郜紅利，譚玉柱

(1.湖北民族學院，湖北恩施 445000;2.成都中醫(yī)藥大學，四川成都 611137)

蜘蛛香為敗醬科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根莖和根［1］。性味辛、苦，溫，具有理氣和中、散寒除濕、活血消腫的功效，主要用于治療脘腹脹痛、嘔吐泄瀉、風寒濕痹、小兒疳積、腳氣水腫、跌打損傷等癥［2］。其化學成分主要是揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜、黃酮及其他一些成分［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，蜘蛛香有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、抗腫瘤等藥理作用［4］。蜘蛛香主要分布在云南、湖北、貴州等偏遠山區(qū)［5］，其中湖北恩施自治州各縣市資源豐富。隨著蜘蛛香藥用價值的日益提高，其野生資源已難以滿足市場需求，開展野生蜘蛛香轉(zhuǎn)家種的研究迫在眉睫［6］，本課題組通過其根莖無性繁殖，對其野生轉(zhuǎn)家種技術(shù)進行初步研究，培育了不同生長年限的栽培品，從其產(chǎn)量及外觀性狀上觀察，二者并無較大差異，但是有關(guān)其栽培品的品質(zhì)評價尚無定論。因此，課題組分別收集不同栽培年限的蜘蛛香與野生蜘蛛香，從其性狀、鑒別、化學成分分析、指標性成分定量測定等方面進行質(zhì)量評價，以期對野生品種與栽培品種進行科學評價，探討野生轉(zhuǎn)家種的可行性，也為蜘蛛香栽培技術(shù)的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 試劑與試藥

1.1 儀器與試劑 Angenlent 1200高效液相色譜儀;BP121S型電子天平(北京Sartorius天平有限公司，十萬分之一);顯微鏡(上海炳宇光學儀器有限公司)，DiamonsilC-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)。纈草三酯(純度＞98%，成都植標化純生物科技有限公司，110756-200110)、橙皮苷(純度＞98%，中國藥品生物制品檢定研究院，110721-200512)，乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，超純水(實驗室自制)，其余試劑均為分析純。

1.2 藥材 實驗用蜘蛛香藥材分別來自湖北省恩施州利川市、宣恩縣、巴東縣、咸豐縣、建始縣等5個縣市，每個縣市各有栽培品與野生1個批次，共計10個批次，野生與栽培品經(jīng)中藥鑒定教研室朱敏英教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根莖和根，來源見表1。

表1 不同批次蜘蛛香藥材來源Tab.1 Sources of different batches of Valeriana jatamansi

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

2.1.1 野生品 本品根莖呈圓形或扁圓形，略彎曲，不分叉，長3～5 cm，直徑為0.5～1.6 cm，棕褐色或茶褐色，表面有綢密的環(huán)紋突起，不甚規(guī)則，底面有須根痕。蘆頭平截，可見莖、葉殘基。質(zhì)堅實，斷面黃褐色。下側(cè)具多數(shù)須根，多卷縮彎曲。味略苦、辛質(zhì)堅脆，易折斷，斷面淺綠色。

2.1.2 栽培品 本品根莖呈扁圓柱形，略彎曲，不分叉，長2～6 cm，直徑為0.6～1.7 cm，莖基殘穴處稍膨大，表面褐色，表面有較綢密的環(huán)紋突起，不甚規(guī)則，底面有多數(shù)須根痕，須根多卷縮彎曲。味略苦、辛，質(zhì)堅脆，易折斷，斷面淺綠色。栽培品種主要特點:個頭較野生品大、顏色較淺、莖基殘穴處膨大、底面須根甚多。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 野生與栽培品一致。本品粉末灰褐色，置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)淀粉粒眾多，類圓形，臍點裂縫狀，有的可見層紋;復粒由2～4粒組成。易見含黃棕色內(nèi)含物與油滴的薄壁細胞碎片。根毛為單細胞與多細胞組成。木栓細胞淡黃色，多角形。導管多為網(wǎng)紋導管和單紋孔導管。薄壁細胞內(nèi)含有橙皮苷結(jié)晶和淡棕褐色物。

