調(diào)整。

6.2 缺少或不會運用毒性信息，受試物試驗濃度設(shè)置不當

多數(shù)情況下，測試機構(gòu)缺少或不知如何運用受試物對微生物的毒性信息。若受試物的試驗濃度偏高，使細菌活性受到抑制，導致降解率偏低。該類受試物容易被誤判為難生物降解物質(zhì)。要避免該類問題，在測試快速生物降解性之前，最好測試該物質(zhì)對活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值。將快速生物降解性測試的受試物濃度設(shè)置為EC50的110(或低于EC20)[20-21]。當EC50lt;20 mgL時，為避免影響后續(xù)試驗，最好同時以2個較低的受試物濃度進行301D試驗，并設(shè)置毒性對照組。

6.3 缺乏環(huán)境微生物方面的背景信息，接種微生物來源選擇不當

若為方便，就近取地表水作為接種物，未判斷其中微生物濃度和活性即進行試驗，往往重現(xiàn)性不好，有時為陽性而有時為陰性。某些城市污水處理廠工業(yè)廢水比例過高，活性污泥或二級出水中細菌種類較少；或者某些污水處理廠運行不穩(wěn)定，細菌的活性不夠，都會影響試驗結(jié)果。對此，在選擇接種物前，要周密調(diào)查備選污水處理廠的污水來源、主要工藝、運行狀況等，最好選擇運行穩(wěn)定，主要處理生活污水、普通活性污泥法的污水處理廠的活性污泥或二級出水作接種物。

6.4 不熟悉測試方法的要領(lǐng)，接種物濃度控制不當

若不了解所選測試方法的原理、供氧方式和復氧速率，未控制接種物中細菌濃度，接種物濃度過高將使試驗溶液中缺氧，達不到質(zhì)控條件(301D尤其突出)。若接種物濃度過低，由于細菌種類、數(shù)量少，可能導致停滯期延長，降解率偏低。301A和301E未要求測溶解氧；實際操作中，靠燒瓶振蕩復氧，對試驗結(jié)果有效性的影響容易被忽視。要解決該類問題，掌握各方法、各步操作所涉及的背景知識是非常必要的；同時通過實際測定以控制接種物中的細菌濃度。

6.5 培養(yǎng)基前處理不當

實際測試中，配制試驗培養(yǎng)基后，容易忽視前處理的一些細節(jié)。若301B中脫CO2的曝氣系統(tǒng)氣密性不好，或曝氣不徹底，不能有效驅(qū)除培養(yǎng)基中溶解的CO2，空白值將偏高。要避免該類問題，應注意檢查供氣和培養(yǎng)基中是否殘余CO2。

若301D曝氣系統(tǒng)給試驗培養(yǎng)基帶入油滴等雜質(zhì)，會使試驗瓶中溶解氧消耗過快，甚至導致試驗失敗。要避免該類問題，應慎重選用空壓機和曝氣管，通過過濾等方式，確保供氣的清潔。

6.6 取樣預處理不當

對于301A和301E等用有機碳分析儀測定DOC的方法，如果取樣后用0.45 μm濾膜過濾，一方面，濾膜表面涂層的親水性物質(zhì)可能進入濾出液；另一方面，有些受試物可能與過濾器、濾膜發(fā)生作用，引起偏差。要減少該類偏差，每次試驗前，將過濾器、濾膜放入去離子水中煮沸三次，每次煮1 h，去除涂層物質(zhì)和溶解性有機物。還可采取預飽和等措施，確保過濾器、濾膜不釋放出溶解性有機碳、不吸附受試物。

6.7 結(jié)果判斷不當

試驗結(jié)束，在判斷受試物是否具有快速生物降解性時，往往關(guān)注28 d的降解率，而忽視降解曲線；甚至在試驗前未考慮為繪制降解曲線預留足夠的取樣點(如每7 d取一次樣，對于很多受試物無法繪制出完整的降解曲線，得不出降解趨勢)。要解決該類問題，在設(shè)計試驗方案、分析試驗結(jié)果、判斷受試物的降解性時，應考慮整個降解曲線，明確其停滯期、對數(shù)增長期和平穩(wěn)期?？焖偕锝到庑缘牧N經(jīng)典方法規(guī)定試驗周期為28 d，以使接種微生物有足夠的時間去適應受試物，避免因周期短而錯過對一些受試物降解情況的觀察，同時確保得到完整的降解曲線。當降解率達到10％(或CO2的產(chǎn)生量達到ThCO2的10％)，表明生物降解已經(jīng)開始，只有在隨后的10 d內(nèi)(301C除外，如果采用14 d觀察期，以試驗的第14天計)達到通過水平才表明其具有快速生物降解性。如果受試物在經(jīng)過較短的停滯期后緩慢降解，未在10 d觀察期內(nèi)達到通過水平，則不認為其具有快速生物降解性。

