胡 坪，喬晚芳，王 楠，陳 燁，黃 露，王月榮*

(1.上海市功能性材料化學(xué)重點實驗室華東理工大學(xué)，上海 200237;2.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237;3.馬爾文儀器公司，上海 200237)

多糖的相對分子質(zhì)量測定是其一級結(jié)構(gòu)研究的重要內(nèi)容，相對分子質(zhì)量的大小顯著影響多糖的性質(zhì)及其生物活性。一般來說，多糖相對分子質(zhì)量越大，分子體積越大，越不利于多糖跨越多重細胞膜障礙進入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用;但相對分子質(zhì)量過低，又無法形成產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)。因此，只有在一定的相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)，多糖才表現(xiàn)出其活性。不同多糖產(chǎn)生生物學(xué)活性的最佳相對分子質(zhì)量范圍不同［1］。

多糖相對分子質(zhì)量及其分布的測定方法很多，如端基法、分析超離心法、黏度法、蒸氣壓滲透法、膜滲透壓法、凝膠色譜、質(zhì)譜法、光散射法等［1］。其中，端基法［2］要求試樣中每一個多糖分子鏈端必須具有可以用化學(xué)方法分析定量的基團，且基團數(shù)目固定不變。分析超離心法［3］離心時間長，通常要幾十小時。黏度法［4］是一種需要標準物質(zhì)的相對測定方法，且測得的是多糖相對黏均分子質(zhì)量。蒸氣壓滲透法［5］適合于相對分子質(zhì)量小于3×104物質(zhì)的相對分子質(zhì)量測定，同時需要標準物質(zhì)以測定K值。膜滲透壓法對于相對分子質(zhì)量較小的多糖測定誤差較大。

高效凝膠色譜法(HPGPC)是一種大分子化合物的分離分析方法，具有設(shè)備和操作簡單、分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點，已被藥典收載用于測定多糖的相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布［6］，是目前測定多糖相對分子質(zhì)量及其分布最常用的方法。隨著質(zhì)譜分析儀器的不斷發(fā)展，特別是基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)的出現(xiàn)，采用質(zhì)譜法分析蛋白質(zhì)及多糖等生物大分子的相對分子質(zhì)量及其分布成為研究熱點［7-8］。小角度激光光散射法是近年來發(fā)展起來的相對分子質(zhì)量測定絕對方法。物質(zhì)的相對分子質(zhì)量直接由光散射信號通過Rayleigh光散射方程計算得到，因此不依賴于標準物質(zhì)，無需做校正曲線。將分子排阻色譜與小角度激光光散射檢測器法聯(lián)用(SECLALLS)，可以測得多糖混合樣品的純度和相對分子質(zhì)量分布等，是一種理想的相對分子質(zhì)量測定方法［9-10］。

麥冬多糖為中藥麥冬Ophiopogon japonicus的主要成分之一。藥理研究表明，麥冬多糖具有抗心肌缺血、降血糖、抗腫瘤、免疫活性、耐缺氧等多種藥效［11-14］。本實驗分別采用高效凝膠色譜聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測器法、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法和分子排阻色譜聯(lián)用小角度激光光散射法，對麥冬多糖的相對分子質(zhì)量及其分布進行測定和比較，為多糖化合物相對分子質(zhì)量及其分布測定的方法選擇提供參考，也可為麥冬多糖藥物質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效凝膠色譜儀(Agilent，美國)配備 Alltech 3300 ELSD檢測器(Grace，美國);4800 plus MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀(AB Sciex，美國);Viscotek GPCmax-TDA305多檢測器(示差折光檢測器、小角度激光光散射檢測器、粘度檢測器)GPC/SEC系統(tǒng)(Malvern，英國)。

浙麥冬Ophiopogon japonicus(購自浙江慈溪，由澳門科技大學(xué)姜志宏教授鑒定);DEAE-52(Whatman);Sephadex G-25、G-100(上海藍季科技發(fā)展有限公司);標準葡聚糖T-1(MW=1000)、T-2(MW=5000)、T-3(MW=12000)、T-4(MW=50000)(Fluka，Switzerland);2，5-二羥基苯甲酸(Sigma，美國);硝酸鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司);聚氧乙烯、葡聚糖(Malvern，英國)。

