雷 昌，夏新華，黃瑪莎，沈芹芹，彭買(mǎi)嬌

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410208)

茵陳為菊科多年生草本植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst.et kit.或茵陳蒿 Artemisia capillaries Thunb.的干燥地上部分。茵陳原名茵陳蒿，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、辛，性微寒;歸胃、脾、膽、肝經(jīng)，具有清濕熱，退黃疸的功能，可用于治療黃疸尿少、濕瘡瘙癢、傳染性黃疸型肝炎等癥［1-2］。茵陳的化學(xué)成分主要有香豆素類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、色原酮類(lèi)及揮發(fā)油等［3-4］。

殼聚糖化學(xué)名為(1，4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，是甲殼素脫乙?；蟮囊环N產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于纖維素。目前，殼聚糖絮凝澄清工藝近年來(lái)研究較多，被同行認(rèn)為有望廣泛推廣［5-8］的新型的中藥水提液純化方法，研究表明其除雜效果明顯優(yōu)于水提醇沉法，并具有操作簡(jiǎn)單、高效、安全和降低成本及降低浸膏吸濕性的優(yōu)點(diǎn)［9-10］;同時(shí)殼聚糖在緩釋、控釋制劑［11-13］、納米微粒靶向制劑的應(yīng)用上有著獨(dú)特的物化性質(zhì)、生物相容性和生理活性。本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖絮凝澄清工藝和醇沉工藝對(duì)茵陳水提液的純化進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)去除效果、固形物與綠原酸的保留率、以及吸濕性等方面與醇沉法進(jìn)行了比較，可為合理選擇中藥水提液純化工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀;SP—756型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);AR1140電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司);DF101-S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng));KQ5200BE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TD5A—WS臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司);RE52—99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng));DZF—6050型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

茵陳(安徽惠隆中藥飲片有限公司，批號(hào)20110401);綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院110753-200413);殼聚糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20091203);苯酚(AR，湖南匯虹試劑有限公司，20090824);考馬斯亮藍(lán)G-250(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純);無(wú)水葡萄糖(中國(guó)藥品生物制品檢定所110833-200904);乙腈為色譜純，乙醇為分析純，水為純化水。

1%殼聚糖溶液的配制 取殼聚糖5g，加1%醋酸500 mL，靜置24 h，攪拌均勻，即得。

5%苯酚試液的配制 取苯酚5g，加蒸餾水定容至100 mL，搖勻，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 茵陳水提液的制備 取茵陳飲片1 kg，第1次加15倍量水煎煮2 h，第2次加10倍量水煎煮1.5 h，濾過(guò)，濾液備用。取上述濾液于70℃減壓濃縮(－0.08 MPa)，離心，取上清液(均勻分成2份)，備用。

2.2 茵陳水提液的純化處理

2.2.1 醇沉法處理 取上述上清液1份，等分成3份，分別濃縮至相對(duì)密度為1.15、1.20、1.25，每份再等分為3份，再緩緩加入95%乙醇使藥液含醇量分別為50%、60%、70%，繼續(xù)攪拌15 min后，靜置24 h，濾過(guò)，收集濾液，備用。

2.2.2 殼聚糖絮凝澄清法處理 取上述上清液1份，等分成3份，分別濃縮至藥液比(生藥量-藥液體積之比)為1∶2、1∶4、1∶6，每份再等分3份，置于水浴加熱至70℃，再緩緩加入1%殼聚糖溶液(按藥液所含生藥量計(jì)算，分別為每1 g生藥加入0.6、1.0、1.4 mL)，繼續(xù)攪拌15 min后，靜置24 h，濾過(guò)，收集濾液，備用。

2.3 茵陳水提液純化樣品的測(cè)定

2.3.1 浸膏得率的測(cè)定 取適量上述醇沉和絮凝工藝后所得濾液，分別經(jīng)減壓濃縮、真空干燥(65℃)至恒定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。結(jié)果表明，茵陳水提液經(jīng)2種純化工藝處理后其浸膏得率有一定的差異，且經(jīng)絮凝工藝處理后其浸膏得率明顯高于醇沉工藝。