7 結(jié)論和建議

(1)根據(jù)各方法的原理、設(shè)備、供氧、操作特點，確定最佳的試驗方案和受試物濃度。

(2)化學品對微生物的毒性和抑制作用，會導致試驗結(jié)果的誤判。對于缺少該類信息的受試物，最好先測定其對活性污泥呼吸抑制的EC50和EC20值，再選擇試驗方法和接種物濃度。

(3)接種微生物的來源對試驗結(jié)果影響很大。301A、301B、301F三種方法最好選擇運行良好、主要處理生活污水、普通活性污泥法的污水處理廠或中試裝置的活性污泥；301D和301E兩種方法最好選擇運行良好的生活污水處理廠的二級出水；301C采用多來源、混合培養(yǎng)的微生物作為接種物。為提高試驗的可比性和復現(xiàn)性，我國應盡快研究推出標準接種物。

(4)所有快速生物降解性測試的接種物都不對受試物進行馴化，嚴格避免接種物在接種前與受試物接觸。在試驗前，對接種物和培養(yǎng)基進行前處理，充分減少空白值。

(5)接種物濃度過高、過低，都會影響試驗結(jié)果。各方法需要的接種物濃度不同，最好采用平板計數(shù)等方法確定細菌數(shù)，并調(diào)整接種微生物濃度。

(6)對于301A和301E等需要測定DOC濃度的方法，取樣后的預處理，不論采用濾膜過濾還是高速離心，都要注意防止溶出的有機碳對DOC濃度分析的干擾。

(7)應重視降解曲線，在設(shè)計試驗方案時預留足夠的取樣點。在分析試驗結(jié)果、判斷受試物的降解性時，應考慮其整個降解曲線，明確其停滯期、對數(shù)增長期和平穩(wěn)期。

[1]國家環(huán)境保護總局.化學品測試方法[M].北京:中國環(huán)境科學出版社,2004.

[2]United Nations.Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals(GHS)[M].3rd ed.New York:United Nations Publication,2009:215-240.

[3]van LEEUWEN C J,VERMERIRE T G.Risk assessment of chemicals an introduction[M].2nd ed.Dordrecht:Springer,2007: 73-409.

[4]Organization for Economic Co-operation and Development.OECDguideline for testing of chemicals[M].Paris:OECD Publications,1993.

[5]The Commission of The European Communities.Council Regulation (EC) No.4402008[EBOL].(2008-05-30)[2012-05-18].http:eur-lex.europa.euLexUriServLexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:142:0001:0739:en:PDF.

[7]環(huán)境保護部.新化學物質(zhì)申報登記指南[EBOL].(2010-09-16)[2012-05-18].http:www.mep.gov.cnpv_obj_cachepv_obj_id_A307C2706731EC4386428C731D210489261E0900filenameW020100921500388885939.pdf.

[8]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21803—2008 化學品 快速生物降解性 DOC消減試驗[S].北京:中國標準出版社,2008.

[9]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21856—2008 化學品 快速生物降解性 二氧化碳產(chǎn)生試驗[S].北京:中國標準出版社,2008.

[10]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21802—2008 化學品 快速生物降解性 改進的MITI試驗(Ⅰ)[S].北京:中國標準出版社,2008.

[11]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21831—2008 化學品 快速生物降解性 密閉瓶法試驗[S].北京:中國標準出版社,2008.

[12]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21857—2008 化學品 快速生物降解性 改進的OECD篩選試驗[S].北京:中國標準出版社,2008.

[13]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21801—2008 化學品 快速生物降解性 呼吸計量法試驗[S].北京:中國標準出版社,2008.

[14]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 27850—2011 化學品 快速生物降解性 通則[S].北京:中國標準出版社,2012.

[15]Organization of Economic Cooperation and Development.Test No.310:ready biodegradability:CO2in sealed vessels(headspace test)[EBOL].(2006-03-23)[2012-05-18].http:titania.sourceoecd.orgvl=8728439cl=14nw=1rpsvcgi-binfulltextew.pl?prpsv=ijoecdjournals1607310xv1n3s13p1. idx.

[16]中華人民共和國國務院.危險化學品安全管理條例[EBOL].(2011-03-02)[2012-05-18].http:www.gov.cnflfg2011-0311content_1822902.htm.

