董娟妮，閆高穎，楊 洋，王世祥，鄭 靜，劉勤社，2，鄭曉暉，3*

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069;2.陜西省人民醫(yī)院，陜西西安 710068;3.深圳清華大學(xué)研究院，廣東深圳 518057)

樂脈膠囊是由丹參、川芎、赤芍、紅花、香附等七味中藥制成，具有行氣活血、化瘀通脈的功效，用于治療氣滯血瘀所致的頭痛、眩暈、胸痛、心悸、冠心病、心絞痛、多發(fā)性腦梗死等［1］。丹參中水溶性成分丹參素、原兒茶醛等和脂溶性成分丹參酮ⅡA，均具有抗氧化作用、保護內(nèi)皮細(xì)胞和舒張血管的作用;川芎和紅花中的阿魏酸對腦缺血性損傷具有保護作用;赤芍中的芍藥苷具有擴張血管、改善微循環(huán)和抗氧化等作用;紅花中的羥基紅花黃色素A具有抗氧化和保護神經(jīng)損傷的作用［2-6］。目前關(guān)于樂脈膠囊的質(zhì)量控制主要集中于丹參素、芍藥苷、阿魏酸和羥基紅花黃色素A等單一成分測定［7-13］，但對樂脈膠囊中的丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A和α-香附酮的多成分同時測定尚未見報道。為能夠更全面控制藥品的質(zhì)量，本實驗建立了HPLC法同時測定樂脈膠囊中丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛等9種有效成分，為進一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent公司1100系列高效液相色譜系統(tǒng)(包括二元泵，DAD檢測器，Agilent Chemstation工作站);KQ5200DE型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);BP25S電子天平(德國賽多利斯公司);VORTEX QILINBETER-6快速混勻器;CENIUS-16K離心機等。

1.2 藥品與試劑 樂脈膠囊(陜西華龍制藥有限公司，規(guī)格為0.4 g/粒，12粒/板，3板/盒，批號分別為 20110601、20110401、20110101);丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素 A對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110855-200506、 0766-200011、 110810-200205、 110809-200503、 0773-9910、 1100831-200302、 110736-200933、111637-200905);α-香附酮對照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號X-038-111209，純度＞99%);甲醇為色譜純(美國Fisher公司);甲酸為分析純(天津市化學(xué)試劑三廠);其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相A為0.2%甲酸水溶液，B相為甲醇，梯度洗脫(0～32 min，35% ～60%B;32～37 min，60% ～87%B;37～60 min，87%～89%B);檢測波長為 280 nm(0～20 min)，403 nm(20～22 min)，230 nm(22～26 min)，320 nm(26～45 min)，254 nm(45～60 min);體積流量為0.6 mL/min;柱溫為30℃;進樣量20.0μL。此色譜條件下，樣品溶液中丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、α-香附酮均得到較好分離。圖1為對照品、樣品、陰性樣品色譜圖。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取丹參素60.0 mg、丹參酮ⅡA 1.70 mg、原兒茶醛30.0 mg、原兒茶酸3.00 mg、阿魏酸2.90 mg、沒食子酸17.0 mg、芍藥苷25.0 mg、羥基紅花黃色素 A 52.0 mg、α-香附酮20.0 mg分別置于10 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，即得各對照品溶液。精密量取各對照品溶液適量，加50%甲醇溶液混勻定量稀釋成含丹參素500.0μg/mL、丹參酮ⅡA 100.0μg/mL、原兒茶醛 250.0μg/mL、原兒茶酸250.0μg/mL、阿魏酸 170.0μg/mL、沒食子酸1000.0μg/mL、芍藥苷 2000.0μg/mL、羥基紅花黃色素 A 460.0μg/mL、α-香附酮 100.0μg/mL 的混合對照品溶液，4℃冷藏備用。