2.3.2 茵陳HPLC指紋圖譜條件的建立和綠原酸的測(cè)定

(1)色譜條件 Kromasil ODS-1 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相乙腈－0.05%磷酸水溶液(10∶90);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm;進(jìn)樣量10μL。

(2)對(duì)照品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品適量，加50%甲醇溶解制成每1 mL含0.063 mg的對(duì)照品溶液。精密取取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10μL，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定其峰面積積分值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到回歸方程為 Y=2992.2X－14.3，R2=0.9990，表明綠原酸在0.126～0.630μg具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

(3)供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定經(jīng)純化后的茵陳浸膏至具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，浸泡20 min，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減輕的質(zhì)量，搖勻，離心，精密量取上清液5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，棄初濾液，取續(xù)濾液，即得。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一茵陳供試品溶液10μL，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄綠原酸的峰面積。結(jié)果RSD為2.22%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

(5)精密度試驗(yàn) 精密量取同一茵陳供試品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄綠原酸的峰面積。結(jié)果RSD為1.47%，表明儀器精密度良好。

(6)重復(fù)性試驗(yàn) 按上述2.3.2項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法平行配制6份供試品溶液，再分別精密量取其供試品溶液10μL，記錄綠原酸的峰面積。結(jié)果RSD為1.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

(7)加樣回收試驗(yàn) 取已知量(綠原酸為0.09%)的供試品溶液6份，分別加入綠原酸對(duì)照品適量，按上述2.3.2項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，同上記錄綠原酸的峰面積，計(jì)算平均回收率為100.3%，RSD值為2.65%。

(8)樣品測(cè)定 取經(jīng)2種純化后的茵陳浸膏樣品適量，按上述方法測(cè)定綠原酸的量。結(jié)果表明，茵陳水提液經(jīng)殼聚糖絮凝法處理后其綠原酸的含量與醇沉法相近(見(jiàn)表1～2)。

2.3.3 蛋白質(zhì)與鞣質(zhì)的檢測(cè) 按照歐金秀［14］蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)的檢查方法，對(duì)2種純化工藝除去蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)的效果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，醇沉處理后的溶液蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)檢查呈陽(yáng)性，而經(jīng)絮凝純化處理后的溶液檢查呈陰性，表明殼聚糖絮凝工藝除去蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)的效果優(yōu)于醇沉工藝。

表1 茵陳水提液經(jīng)醇沉法處理后的浸膏得率和綠原酸的量Tab.1 Extract yield and chlorogenic acid content of water extract from Herba artemisiae that was disposed by alcohol precipitation process

表2 茵陳水提液經(jīng)殼聚糖絮凝澄清法處理后的浸膏得率和綠原酸的量Tab.2 Extract yield and chlorogenic acid content of water extract from Herba artemisiae that was disposed by chitosan flocculation clarification process

2.3.4 單糖、低聚糖和總多糖的測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 按照楚笑輝［10］單糖、低聚糖和總多糖測(cè)定的方法，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為:Y=0.0086X+0.0036，R2=0.9994，表明葡萄糖質(zhì)量濃度在9～90μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

(2)單糖-低聚糖測(cè)定 精密稱(chēng)取經(jīng)2種純化方法所得浸膏適量，加80%乙醇超聲后定容至10 mL，再精密吸取上清液2 mL定容至25 mL，即得單糖-低聚糖供試品溶液。精密吸取供試品溶液1.0 mL，按上述2.3.4項(xiàng)下“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制”方法測(cè)定吸光值，計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖1A。

(3)總多糖測(cè)定 精密稱(chēng)取經(jīng)2種純化方法所得浸膏適量，加適量蒸餾水超聲溶解后定容至10 mL，再精密吸取2 mL定容至25 mL，即得總糖供試品溶液。精密吸取供試品溶液1.0 mL，按上述2.3.4項(xiàng)下“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制”方法測(cè)定吸光值，計(jì)算得出總糖的量?？偺堑牧繙p去單糖-低聚糖含量即得總多糖的量，結(jié)果見(jiàn)圖1B。

圖1 兩種純化工藝所得樣品總多糖和低聚糖、單糖保留率的平均值Fig.1 Polysaccharide and oligosaccharide，monosaccharide retention rate of the average value of two purification processes