[17]中華人民共和國國務院.國務院關(guān)于加強環(huán)境保護重點工作的意見(國發(fā)〔2011〕35號)[EBOL].(2011-10-17)[2012-05-18].http:www.gov.cnzwgk2011-1020content_1974306. htm.

[18]劉純新,沈英娃,黃星,等.化學品快速生物降解性六種經(jīng)典測試方法的技術(shù)要點比對[J].環(huán)境工程技術(shù)學報,2012,2(1):1-6.

[19]OECD.Test No.301:ready biodegradability[EBOL].(1992-07-17)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-301-ready-biodegradability_9789264070349-en;jsessionid=1816fjr8gttv3.delta.

[20]OECD.Test No.209:activated sludge,respiration inhibition test[EBOL].(2010-07-23)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-209-activated-sludge-respiration-inhibition-test_9789264070080-en.

[21]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21796—2008 化學品 活性污泥呼吸抑制試驗[S].北京:中國標準出版社,2008.

[22]OECD.Test No.302C:inherent biodegradability:modified MITI test(Ⅱ)[EBOL].(1981-05-12)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-302c-inherent-biodegradability- modified-miti-test-ii_9789264070400-en.

[23]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21818—2008 化學品 固有生物降解性 改進的MITI試驗(Ⅱ)[S].北京:中國標準出版社，2008.

[24]顧夏聲,黃銘榮,王占生,等.水處理工程[M].北京:清華大學出版社,1985:202.

[25]OECD.Test No.302A:inherent biodegradability:modified SCAS test[EBOL].(1981-05-12)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-302a-inherent-biodegradability-modified-scas-test_9789264070363-en.

[26]OECD.Test No.302B:inherent biodegradability:Zahn-WellensEMPA test[EBOL].(1992-7-17)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-302b-inherent-biodegradability- zahn-wellens-evpa-test_9789264070387-en.

[27]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21795—2008 化學品 模擬試驗 污水好氧處理 生物膜法[S].北京:中國標準出版社,2008.

[28]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,國家標準化管理委員會.GBT 21829—2008 化學品 污水好氧處理模擬試驗 活性污泥單元法[S].北京:中國標準出版社,2008.

[29]OECD.Test No.307:aerobic and anaerobic transformation in soil[EBOL].(2002-04-24)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary. orgenvironmenttest-no-307-aerobic-and-anaerobic-transformation-in-soil_9789264070509-en.

[30]OECD.Test No.308:aerobic and anaerobic transformation in aquatic sediment systems[EBOL].(2002-04-24)[2012-05-18].http:www.oecd-ilibrary.orgenvironmenttest-no-308- aerobic-and-anaerobic-transformation-in-aquatic-sediment-systems_ 9789264070523-en.

[31]環(huán)境保護部.HJ 505—2009 水質(zhì) 五日生化需氧量(BOD5)的測定 稀釋與接種法[S].北京:中國環(huán)境科學出版社,2009：12.

[32]International Organization for Standardization.ISO 5815-1:2003 Water quality-determination of Ⅱ biochemical oxygen demand after n days (BODn):Part 1.Dilution and seeding method with allylthiourea addition[SOL].Switzerland:International Organization for Standardization,2003.(2003-04-01)[2012-05-18].http:www.iso.orgisoiso_cataloguecatalogue_tccatalogue_detail.htm?csnumber=31090. ○

《環(huán)境工程技術(shù)學報》投稿須知

文稿應具有創(chuàng)新性、科學性、先進性、實用性，內(nèi)容務求論點明確、論證可信、論據(jù)充分、數(shù)據(jù)準確、邏輯推理正確，文章結(jié)構(gòu)嚴謹、層次清楚、重點突出、文筆精練、圖表規(guī)范，并且是未在其他公開發(fā)行期刊或正式出版的論文集發(fā)表的作品。

稿件需要清楚地提出問題。對所研究問題的背景，研究工作的目的，主要方法、原理與主要儀器設(shè)備，結(jié)果(包括主要數(shù)據(jù))與分析以及結(jié)論等內(nèi)容有清楚的描述。

稿件涉及的研究項目應具有一定的前沿性，在已有的環(huán)境工程技術(shù)研究存量上，研制出新的技術(shù)方法、新系統(tǒng)、新設(shè)備、新儀器；在原有基礎(chǔ)上引入新的觀點、新的方法或新的改進；或是重大的新技術(shù)推廣應用研究。

本刊要求作者注意保持嚴謹?shù)膶W風。凡引用他人觀點、成果，必須加以注明。

來稿全文(含圖、表)以8 000字為宜，有價值的論文可放寬至1.5萬字。為保證稿件評審的客觀公正，提高本刊的質(zhì)量，本刊實行雙向匿名審稿制度。稿件中應注意避免影響匿名審稿的行文或注文出現(xiàn)。