2.3 供試品溶液的制備 取5粒樂脈膠囊，取出內(nèi)容物混勻，精密稱取2.0 g樂脈膠囊內(nèi)容物，置20 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，稱定質(zhì)量，渦旋5 min，浸泡1 h，超聲處理40 min，補足減失的質(zhì)量，搖勻，9000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45μm濾膜過濾，即得供試品溶液。4℃冷藏備用。

2.4 陰性供試品溶液的制備 丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、沒食子酸、丹參酮ⅡA、阿魏酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A和α-香附酮分別來源于丹參、赤芍、川芎、紅花、香附五味藥材，按藥典中樂脈膠囊的生產(chǎn)工藝［1］制備缺丹參、赤芍、川芎、紅花、香附的陰性制劑，并按照2.3項下的制備方法制備陰性供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項下混合對照品溶液，用50%甲醇配制成系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液(丹參素為 5.0，25.0，50.0，100.0，250.0，500.0μg/mL;丹參酮ⅡA、α-香附酮為1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0μg/mL;原兒茶酸、原兒茶醛為2.5，12.5，25.0，50.0，125.0，250.0μg/mL;阿魏酸為 1.7，8.5，17.0，34.0，85.0，170.0μg/mL;沒食子酸為10.0，50.0，100.0，200.0，500.0，1000.0μg/mL;芍 藥 苷 為 20.0，100.0，200.0，400.0，1000.0，2000.0 μg/mL;羥基紅花黃色素 A為 4.6，23.0，46.0，92.0，230.0，460.0μg/mL)。按照擬定色譜條件連續(xù)進樣20.0μL，分別重復(fù)3次，記錄峰面積。以對照品溶液質(zhì)量濃度(X，μg/mL)對峰面積(Y)進行線性回歸，呈良好的線性關(guān)系(表1)。

表1 9種有效成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of nine components

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20.0μL(含原兒茶醛、原兒茶酸均為 12.5μg/mL;丹參酮ⅡA、α-香附酮均為 5.0μg/mL;丹參素25.0μg/mL;沒食子酸50.0μg/mL;阿魏酸8.5μg/mL;芍藥苷100.0μg/mL;羥基紅花黃色素A 23.0μg/mL)，按照擬定色譜條件連續(xù)進樣6次，計算丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A和α-香附酮峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.61%、0.74%、2.20%、1.37%、2.02%、0.99%、1.53%、2.81%、1.17%，表明其精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樂脈膠囊樣品(批號:20110601)，按照2.3項方法分別制備6份供試品溶液，按照擬定色譜條件測定，丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A和α-香附酮峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.04%、2.93%、1.08%、 3.13%、 1.55%、 2.27%、 2.51%、2.32%、2.70%，表明其重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 制備樂脈膠囊樣品溶液(批號20110601)，室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12 h，按照擬定色譜條件分別進樣20.0μL，丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A和α-香附酮峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.73%、2.41%、2.02%、 2.38%、 1.95%、 2.79%、 3.04%、2.57%、1.22%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗 稱取已知含有量樂脈膠囊內(nèi)容物0.2 g(批號20110601)，平行6份，分別置2.0 mL量瓶中，分別精密加入6.000 mg/mL丹參素 0.045 mL(丹參素 0.2700 mg);0.170 mg/mL丹參酮ⅡA 0.020 mL(丹參酮ⅡA 0.0034 mg);3.000 mg/mL原兒茶醛0.005 mL(原兒茶醛0.0150 mg);0.300 mg/mL原兒茶酸0.035 mL(原兒茶酸0.0105 mg);0.290 mg/mL阿魏酸0.010 mL(阿魏酸0.0029 mg);1.700 mg/mL沒食子酸0.450 mL(沒食子酸0.7650 mg);2.500 mg/mL芍藥苷0.400 mL(芍藥苷1.0000 mg);5.200 mg/mL羥基紅花黃色素A 0.045 mL(羥基紅花黃色素 A 0.2340 mg);2.000 mg/mL α-香附酮0.005 mL(α-香附酮0.0100 mg)，按照2.3項方法制備供試品溶液，按照擬定色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率(n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

