周一帆，胡昌江，張雪潔，余凌英，陳 琳，高 源

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611137)

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim的干燥葉，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕的功效［1］。羊脂油炙淫羊藿，最早記載于《雷公炮炙論》［2］，為臨床常用的炮制品。淫羊藿生品功效側(cè)重于祛風(fēng)濕，而經(jīng)羊脂油炙后功效側(cè)重于溫腎壯陽。黃酮類化合物是淫羊藿的有效成分，其中以淫羊藿苷為主的多種以異戊烯基黃酮為母核的結(jié)構(gòu)類似化合物為其主要成分。藥物在體內(nèi)的代謝過程在一定程度上對(duì)藥效有影響［3-7］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過比較生、炙淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的代謝過程的差異，為系統(tǒng)性的研究淫羊藿炮制前后功效變化奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國Agilent，型號(hào)1200)，單四級(jí)桿質(zhì)譜(美國Agilent，型號(hào)6120)電子天平(德國SARTORIUS，型號(hào)BD61，感量為0.1 mg);高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)TGL-16B)。

1.2 試藥 淫羊藿苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110737-200415，供含量測(cè)定);槲皮素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)081-9033，供含量測(cè)定)。淫羊藿藥材(購于成都新荷花藥材市場)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim干燥葉;乙腈(色譜純，美國sigma公司)，其余試劑為分析純;水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量(220±10)g，購于四川達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(川)2008—24。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿藥液的制備 炙淫羊藿由實(shí)驗(yàn)室自行炮制(炮制溫度為160℃，炮制時(shí)間7 min，每100 g淫羊藿加羊脂油20 g)［8］，生、炙淫羊藿經(jīng)高效液相檢測(cè)淫羊藿苷量為1.12%和1.29%。取生淫羊藿173 g、炙淫羊藿150 g分別12倍70%乙醇回流提取兩次，每次1.5h。藥液減壓濃縮至100 mL［9］。生淫羊藿藥液質(zhì)量濃度1.73 g/mL(相當(dāng)于淫羊藿苷19.37 mg/mL)，炙淫羊藿藥液質(zhì)量濃度1.50 mg/mL(相當(dāng)于淫羊藿苷19.35 mg/mL)。

2.2 血漿樣品處理［10-12］分別取血漿0.2 mL置1.5 mL離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)溶液1 mL乙酸乙酯渦旋混合5 min，離心10 min(8000 r/min)，取上清液。殘?jiān)偌尤? mL乙酸乙酯重復(fù)操作一次，合并兩次上清液。置于40℃下氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00μL甲醇，渦旋混合 5 min，離心 10 min(12000 r/min)，吸取上清液進(jìn)樣分析。

2.3 分析方法的建立

2.3.1 色譜條件 Diamonsil鉆石二代C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);以乙腈－0.1%甲酸溶液(30∶70)為流動(dòng)相;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃。

2.3.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，干燥器流量12 L/min，溫度350℃，SIM模式下選擇質(zhì)荷比(m/z)677與303離子進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.3 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品加甲醇配置成0.418 mg/mL的貯備液，精密稱取槲皮素對(duì)照品加甲醇配置成1.54μg/mL的貯備液，備用。

2.3.4 專屬性考察 將空白血漿、空白血漿中加入淫羊藿苷及給藥后大鼠血漿樣品按照2.3項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示在選定的條件下，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)淫羊藿苷的測(cè)定無干擾，見圖1。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取0.418 mg/mL的淫羊藿苷對(duì)照品溶液適量，用空白大鼠血漿分別配 置 成 0.209、0.418、0.836、1.672、2.508、3.344μg/mL的系列空白血漿對(duì)照品溶液200μL，依照2.2項(xiàng)下方法處理樣品后進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo)Y，淫羊藿苷與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y=1.6142 X+0.0871，r2=0.9996。結(jié)果表明淫羊藿苷在0.209～3.344μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度與回收率試驗(yàn) 取淫羊藿苷貯備液，加入空白大鼠血漿配制成含質(zhì)量濃度分別為0.3、1.5、3.0μg/mL的血漿樣品，依照2.2項(xiàng)下方法操作與測(cè)定，每一濃度平行測(cè)定5次，每一質(zhì)量濃度連續(xù)測(cè)定5 d。計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。另外，將血漿樣品測(cè)得的濃度與血漿實(shí)際濃度比較，計(jì)算相對(duì)回收率。結(jié)果顯示高、中、低濃度血漿中淫羊藿苷日內(nèi)精密度RSD分別為5.16%、5.58%、4.87%;日間精密度RSD分別為6.59%、5.53%、4.83%。高、中、低濃度血漿中淫羊藿苷平均回收率為88.4%、93.1%、85.6%。

2.4 大鼠藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 取雄性SD大鼠12只，隨機(jī)分兩組，分別按體質(zhì)量灌胃給予生淫羊藿藥液(34.6 g/kg)、炙淫羊藿藥液(30 g/kg)，相當(dāng)于淫羊藿苷387 mg/kg。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。在給藥前及給藥后 5、15、30、60、90、120、240、360、480、720 min分別后眼眶靜脈叢取血0.5 mL，置于預(yù)先肝素化的離心管中，6000 r/min離心10 min，取上層血漿0.2 mL放入－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 數(shù)據(jù)處理 使用DAS 2.0軟件處理大鼠灌胃后各時(shí)間點(diǎn)的平均血藥濃度(C)－時(shí)間(t)數(shù)據(jù)，自動(dòng)判別模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。DAS 2.0軟件計(jì)算得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1，大鼠血漿中淫羊藿苷的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