2.2.2 TLC鑒別 分別取本品野生與栽培品粉末1 g，加乙醚10 mL，振搖，放置5 min，濾過，濾液揮去乙醚，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取纈草三酯對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的對照溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液5μL、對照品溶液2μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(30～60℃)-丙酮(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。野生品與栽培品顯色斑點沒有明顯差異。

2.3 化學成分比較

2.3.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，0～20 min，10% ～55%乙腈，20～60 min，55% ～95%乙腈。體積流量0.8 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。

2.3.2 色譜結(jié)果 見圖1。圖1中的12號峰(纈草三酯)為參照峰，野生品與栽培品化學成分比較沒有明顯差異，根據(jù)特征圖譜共有峰標記，顯著差異峰主要集中在3、4號峰，根據(jù)極性較大的黃酮類成分與極性較小的環(huán)烯醚萜類成分主要集中在圖譜的首尾段，觀察發(fā)現(xiàn)野生品與栽培品在首尾段無顯著差異，說明影響其藥效的主要化學成分一致，主要差異集中在中間段。

圖1 野生品與栽培品的化學成分對照圖譜Fig.1 Fingerprint of wild and cultivated products of Valeriana jatamansi Jones

2.4 成分測定

2.4.1 纈草三酯含有量比較

2.4.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-水(60∶40)為流動相;檢測波長為256 nm。理論板數(shù)按纈草三酯峰計算應(yīng)不低于5000。

2.4.1.2 對照品溶液的制備 取纈草三酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含纈草三酯0.1096 mg的溶液，即得。

2.4.1.3 供試品溶液的制備 分別取野生與栽培品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率500 W，頻率28 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取纈草三酯對照品2、5、10、15、20μL注入液相色譜儀，按照2.4.1.1項色譜條件下檢測峰面積，同一進樣體積連續(xù)測3次取平均峰面積，以進樣量為橫坐標x，以平均峰面積為縱坐標y進行線性回歸，即得線性關(guān)系為y=194.09x+12.729，r=0.9996，線性范圍為 0.2192 ～2.192μg。

2.4.1.5 精密度考察 取同一份對照品溶液，按2.4.1.1項中色譜條件，連續(xù)進樣5次，計算纈草三酯峰面積RSD為2.34%(n=5)。

2.4.1.6 穩(wěn)定性考察 將“批次1”供試品溶液室溫下放置，分別于第0、2、4、6、8、12 h進樣測定，計算纈草三酯色譜峰峰面積RSD值為2.40%(n=5)，表明纈草三酯在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.1.7 加樣回收率試驗 分別稱取6份供試品約0.5 g，加入與“批次1”供試品纈草三酯含有量相當?shù)耐粚φ掌啡芤海謩e制備6份樣品。分別測定，平均加樣回收率為100.93%，RSD為3.37%(n=6)。

2.4.1.8 樣品測定 稱取不同來源的野生品與不同生長年限的栽培品蜘蛛香藥材粉末各2 g，按照2.4.1.3項下供試品制備方法制備，依次進樣10μL，按照2.4.1.1項色譜條件測定各供試品峰面積，外標法計算。圖譜見圖2。

圖2 纈草三酯HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of valepotriate

2.4.2 總黃酮與總纈草三酯量比較

2.4.2.1 標準曲線的制定 準確稱取橙皮苷和纈草三酯對照品適量，分別加甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為0.1106 mg/mL和0.1096 mg/mL的標準溶液。分別移取上述標準液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，以甲醇作空白，分別于最大吸收波長284 nm和256 nm處測吸光度。以吸光度A對標準溶液質(zhì)量濃度C作圖，即得標準工作曲線分別為Y=0.035x－0.006，r=0.9993，線性范圍為 5.53～27.65μg/mL;Y=31.427x+0.0372，r=0.9992;線性范圍為2.19 ～27.4μg/mL。

