方應(yīng)權(quán)

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404020)

柴胡為臨床常用中藥，《中國(guó)藥典》(2010版一部)收載本品為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense D C.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根［1］。紫花大葉柴胡Bupleurum longiradiatum var.porphyranthum為柴胡屬植物的一種，多年生草本，分布在河南、四川、陜西、甘肅等地。具有發(fā)表祛風(fēng)、清泄心火、清肝利膽、通經(jīng)之功效，主治肝氣不舒、虛勞骨蒸、月經(jīng)不調(diào)、感冒、黃疸等癥［1-2］，療效確切，在三峽庫(kù)區(qū)的巫溪、石柱、巴東和巫山等地使用尤為廣泛［3］。三萜類皂苷為柴胡屬植物的主要有效成分之一，其中含量較多的有柴胡皂苷 a、c、d［4］。柴胡皂苷a(saikosaponin-a)是柴胡抗癲癇作用的主要生物活性成分［5］。柴胡皂苷傳統(tǒng)提取方法包括水提取法［6］、乙醇浸漬法［7-8］以及超聲提取法［9］等，這些方法都不同程度地存在提取時(shí)間長(zhǎng)、耗能多、以及溶劑消耗大等缺點(diǎn)。閃式提取是近年來發(fā)展起來的一種中藥提取方法，該方法利用高速剪切力和攪拌力將藥材粉碎至細(xì)微顆粒，在局部負(fù)壓滲透的作用下使組織內(nèi)有效成分迅速達(dá)到溶解平衡，從而實(shí)現(xiàn)高效提取，具有高效節(jié)能、快速(1～3 min)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［10-11］。本實(shí)驗(yàn)首次以閃式提取法提取紫花大葉柴胡中的柴胡皂苷a，并采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，為開發(fā)柴胡制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

JHBE—50S型中草藥閃式提取器(河南金鼎科技發(fā)展有限公司);Agilent 1100系列高效液相色譜儀，安捷倫ChemStation色譜工作軟件(美國(guó)安捷倫公司);RE 52—86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SB 3200-超聲波提取器(上海必能信超聲有限公司);Millipore simplicity-185超純水器(美國(guó)密里博公司);METTLER AE240電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

紫花大葉柴胡，2012年8月中旬采集于重慶巫溪海拔約1500 m的紅池壩山，經(jīng)重慶師范大學(xué)陳邵成教授鑒定為傘形科柴胡屬紫花大葉柴胡。取其根，干燥，制成粗粉，備用;柴胡皂苷a對(duì)照品(供定量測(cè)定用，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110777-20050);甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫花大葉柴胡中柴胡皂苷a測(cè)定方法 參考文獻(xiàn)［2］，對(duì)紫花大葉柴胡中柴胡皂苷a的量進(jìn)行測(cè)定。色譜條件為:Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以甲醇-水(74∶26，V/V)為流動(dòng)相;體積流量為0.9 mL/min;柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm;進(jìn)樣量20μL。柴胡皂苷a進(jìn)樣量在0.11～4.40μg與峰面積呈線性關(guān)系(r=0.9999)。柴胡皂苷a平均回收率為97.42%，RSD為1.42%。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 考察因素和水平的確定 影響閃式提取得率的主要因素包括粉末粒徑大小、閃式提取電壓、提取溶劑種類和濃度、料液比、以及提取時(shí)間等［12-13］。綜合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，影響提取閃式提取紫花大葉柴胡中柴胡皂苷a的主要因素包括:提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間［7，9，14］。試驗(yàn)中，保持粉末粒徑為粗粉，閃式提取電壓為100 V及以乙醇為提取溶劑進(jìn)行其它因素的考察。

取干燥紫花大葉柴胡根粗粉50 g，置閃式提取罐中，進(jìn)行閃式提取，提取完成后過濾提取液，濾液加水稀釋至1000 mL，按2.1項(xiàng)測(cè)定柴胡皂苷a的量，以柴胡皂苷a得率作為考察指標(biāo)，采用單因素法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間對(duì)閃式提取的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，液料比為1∶12，提取時(shí)間為2.0 min時(shí)，得到柴胡皂苷a得率較高。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)為考察因素，各因素設(shè)置3個(gè)水平，采用L9(34)正交表，各因素水平設(shè)置為:乙醇(65%、75%和85%)、料液比(1∶9、1∶12和1∶15)、提取時(shí)間(1.0 min、2.0 min和3.0 min)，如表1所示，考察以上3個(gè)因素對(duì)紫花大葉柴胡中柴胡皂苷a提取工藝的影響。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由R值(表2)可知，各因素對(duì)提取率影響大小為:A＞B＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柴胡皂苷a提取率影響最大，其次為料液比，提取時(shí)間影響最小。方差分析結(jié)果(表3)顯示，因素A(乙醇)和B(料液比)對(duì)提取率的影響呈現(xiàn)顯著性(P＜0.05)，而閃提時(shí)間對(duì)得率影響不顯著(P＞0.05)。通過K值可判斷出最佳提取條件為A2B2C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，料液比1∶12，閃式提取時(shí)間3 min。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取大葉柴胡干燥根粗粉50 g，置閃式提取罐內(nèi)，按最優(yōu)工藝進(jìn)行閃式提取，即加入75%乙醇600 mL，提取3 min，濾過，濾液加水稀釋至1000 mL，即得閃式提取液，重復(fù)5次，按2.1項(xiàng)下測(cè)定柴胡皂苷a。5批大葉柴胡的柴胡皂苷a得率分別為15.42、15.86、16.02、15.38、15.56 mg/g，RSD為1.79%，表明該提取方法重復(fù)性好，本研究確定的最佳工藝條件切實(shí)可行。

