何 峰，牟景麗，張治蓉，鄭 林，王永林，黃 勇*

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽(yáng) 550004;2.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550004)

赤芍為毛茛科植物芍藥 Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根，性味苦、微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀止痛之功能，主要用于治療溫毒發(fā)斑、目赤腫痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲損傷、肝郁脅痛等癥［1-2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，赤芍富含的各種單萜及苷類成分具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用［3-5］，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷為赤芍中主要單萜苷類成分［6-7］，藥物動(dòng)力學(xué)研究有助于解釋并預(yù)測(cè)與藥物作用和毒性有關(guān)的現(xiàn)象，是藥物治療的基礎(chǔ)，因此本實(shí)驗(yàn)以氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷為指標(biāo)性成分，研究大鼠靜脈注射赤芍提取物后體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)特征，為赤芍的物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明及臨床用藥的安全性和有效性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司);Allegra 64R高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司);ZH—2渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠);MTN—2800D氮吹儀(天津奧特塞恩斯公司);CQ 250A—TS超聲波清洗機(jī)(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)。

1.2 試劑與試藥 氧化芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)為20120310，純度≥98%)、芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品(批號(hào)為S37—100126，純度≥98%)、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)為20120315，純度≥98%)購(gòu)自江西本草天工科技有限公司，葛根素對(duì)照品(批號(hào)為0752—9605，純度≥98%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;色譜乙腈(德國(guó)Merck公司);水為超純水;其余溶劑均為分析純。

赤芍提取物制備(批號(hào)為20120615) 赤芍15 kg，3次水提，60%乙醇沉淀，用飽和正丁醇再提取，在聚酰胺柱乙醇洗脫，微波真空干燥。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠18只，雌雄兼用，體質(zhì)量為(230±10)g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(黔)2002-0001。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密稱取各對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，獲得氧化芍藥苷(0.97 mg/mL)、芍藥內(nèi)酯苷(0.968 mg/mL)、苯甲酰芍藥苷(0.986 mg/mL)的貯備液，同法配制內(nèi)標(biāo)葛根素貯備液(1 mg/mL)。取葛根素貯備液適量，置25 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，獲得葛根素［8-9］工作溶液(20μg/mL)，置冰箱(－20℃)保存，備用。

2.2 色譜條件 Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7μm);0.1%甲酸乙腈 －0.1%甲酸水梯度洗脫，梯度為0～2 min:5% ～25%，2～3 min:25% ～90%，4 min:5%;體積流量為0.35 mL/min;柱溫45℃ 。進(jìn)樣體積為1μL。

2.3 質(zhì)譜條件 Waters Acquity TQD質(zhì)譜儀，MassLynxV4.1工作站，電噴霧電離源(ESI);毛細(xì)管電壓3 kV;離子源溫度120℃;去溶劑氣溫度350℃;去溶劑氣為氮?dú)?650L/h);碰撞氣為氬氣(0.16 mL/min);掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)，用于定量的正離子對(duì)等質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜條件Tab.1 Mass spectrometric conditions

2.4 血漿樣品處理方法［10-11］取大鼠血漿100μL，依次加入 10μL內(nèi)標(biāo)葛根素溶液(20μg/mL)，50μL 1%甲酸溶液，400μL 乙腈，渦混1 min，15000 r/min離心10 min，取上清液置離心管中，45℃氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?00μL甲醇溶解，離心，取上清1μL進(jìn)樣。

3 結(jié)果

3.1 專屬性 取大鼠空白血漿100μL，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按2.4項(xiàng)下操作，得空白樣品色譜圖A;將氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷混合標(biāo)液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿，依法操作，得相應(yīng)色譜圖B;取大鼠給藥后血漿，依法操作，得相應(yīng)色譜圖C，結(jié)果見(jiàn)圖1。由結(jié)果可以看出氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷分離良好，基質(zhì)無(wú)干擾。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度 取大鼠空白血漿100μL，依次加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y，各物質(zhì)濃度(C)為橫坐標(biāo)X進(jìn)行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X，求的直線方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果3個(gè)成分的線性方程分別為:氧化芍藥苷Y=0.2127X+0.0074(線性范圍0.07～17.32μg/mL，r＞0.9978)、芍藥內(nèi)酯苷Y=0.4525X+0.0089(0.57 ～138.29μg/mL，r＞0.9960)、苯甲酰芍藥苷Y=0.3347X+0.0034(0.07～17.61μg/mL，r＞0.9980);LOD 分別為5.5、7.4、3.7 ng/mL。