作者進入《環(huán)境工程技術(shù)學報》網(wǎng)站(www.hjgcjsxb.org.cn)登錄在線投稿系統(tǒng)，注冊用戶名后，在線投遞論文。投稿及查看進度等使用方法請查看網(wǎng)站首頁的“使用指南”。本刊采用Word 2003版本排版。稿件圖、表須工整清楚，不得自造簡化字。不符合本投稿須知要求的稿件，編輯部將不予受理。

來稿的編排順序：題目、作者姓名、工作單位及城市、郵編，中文摘要、關(guān)鍵詞，英文題目、作者姓名漢語拼音、作者單位(英文)、英文摘要、英文關(guān)鍵詞(與中文關(guān)鍵詞相對應)，正文以及參考文獻。

在首頁腳注處應注明收稿日期，基金項目(省部級以上基金資助或其他資助項目及項目批準號)，第一作者簡介(姓名、出生年、性別、職稱、學位、主要研究領(lǐng)域和E-mail)及責任作者簡介。

參考文獻一般不少于15篇，其中外文文獻不少于5篇。

編輯部收到稿件后即登記送審，經(jīng)初、復、終審，每一審稿程序完成后均可能產(chǎn)生不錄用稿。未被錄用稿將通過E-mail或電話通知作者，投稿時務必寫明E-mail和電話，以利編輯及時處理稿件，請勿一稿兩投。如果超過3個月未收到我刊的刊用通知，作者可自行處理稿件。您的來稿，無論本刊采用與否，概不退稿，請作者務必自留底稿。

文責自負，但編輯有權(quán)對來稿做文字性修改、刪節(jié)。如作者不同意刪改，請注明。

來稿采用后，本刊根據(jù)文稿質(zhì)量向作者支付稿酬。特殊稿件按雙方協(xié)議標準執(zhí)行。作者論文的著作權(quán)(含各種介質(zhì))使用費與稿酬一次付清，不再另付。

文章在《環(huán)境工程技術(shù)學報》發(fā)表后，編輯部將制作配印刷封面的抽印本6本和2本樣刊贈送給作者。

作者稿件一經(jīng)錄用，文稿將編入我刊數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，并提供使用功能。如不同意以上投稿須知條款內(nèi)容及有關(guān)版權(quán)使用協(xié)議的規(guī)定，請作者在來稿時聲明，本刊將視情況做適當處理，否則視為同意。

ComparisonsofClassicalTestMethodsofReadyBiodegradabilityforChemicals

LIU Chun-xin, YU Li-na, YANG Li, NIE Jing-lei, CHEN Lin, YIN Ya-dan

Chemical Registration Center of Ministry of Environmental Protection, Chinese Research Academy of Environmental Science, Beijing 100012, China

By analyzing the experimental principle, operating feature and limited factors of six classical test methods of ready biodegradability, it was pointed out that the suited test method, test substance concentration and inoculum concentration had better be selected according to the values ofEC50andEC20of activated sludge from respiration inhibition test. After comparing the requirement on concentration ranges of test substances, source and pre-condition of inoculum, preparation and preliminary treatment of mineral medium, and validity of quality control of the six test methods, it was indicated that inoculum was forbidden to contact test substances before inoculating in all test methods of chemicals for ready biodegradability; different sources of inoculum might impact on test results greatly. Each method required different concentrations of inoculum, and it was suggested that bacteria should be enumerated by using plate-counting techniques and microbial cell densities controlled accordingly. The effective preliminary treatment of inoculum and mineral medium could reduce blank values. It was important to avoid organic carbon generated from filter membrane or centrifugation influence on analyzing DOC concentration. Frequent questions in test process were listed, and it was emphasized that test results should be estimated from degradation curve, and that trans-areas and multi-source standard inoculum should be researched and developed as soon as possible.

chemicals; ready biodegradability; test methods; operation key points; comparison

1674-991X(2013)02-0124-09

2012-06-11

國家標準制修訂計劃項目(20081305-T-469)；國家環(huán)境保護標準制修訂項目(2011-26)

劉純新(1974—)，男，副研究員，碩士，主要從事化學品污染防治和生態(tài)毒理學測試、GLP體系研究，liucx@crc-mep.org.cn

*通訊作者:楊力(1973—)，女，高級工程師，主要從事化學品環(huán)境管理研究，yangl@crc-mep.org.cn

X592 X831

A

10.3969j.issn.1674-991X.2013.02.021