由表2可知，丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A和α-香附酮的平均回收率均大于95.0%。結(jié)果表明方法回收率良好。

2.10 樣品測定 按2.3項下方法制備供試品溶液，按照擬定色譜條件進樣20.0μL，每批樣品平行測定3次，記錄峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A和α-香附酮的量。測定結(jié)果見表3。

表3 樂脈膠囊中有效成分的測定(，n=3)Tab.3 Determination of components in Lemai Capsules(，n=3)

表3 樂脈膠囊中有效成分的測定(，n=3)Tab.3 Determination of components in Lemai Capsules(，n=3)

批號 各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g－1)丹參素 丹參酮ⅡA 原兒茶醛 原兒茶酸 阿魏酸 沒食子酸 芍藥苷 羥基紅花黃色素 α－香附酮20110601 1.3419±0.00270.0680±0.000820110401 1.3489±0.00190.0158±0.00020.0903±0.00190.0512±0.00060.0171±0.00013.8880±0.04715.3455±0.00391.2063±0.02850.0650±0.001520110101 1.3454±0.00260.0159±0.00020.0857±0.00130.0488±0.00110.0169±0.00023.9255±0.03415.3378±0.00111.2554±0.03180.0164±0.00050.0904±0.00060.0508±0.00070.0179±0.00013.8780±0.00075.3375±0.00061.2963±0.00580.0520±0.0016

3 討論

3.1 樣品溶液的制備 在樣品溶液的制備中，本實驗采用不同比例提取溶劑(純水、20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、65%甲醇、80%甲醇、100%甲醇)超聲40 min，結(jié)果表明:純水和20%甲醇不能提取出α-香附酮和丹參酮ⅡA，80%甲醇和100%甲醇提取丹參素、羥基紅花黃色素A等水溶性成分的量明顯減少，40%甲醇、50%甲醇與65%甲醇超聲提取相比，50%甲醇比40%甲醇提取的α-香附酮和丹參酮ⅡA量明顯增加，其他成分的量無明顯變化，50%甲醇比65%甲醇提取的沒食子酸、丹參素、原兒茶醛量明顯增加，其他成分的量無明顯變化。同時對提取時間進行了考察，以50%甲醇為提取溶劑，分別超聲20、40和60 min，結(jié)果40 min與60 min提取結(jié)果基本一致，表明超聲提取40 min時基本提取完全。最終采用50%甲醇提取溶劑超聲40 min為最佳提取方法。

3.2 流動相的選擇 文獻(xiàn)多采用甲醇-磷酸緩沖液、乙腈-甲酸水不同比例等度洗脫，結(jié)果表明，只有一種成分被很好的分離?？紤]到樣品中含有水溶性成分和脂溶性成分，無法采用等度洗脫的方法同時對9種成分進行分離。經(jīng)實驗考察，采用0.2%甲酸水和甲醇為流動相進行梯度洗脫，9種成分均能實現(xiàn)良好分離(R＞1.5)。

3.3 檢測波長的選擇 經(jīng)全波長掃描，芍藥苷在230 nm處有最大吸收，原兒茶酸和α-香附酮在254 nm處有最大吸收，沒食子酸、丹參素、原兒茶醛和丹參酮ⅡA在280 nm處有最大吸收，阿魏酸在320 nm處有最大吸收，羥基紅花黃色素A在403 nm處有最大吸收，故選擇230 nm、254 nm、280 nm、320 nm、403 nm五種波長，采用階梯掃描的方式，對9種待測成分進行分離及最大波長下檢測。

樂脈膠囊的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅選擇了赤芍中的芍藥苷作為定量測定指標(biāo)［1］。為能夠更全面地控制其質(zhì)量，本實驗建立了HPLC法同時測定樂脈膠囊中丹參素、丹參酮ⅡA、原兒茶醛、原兒茶酸、阿魏酸、沒食子酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A和α-香附酮9種有效成分的方法，結(jié)果穩(wěn)定可靠，方法簡便可行，可用于該制劑的鑒別和質(zhì)量控制。

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