由圖1可見(jiàn)，殼聚糖絮凝工藝對(duì)茵陳水提液中總多糖和單糖-低聚糖保留率均高于醇沉工藝。

2.3.5 兩種純化方法對(duì)茵陳水提浸膏吸濕性的影響

(1)吸濕百分率的測(cè)定 按照楊磊［15］對(duì)兩種純化方法對(duì)丹皮水提浸膏吸濕性的研究方法，以平均吸濕百分率(%)為縱坐標(biāo)，時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果表明在RH為75%的實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)殼聚糖絮凝澄清工藝處理后的浸膏粉末的吸濕性較醇沉工藝處理后的浸膏粉末有一定程度下降。(見(jiàn)圖2)。

(2)臨界相對(duì)濕度的測(cè)定 按照楊磊［15］對(duì)兩種純化方法對(duì)丹皮水提浸膏吸濕性的研究方法，以吸濕百分率(%)為縱坐標(biāo)，相對(duì)濕度(RH%)為橫坐標(biāo)作圖，曲線(xiàn)兩端的切線(xiàn)，兩切線(xiàn)交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為臨界相對(duì)濕度(CRH)。

茵陳水提液經(jīng)殼聚糖絮凝澄清工藝處理后所得9份浸膏的平均CRH為72%，經(jīng)醇沉處理后所得9份浸膏的平均CRH為66%。而CRH是水溶性藥物的固有特征，是藥物吸濕性大小的衡量指標(biāo)，藥物的CRH越小則越易吸濕;反之則不易吸濕。因此表明茵陳水提液經(jīng)殼聚糖絮凝澄清工藝處理后其干浸膏的吸濕性低于醇沉工藝。

圖2 兩種純化方法所得浸膏的吸濕曲線(xiàn)Fig.2 Moisture absorption curve of concrete of two purification processes

2.3.6 殼聚糖絮凝澄清法與醇沉法對(duì)茵陳化學(xué)成分影響的研究

(1)茵陳HPLC指紋圖譜的繪制 按2.3.2項(xiàng)下方法建立茵陳HPLC指紋圖譜，如圖3所示為茵陳水提液經(jīng)2種純化方法處理后所得樣品的HPLC指紋圖譜的共有模式圖。

圖3 茵陳水提液純化樣品HPLC指紋圖譜共有模式圖(S1～S9-醇沉工藝樣品，S10～S18-殼聚糖工藝樣品，S19-綠原酸對(duì)照品)Fig.3 HPLC fingerprint spectrum of pattern of water extract from Herba artemisiae that was disposed by purification process(S1～S9-alcohol sinking process samples，S10 ～ S18-chitosan samples，S19-chlorogenic acid reference substance)

(2)茵陳水提液二種純化樣品HPLC指紋圖中各組分相對(duì)表觀含量的比較 以綠原酸色譜峰(圖3中4號(hào)峰)為參比，根據(jù)綠原酸對(duì)照品溶液的濃度和峰面積積分值，計(jì)算2種純化樣品HPLC指紋圖譜中各組分的表觀含量，并按下式求出二種純化樣品各組分的相對(duì)表觀含量，同時(shí)繪制二種純化樣品各組分平均相對(duì)表觀含量的折線(xiàn)圖(見(jiàn)圖4)。

圖4 茵陳水提液二種純化樣品HPLC指紋圖譜中各組分相對(duì)表觀含量折線(xiàn)圖Fig.4 HPLC fingerprint spectrum of each component relative content of apparent line chart of water extract from Herba artemisiae that was disposed by two purification processes