表1 生、炙淫羊藿藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(，n=6)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of icariin in extract from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium(，n=6)

表1 生、炙淫羊藿藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(，n=6)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of icariin in extract from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium(，n=6)

注:*與對(duì)照藥物相比P＜0.05

參數(shù) 單位 藥物生淫羊藿 炙淫羊藿Tmax h 11 Cmax mg/L 2.285±0.75 2.8±0.82*t1/2α h 0.691±0.12 4.569±0.89 t1/2β h 4.967±0.56 5.423±0.57 V1/F L/kg 112.504±10.53 130.42±15.88 CL/F L/h/kg 23.4±6.14 15.6±3.76 AUC(0-t) mg/L·h 14.935±5.11 20.682±4.28*AUC(0-∞) mg/L·h 16.039±6.21 25.301±8.12 MRT(0-t) h 4.932±0.76 5.471±1.21 MRT(0-∞) h 6.093±0.84 9.1±2.36 Ka 1/h 1.38±0.19 1.98±0.24

圖2 生、炙淫羊藿的血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Concentration-time profiles of icariin in extract solutions from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于血漿處理方法進(jìn)行了考察，血漿處理的溶劑分別比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯處理后淫羊藿苷的回收率，最終乙酸乙酯處理后的回收率較高。血漿處理次數(shù)的比較顯示，處理2次的回收率均高于處理1次，而處理3次與處理2次的回收率差異不大。氮吹溫度的考察顯示30、40、50℃回收率無明顯的差異。血漿處理方法最后定為用乙酸乙酯處理2次后置于40℃下氮?dú)獯蹈伞?/p>

藥時(shí)曲線經(jīng)擬合顯示生、炙淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)均符合二室模型。在表1與圖2中可以看出，生淫羊藿組血藥峰濃度(Cmax)為(2.29±0.75)mg/L，0～12 h的藥時(shí)曲線下面積(AUC0-t)為(14.935±5.11)mg/(L·h)，炙淫羊藿組 Cmax升高到(2.80±0.82)mg/L，AUC(0-t)升高到(25.301±8.12)mg/(L·h)。由此可見炙淫羊藿中的淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的吸收量有所提高，表明了炮制對(duì)于淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的吸收有一定的促進(jìn)作用，炮制可提高淫羊藿中淫羊藿苷的生物利用度。淫羊藿炮制所用輔料羊脂油主要含飽和脂肪酸7種，主要是棕櫚酸及硬脂酸等，不飽和脂酸9種主要是油酸，反式9-十八碳烯酸等［13-14］。脂肪酸有表明活性劑的作用可能是淫羊藿苷溶解性得到提高，從而增強(qiáng)了其在體內(nèi)的吸收。

［1］趙國平，戴 慎，陳仁壽.中藥大辭典［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005.3149-3154.

［2］王孝濤.歷代中藥炮制法匯典［M］.江西:南昌科學(xué)技術(shù)出版社，1998:369.

［3］呂 鵬，黃曉舞，呂秋軍.黃酮類化合物吸收、分布和代謝的研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2007，32(19):1961-1964.

［4］鄒節(jié)明，孟 杰，顏正華.中藥復(fù)方有效成分淫羊藿苷的藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中草藥，2002，33(1):55-58.

［5］Li Y，Duan J，Guo T.In vivo pharmacokinetics comparisons of icariin，emodin and psoralen from gan-kang granules and ex-tracts of herba Epimedii，Nepal dock root， Ficus hirta yahl［J］.J Ethnopharmacology，2009(124):522-529.

［6］李寅超，黃蘭嵐，趙宜紅，等.不同煉制溫度和用量的羊脂油制淫羊藿對(duì)腎陽虛大鼠的影響［J］.中國中藥雜志，2011，36(16):2250-2254.

［7］許青媛.淫羊藿對(duì)大鼠性腺功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，1996(2):22.

［8］周一帆，胡昌江，余凌英.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選淫羊藿油炙工藝［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(16):16-18.

［9］陶君彥，徐紹新，李志雄.淫羊藿醇提工藝條件的研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2004，15(1):11-12.

［10］錢 淺，孫 娥，樊宏偉，等.羊脂油對(duì)淫羊藿炮制品提取物中 寶藿苷 Ⅰ［J］.中草 藥，2012，43(10):1981-1985.

［11］趙艷紅，賈曉斌，陳 彥.淫羊藿苷大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(10):681-684.

［12］劉曉燕，王本杰，巍春敏.淫羊藿苷單體及淫羊藿總黃酮提取物大鼠藥動(dòng)學(xué)特征比較［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(22):1858-1863.

［13］黃蘭嵐，李嬈嬈.氣相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法分析羊脂油的脂肪酸成分［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(10):2488-2489.

［14］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草:第9冊(cè)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.