2.4.2.2 供試品的制備及測定 分別稱取2 g已脫脂和未脫脂處理的野生和栽培蜘蛛香粉末各3批次，分別加入50 mL甲醇溶劑，密塞，搖勻，超聲提取1次，30 min/次，取出放冷，離心分離，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至干，加30 mL甲醇溶解，濾去不溶物，濾液加甲醇定容至50 mL，即得總黃酮和纈草三酯供試品溶液。分別移取0.2 mL供試品溶液，加甲醇定容至10 mL，以甲醇作空白，分別于284 nm和256 nm處測吸光度。并根據(jù)標準曲線計算蜘蛛香總黃酮和纈草三酯量。

2.4.2.3 精密度考察 取橙皮苷和纈草三酯對照品適量，以甲醇作空白，分別于284 nm和256 nm處測吸光度，連續(xù)測定5次，計算橙皮苷和纈草三酯RSD分別為3.14%和2.89%(n=5)。

2.4.2.4 穩(wěn)定性考察 將橙皮苷和纈草三酯對照品溶液室溫下放置0、2、4、6 h，以甲醇作空白，分別于284 nm和256 nm處計算橙皮苷和纈草三酯對照品吸光度的RSD值，分別為1.98%和1.87%(n=4)，表明橙皮苷和纈草三酯在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2.5 加樣回收試驗 稱取“批次1”已知總黃酮和總纈草三酯含有量的蜘蛛香供試品6份，分別加入等量的橙皮苷和纈草三酯對照品，以甲醇作空白，分別于284 nm和256 nm處測吸光度，計算平均加樣回收率分別為96.31%和95.74%，RSD分別為3.34%和3.21%(n=6)。

2.4.3 測定結(jié)果 見表2。

表2 蜘蛛香野生品與栽培品指標性成分含有量比較Tab.2 Content determination of wild and cultivated products of Valeriana jatamansi

綜上，蜘蛛香栽培品的總黃酮、纈草三酯類成分含有量均高于野生品。

3 結(jié)論

3.1 野生蜘蛛香與栽培蜘蛛香的外觀性狀無明顯差異，顯微和薄層鑒別亦未發(fā)現(xiàn)明顯差異，其特征化學成分分析共有峰均存在，僅在中間段3、4號共有峰上有明顯不同，提示野生品較栽培品化學成分復雜，但是差異成分是否是其活性成分還有待商榷;野生品與栽培品的指標性成分含有量比較發(fā)現(xiàn)，總黃酮和纈草三酯量后者均高于前者。綜上，蜘蛛香栽培品品質(zhì)在指標性成分含有量上優(yōu)于野生品。

3.2 蜘蛛香總黃酮是其抑菌、抗腫瘤作用的主要藥效成分［7］，橙皮苷是蜘蛛香黃酮類的主要化學成分［8］，利用它作為標準測定總黃酮不僅測定準確而且具有衡量其質(zhì)量的意義，已有研究表明家種蜘蛛香中橙皮苷量較野生蜘蛛香高，提示其野生轉(zhuǎn)家種的可行性［9］。纈草三酯類成分具有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、解痙等多種藥理活性［10］，是其主要活性成分及質(zhì)量控制指標［11］，蜘蛛香中纈草三酯類成分量的測定方法主要有電位滴定法［12］、比色法［13］、酸堿滴定法［14］。利用紫外分光光度法測定蜘蛛香中總纈草三酯量，方法準確、快速、重復性好、操作簡便［7］。蜘蛛香藥材集中九月采集，主要是考慮纈草三酯類成分在九月藥材中含有量較高［15］。本課題基于性狀鑒別、化學成分比較、指標性成分量比較等方面對蜘蛛香野生品與栽培品品質(zhì)進行系統(tǒng)評價，為蜘蛛香野生轉(zhuǎn)家種品質(zhì)評控提供重要科學依據(jù)，證實了野生轉(zhuǎn)家種的可行性，同時該項目的開展將極大緩解其資源匱乏的現(xiàn)狀，有效保護蜘蛛香野生資源，有利于中藥資源的可持續(xù)開發(fā)利用。

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