2 方法與結(jié)果

2.1 麥冬粗多糖的提取和純化［15］精密稱取500 g浙麥冬藥材，粉碎，過40目篩，以4倍量95%的乙醇回流提取1 h，冷卻，抽濾，藥渣置常溫晾干。取50 g干燥藥渣，加入500 mL去離子水，回流提取2 h，離心，上清液減壓濃縮，加入95%乙醇，使提取液含醇量達80%，靜置過夜，離心，沉淀冷凍干燥。取干燥沉淀適量，以去離子水溶解，依次用 DEAE-纖維素柱、Sephadex G100、Sephadex G25凝膠柱進行純化，苯酚-硫酸法檢測，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線合并峰位溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得麥冬多糖。經(jīng)苯酚-硫酸法測定，麥冬多糖的平均含有量為96.8% (n=3，RSD=0.7%)。

2.2 凝膠色譜測定方法 采用HPGPC-ELSD法對麥冬多糖的相對分子質(zhì)量進行測定。方法為:取一定量的的麥冬多糖溶于純凈水中，配制成約1.0 mg/mL的溶液，用0.45μm水系濾膜過濾后，取續(xù)濾液注入凝膠色譜儀分析。色譜條件為:采用TSK-GEL G3000PW 凝膠色譜柱(10μm，7.5 mm×30 cm)，流動相為純水，體積流量 0.8 mL/min，進樣量10μL，柱溫30℃。ELSD氣體流量為1.6 L/min，漂移管溫度50℃，增益為1。結(jié)果麥冬多糖的凝膠色譜圖(圖1)中僅出現(xiàn)一對稱狹窄峰，說明該多糖為均一多糖。

圖1 麥冬多糖的HPGPC-ELSD譜圖Fig.1 HPGPC-ELSD chromatogram of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

分別稱取一定量的標準葡聚糖T-1(Mw=1000)、T-2(Mw=5000)、T-3(Mw=12000)、T-4(Mw=50000)，純水溶解后，配成質(zhì)量濃度約為1.0 mg/mL的溶液，取10μL注入凝膠色譜儀分析。以葡聚糖對照品的lgMw為縱坐標，以洗脫體積VR為橫坐標，通過GPC軟件繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y=－0.623x+9.302(r2=0.990)，計算得到麥冬多糖的Mn為1888 g/mol、Mw為 2376 g/mol、Mz為 2807 g/mol、Mp為 1971 g/mol，PD為1.23。分散系數(shù) PD=Mw/Mn，用來表征分散程度。PD越大，說明相對分子質(zhì)量越分散，PD=1，說明相對分子質(zhì)量呈單分散。麥冬多糖的PD為1.23＜2，表明其分散度較小。

2.3 MALDI-TOF-MS測定方法 采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法對麥冬多糖的相對分子質(zhì)量及其分布進行分析。方法為:將基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸(DHB)及多糖樣品均配成10 mg/mL水溶液，等體積混合均勻。采用滴液干燥法，取混合溶液0.5μL滴于樣品靶上，室溫晾干后，送入離子源進行測定。質(zhì)譜條件為固體激光器頻率200 Hz，反射正離子模式，譜圖累加激光點400個。

圖2為MALDI-TOF-MS結(jié)果的部分放大圖。由圖可見，每個聚合度的麥冬多糖出現(xiàn)3個系列的規(guī)律性加合離子峰，表1列出了圖2中3個系列加合離子峰所對應(yīng)的m/z值，每組系列峰中相鄰兩峰之間的m/z值均相差162，與1個己糖殘基的質(zhì)量相符，說明組成麥冬多糖的糖殘基單元為己糖。S1系列可能為環(huán)狀己聚糖或己聚糖脫水后的加鈉離子峰，S2為線形己聚糖的加鈉離子峰，S3為線形己聚糖的加鉀離子峰。結(jié)果表明，麥冬多糖樣品中主要存在線形和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的己聚糖，相對分子質(zhì)量分布范圍主要在200～4000 g/mol之間。

圖2 麥冬多糖的MALDI-TOF-MS部分放大圖Fig.2 Part enlarge MALDI-TOF-MS spectrum of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