2.4 閃式提取法與傳統(tǒng)乙醇回流提取法比較 根據(jù)文獻(xiàn)［6］，采用水提法，取大葉柴胡干燥根，加8倍量的水，提取2 h，提取液濃縮相當(dāng)于至每1 mL含1 g藥材，重復(fù)3次，得柴胡皂苷a的評(píng)價(jià)得率為0.31 mg/g，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

根據(jù)文獻(xiàn)［8，15］報(bào)道，采用浸漬法，即選用60%乙醇為溶劑，加5倍量，提取3次，每次浸提3 d，重復(fù)3次，按2.1項(xiàng)下測(cè)定，柴胡皂苷 a的平均得率為4.86 mg/g，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

根據(jù)文獻(xiàn)［9］報(bào)道，采用超聲提取柴胡皂苷a，即提取時(shí)間93 min、超聲功率150 W、液固比60。測(cè)得柴胡皂苷a得率為6.21 mg/g，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

3 討論

通過正交試驗(yàn)得到了閃式提取大葉柴胡中柴胡皂苷a的最優(yōu)工藝條件，即75%的乙醇，料液比1∶12，閃式提取3.0 min。該方法操作簡(jiǎn)單、迅速、提取率高、生產(chǎn)成本低。

閃式提取時(shí)，需將柴胡適當(dāng)粉碎，以保證藥材在閃式提取罐中被刀頭打碎，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將柴胡制成過20目篩的粗粉，即可保證提取率。

與水提法相比，閃式提取得率為其50倍，提取時(shí)間為水提法的1/120，雖然閃提法需要使用乙醇作為溶劑，但在得率、操作時(shí)間和能耗上明顯優(yōu)于水提法。與乙醇浸漬法相比，閃提法乙醇消耗量與其基本相當(dāng)，得率約為浸漬法的5倍，時(shí)間則僅為其1/4320。與超聲提取法相比，閃式提取法得率約為其2.5倍，閃式提取器功率按800 W計(jì)算，消耗能量為超聲提取法的11.4%，耗時(shí)為后者的1/31。綜上所述，閃式提取在柴胡皂苷a得率、能耗和操作簡(jiǎn)單迅速等方面比傳統(tǒng)的提取方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

閃式提取法適用于植物硬、軟材料的快速高效提取，具有提取溫度低、高效節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。但該方法也存在一定的缺點(diǎn)，如因藥材過粗過硬容易損壞刀頭;為安全起見，工作電壓和功率需控制住一定范圍內(nèi)。因此，目前該方法主要用于實(shí)驗(yàn)室研究，對(duì)于工業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用尚需進(jìn)一步探索。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010版一部［S］北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:263-264.

［2］易為丹，方應(yīng)權(quán).HPLC測(cè)定三峽庫(kù)區(qū)紫花大葉柴胡中柴胡皂苷a含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(2):71-73.

［3］陳紹成.三峽庫(kù)區(qū)柴胡原植物調(diào)查及藥材鑒定［J］.中華臨床防治醫(yī)學(xué)雜志，2007，2(4):54-55.

［4］李 騰，高 展，孫玉俠，等.柴胡及其制劑中皂苷類成分的研究［J］.中成藥，2011，33(11):1840-1843.

［5］王啟帥，楊 云，肖功勝，等.北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜的建立及色譜數(shù)據(jù)的分析［J］.中成藥，2011，33(3):373-378.

［6］霍務(wù)貞，孫嚴(yán)彤，朱盛山.柴胡有效成分提取條件的研究［J］.廣東藥學(xué)，2005，15(4):122

［7］鄔科芳，倪力軍，張立國(guó).不同提取工藝對(duì)柴胡中柴胡皂苷a含量的影響［J］.中成藥，2006，28(8):1230-1231.

［8］李克明，陳玉武，張永文.正交試驗(yàn)優(yōu)選浸漬法提取柴胡皂苷的工藝條件［J］.中成藥，2003，25(7):588-589

［9］孫印石，王建華，朱玉霞，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取柴胡皂苷a、c、d的工藝研究［J］.中藥材，2011，34(11):1776-1780.

［10］于 敏，韓德強(qiáng).閃式提取法提取丹參中有效成分的研究［J］.中成藥，2010，32(9):1609-1612.

［11］劉 英，蘇柘僮，陳 龍，等.應(yīng)用Box—Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化地榆鞣質(zhì)的閃式提取工藝［J］.華西藥學(xué)雜志，2012，27(3):304-306.

［12］王 瑾，楊義雄，林 海，等.閃式提取無患子中長(zhǎng)春藤皂苷元的最優(yōu)工藝［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，22(1):50-52.

［13］張慶嶺.鮮地黃的閃式提取工藝優(yōu)選［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(1):62-63.

［14］衛(wèi) 吳，劉 清，衛(wèi)偉光，等.HPLC法測(cè)定秦嶺柴胡及其不同提取物中柴胡皂苷 a和柴胡皂苷 d［J］.中成藥，2013，35(2):342-345.

［15］肖功勝，楊 云，劉富崗，等.柴胡皂苷提取和含量測(cè)定方法研究［J］.中成藥，2009，31(4):595-598.