由圖4結(jié)合圖3分析可知，茵陳中保留時(shí)間較短的組分(1～2號(hào)峰)在醇沉樣品中的相對(duì)表觀含量明顯低于殼聚糖絮凝澄清樣品，保留時(shí)間居中的組分(3～6號(hào)峰)在醇沉樣品中的相對(duì)表觀含量與殼聚糖絮凝澄清樣品基本相同，而保留時(shí)間較長(zhǎng)的組分(7～8號(hào)峰)在醇沉樣品中的相對(duì)表觀含量明顯高于殼聚糖絮凝澄清樣品。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)以茵陳藥材為研究對(duì)象，較為系統(tǒng)地考察了殼聚糖絮凝澄清工藝與醇沉工藝對(duì)其水提液中所含糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、綠原酸及浸膏得率和浸膏吸濕性的影響。結(jié)果表明，茵陳水提液經(jīng)殼聚糖絮凝澄清工藝處理后其浸膏的吸濕性低于醇沉工藝;浸膏得率、糖類(lèi)所含有量均高于醇沉工藝(其中對(duì)多糖的保留明顯優(yōu)于醇沉工藝);有效成分綠原酸的保留量與醇沉工藝較為接近;同時(shí)殼聚糖絮凝工藝除去蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)的效果優(yōu)于醇沉工藝，這些與早期的研究結(jié)果相類(lèi)似［10，14］。

3.2 本實(shí)驗(yàn)建立了茵陳水提液純化樣品的HPLC指紋圖譜，并以表觀含量與相對(duì)表觀含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較了二種純化工藝對(duì)茵陳水提液中各化學(xué)成分的影響。結(jié)果表明，兩種指紋圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)經(jīng)兩種純化工藝所處理的樣品，有效成分按極性可分為三部分，即相對(duì)親水性部分、相對(duì)中等極性部分和相對(duì)親脂性部分。殼聚糖絮凝澄清法所得藥液親水性部分(在反相HPLC色譜圖中保留時(shí)間短的組分)含量明顯高于醇沉所得藥液，且隨著極性減小兩種方法所得藥液化學(xué)成分含有量差異變小，當(dāng)極性減小到一定程度時(shí)醇沉所提純藥液含有量明顯高于殼聚糖絮凝澄清法所提純藥液，且隨著親脂性化學(xué)成分(在反相HPLC色譜圖中保留時(shí)間長(zhǎng)的組分)的增大含量越高。該研究成果對(duì)中藥制劑的純化精制具有指導(dǎo)價(jià)值，可根據(jù)兩種中藥純化工藝對(duì)中藥成分含有量的影響規(guī)律，結(jié)合所需純化中藥水提液有效成分的極性大小選用合適的純化方法，以提高有效成分含量從而保證中藥制劑質(zhì)量。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2005年版一部［S］.北京:化學(xué)理工出版社，2005:166.

［2］徐建國(guó)，田呈瑞，胡青平，等.綿菌陳中綠原酸的提取工藝研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)通報(bào)，2007，23(9):162-165.

［3］褚明艷，胡一橋，譚仁祥.茵陳蒿的化學(xué)及藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中草藥，1998，29(8):564-566.

［4］謝 韜，梁敬鈺，劉 凈.茵陳化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2004，16(1):8-13.

［5］顏 紅.天然澄清劑在中藥水提液澄清工藝中的應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，11(1):80.

［6］張來(lái)華，王 博.中藥水提液純化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5(7):154-157.

［7］龔慕辛，賈春伶.天然澄清劑在中藥提取液精制中的應(yīng)用［J］.北京中醫(yī)，2001，20(6):43-45.

［8］祝連彩，王伯初.殼聚糖在中藥藥液澄清中的應(yīng)用［J］.重慶大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003，26(12):55-57.

［9］郭立偉.中藥分離原理與技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:258

［10］楚笑輝，唐路梅，夏新華.殼聚糖絮凝澄清工藝與醇沉工藝純化乙肝寧復(fù)方水提液的對(duì)比研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(21):1-5.

［11］楊紅梅，陳 旭，趙坤杰.阿司匹林殼聚糖緩釋片兔體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2004，19(5):21-32.

［12］陳 麗，葛為公，裴世成，等.蘆丁殼聚糖緩釋片處方設(shè)計(jì)及體外釋放度測(cè)定［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27(2):135-136.

［13］徐甲坤，畢彩豐，范玉華，等.羥甲基殼聚糖水凝膠制備在藥物控釋中應(yīng)用［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，37(3):503-506.

［14］歐金秀，夏新華.絮凝澄清技術(shù)與醇沉工藝用于精制乙肝寧水提液的對(duì)比研究［D］.長(zhǎng)沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

［15］楊 磊.殼聚糖絮凝澄清法降低中藥材水提浸膏吸濕性機(jī)理的研究［D］.長(zhǎng)沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012.