表1 麥冬多糖MALDI-TOF-MS圖中3個系列離子峰歸屬Tab.1 Assignment of the ion peaks in MS spectrum of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

通過MALDI-TOF-MS儀器的分析軟件計算得到麥冬多糖的 Mn為486 g/mol、Mw為721 g/mol、Mz為1094 g/mol，分散度為1.49。

2.4 SEC-LALLS測定方法 采用Viscotek GPC-max-TDA305多檢測器GPC/SEC系統(tǒng)對麥冬多糖的相對分子質(zhì)量進行進一步分析。方法為:在室溫條件下，將麥冬多糖(7.22 mg/mL)溶于0.1 mol/L NaNO3溶液中，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液進GPC/SEC系統(tǒng)進行分析。采用1 x A6000M色譜柱(Viscotek)，流動相為0.1 mol/L NaNO3，體積流量為0.7 mL/min，柱溫為35℃，檢測器溫度為35℃，dn/dc值為0.14，對照品為聚氧乙烯和葡聚糖，進樣量為100μL。

以SEC-LALLS法測定得到的麥冬多糖的三重檢測器響應(yīng)色譜圖如圖3所示。

圖3 麥冬多糖的SEC-LALLS色譜圖Fig.3 SEC-LALLS spectrogram of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

由圖3可知，隨著保留體積的增大，麥冬多糖相對分子質(zhì)量的對數(shù)曲線從大到小分布，各個檢測器的響應(yīng)信號平滑、對稱、沒有拖尾，說明該SEC-LALLS分離、測定條件適合麥冬多糖的相對分子質(zhì)量測定。由圖3可見，黏度信號峰值最高點的保留體積小于示差檢測器信號峰值最高點的保留體積，這是因為分子排阻色譜使得相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)優(yōu)先從色譜柱洗脫出來，同樣的濃度下，對相對分子質(zhì)量大小有響應(yīng)的黏度信號大于示差檢測器信號;隨著麥冬多糖相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)被洗脫出來，黏度信號小于示差檢測器信號，符合各檢測器響應(yīng)特性規(guī)律。

麥冬多糖的重量百分比(相對分子質(zhì)量分布)、累積重量比、Mark-Houwink曲線與相對分子質(zhì)量(Da)的分析圖見圖4。麥冬多糖樣品平行實驗的計算結(jié)果如表2。

通過Rayleigh光散射方程和表2可得麥冬多糖的相對重均分子質(zhì)量為3962 g/mol，平均分散度為1.49，流體力學(xué)半徑為1.3 nm。圖4中特性黏度曲線的斜率即為Mark-Houwink a值，a值小于0.3樣品為球狀結(jié)構(gòu)，a值在0.7左右樣品為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，a值為0.45，說明麥冬多糖樣品在水相的構(gòu)象介于球狀和無規(guī)卷曲之間。

3 討論

圖4 麥冬多糖的重量百分比(相對分子質(zhì)量分布)，累積重量比和Mark-Houwink曲線圖譜Fig.4 Normalized weight fraction，Cumulativeweightfraction and Mark-Houwink spectrogram of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

表2 麥冬多糖的SEC-LALLS測定結(jié)果Tab.2 SEC-LALLS determination results of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

HPGPC-ELSD法是一種平均相對分子質(zhì)量的相對測定方法。在測定過程中，需采用相對分子質(zhì)量已知的多糖對照品建立LogMw-VR標準曲線，計算被測樣品的相對分子質(zhì)量。然而，凝膠色譜分離是基于尺寸篩分離原理，樣品在色譜柱上的保留時間不僅與其相對分子質(zhì)量有關(guān)，還與分子的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。相對分子質(zhì)量相同的線性結(jié)構(gòu)和球狀結(jié)構(gòu)分子，表觀尺寸差異很大，導(dǎo)致保留體積不同。可見，HPGPC-ELSD結(jié)果的準確性主要取決于樣品和對照品在空間結(jié)構(gòu)上的相似性。采用HPGPC-ELSD法測定的麥冬多糖相對分子質(zhì)量結(jié)果較SECLALLS法小，是由于麥冬多糖樣品在水相的構(gòu)象介于球狀和無規(guī)卷曲之間，與葡聚糖標樣空間結(jié)構(gòu)存在差異造成的。

MALDI-TOF-MS在檢測模式上有正、負離子檢測模式，多數(shù)情況下采用正離子檢測模式，因為負離子模式下檢測效率相對較低。檢測方式有線性方式和反射方式兩種，線性方式受低分子的影響較大，其主要測定相對分子質(zhì)量大于10000 g/mol的物質(zhì)，當相對分子質(zhì)量小于10000 g/mol時，采用反射方式。麥冬多糖的相對分子質(zhì)量分布在200～4000 g/mol之間，因此本試驗在反射正離子模式下，對麥冬多糖相對分子質(zhì)量及其分布進行了測定。MALDI-TOF-MS的相對分子質(zhì)量測定結(jié)果與其他方法相比明顯偏小，這可能是由于在低質(zhì)荷比區(qū)域質(zhì)譜圖受基質(zhì)干擾嚴重，且麥冬多糖的加合離子峰強度隨m/z的增大而降低，使計算得到的平均相對分子質(zhì)量偏低，分散系數(shù)增大。因此，MALDI-TOF-MS并不適合于測定相對分子質(zhì)量較小的多糖的平均相對分子質(zhì)量，但仍可以提供相對分子質(zhì)量分布信息。同時，MALDI-TOF-MS還能夠提供多糖的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的相對分子質(zhì)量信息，用于推測其結(jié)構(gòu)、組成等。

SEC-LALLS可獲得樣品洗脫圖中每一洗脫體積點的相對分子質(zhì)量以及樣品的相對分子質(zhì)量分布。分子排阻色譜實現(xiàn)不同相對分子質(zhì)量高聚物分子的分離，分子按大小順序依次進入激光光散射檢測器，通過Rayleigh光散射方程直接計算出相對分子質(zhì)量Mw、Mn、Mz和 Mp及相對分子質(zhì)量分布，不需要對照品對照以繪制標準曲線。該法操作簡便，高效、誤差小。而且黏度檢測器還可以得到樣品在溶液中的結(jié)構(gòu)形態(tài)信息，包括流體力學(xué)體積Vh、流體力學(xué)半徑 Rh、以及Mark-Houwink曲線、Mark-Houwink曲線a值、K值。本實驗過程中，聚氧乙烯是窄相對分子質(zhì)量分布標樣，用來建立方法(包括測定儀器常數(shù)和校正各檢測器之間的響應(yīng)時間);葡聚糖是寬相對分子質(zhì)量分布標樣，用來驗證聚氧乙烯建立的方法。dn/dc值(散射光角度和折光指數(shù)增量)與溶劑、樣品單體結(jié)構(gòu)、溫度等因素有關(guān)，與樣品相對分子質(zhì)量無關(guān)，可通過阿貝折光儀測定得到。麥冬多糖在水相的dn/dc值通常處于0.13～0.15之間，因此本實驗用0.14計算。

4 結(jié)論

本實驗采用HPGPC-ELSD法、MALDI-TOF-MS法和SEC-LALLS法對麥冬多糖的相對分子質(zhì)量及其分布進行了測定。HPGPC-ELSD法是一種相對分子質(zhì)量相對測定法，多糖相對分子質(zhì)量測定結(jié)果的準確性取決于樣品與對照品結(jié)構(gòu)的相似性。MALDI-TOF-MS法是一種相對分子質(zhì)量測定的絕對方法，無需對照品，但測得的麥冬多糖相對重均分子質(zhì)量誤差較大，該方法更適合用于多糖單元結(jié)構(gòu)等信息的獲取。SEC-LALLS法也是一種相對分子質(zhì)量測定的絕對方法，適合于多糖相對分子質(zhì)量及分布測定，還可以獲得樣品在溶液中的結(jié)構(gòu)形態(tài)信息，是一種較為理想的相對分子質(zhì)量及其結(jié)構(gòu)測定方法，但目前該儀器的普及率還不高。本實驗的研究結(jié)果為多糖類化合物相對分子質(zhì)量測定方法的選擇提供了參考，也可為麥冬多糖藥物質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。

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