圖1 MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms

3.3 準(zhǔn)確度和精密度 按3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下分別配制3個(gè)成分大鼠血漿低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)量控制樣品(QC)，每一個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d。求得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷3個(gè)成分準(zhǔn)確度為81.5%～112.0%;日內(nèi)精密度RSD為2.9%～11.5%;日間精密度RSD為0.8% ～7.4%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大鼠血漿中3種成分的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度(，n=5，3 days)Tab.2 Accuracy，intra-and inter-day precision of the three components(，n=5，3 days)

表2 大鼠血漿中3種成分的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度(，n=5，3 days)Tab.2 Accuracy，intra-and inter-day precision of the three components(，n=5，3 days)

檢測(cè)成分 加入質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) 日內(nèi)精密度RSD/%日間精密度RSD/% 準(zhǔn)確度/%0.07 0.06±0.01 2.93 7.40 81.54氧化芍藥苷 0.64 0.53±0.05 10.12 7.22 83.075.77 5.08±0.58 11.45 3.65 88.070.56 0.55±0.05 9.11 2.55 97.53芍藥內(nèi)酯苷 5.12 4.78±0.41 8.66 0.79 93.3346.09 41.05±3.39 8.27 0.38 89.070.061 0.08±0.01 9.41 6.58 109.40苯甲酰芍藥苷 0.55 0.73±0.06 8.66 4.94 112.044.91 5.13±0.23 4.47 4.21 87.55

3.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察 配制3個(gè)成分的大鼠血漿低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)量控制樣品(QC)，按“2.4項(xiàng)血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，獲得相應(yīng)峰面積值(A);另取空白血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，離心后獲得上清液，加入與上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于30℃氮?dú)獯蹈?，?00μL甲醇復(fù)溶，獲得相應(yīng)峰面積值(B);另取上述低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照溶液50μL與內(nèi)標(biāo)10μL，30℃氮?dú)獯蹈?，殘留物?00μL甲醇復(fù)溶，得相應(yīng)峰面積(C)，每一個(gè)質(zhì)量濃度均以5樣本進(jìn)行分析，內(nèi)標(biāo)同法考察。以A/B(%)計(jì)算提取回收率，B/C(%)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷3個(gè)成分的提取回收率為92.2% ～104.4%，內(nèi)標(biāo)葛根素提取回收率為90.7%;氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷3個(gè)成分基質(zhì)效應(yīng)為85%～115%，內(nèi)標(biāo)葛根素基質(zhì)效應(yīng)為93.6%，表明均不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

3.5 穩(wěn)定性考察 配制氧化芍藥苷等3個(gè)成分的大鼠血漿低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)量控制樣品(QC)，樣品處理后至自動(dòng)進(jìn)樣器中，在0 h，6 h分別進(jìn)樣，以考察處理后血漿樣品中氧化芍藥苷等3個(gè)成分在自動(dòng)進(jìn)樣器條件下的穩(wěn)定性，以每一質(zhì)量濃度3樣本分析。同法配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品(QC)，分別在室溫(約20℃)下放置6 h，4℃下冷藏8 h，凍融3次，經(jīng)處理后進(jìn)樣測(cè)定濃度，以考察血漿中氧化芍藥苷等3個(gè)成分在室溫，冷藏，反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性。以每一質(zhì)量濃度3樣本分析。結(jié)果表明氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷3個(gè)成分在各條件下均穩(wěn)定，其RSD小于15.1%。

3.6 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 健康SD大鼠18只，雌雄各半，體質(zhì)量為(230±20)g，給藥前12 h禁食，自由飲水。尾靜脈注射赤芍提取物溶液。于給藥前與給 藥 后 5、10、20、30、45、60、90、120、140 min經(jīng)尾靜脈取血約0.4 mL置涂有肝素的塑料離心管中，4500 r/min離心10 min，分離血漿于－20℃冰箱中保存，直至分析［12-14］。實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均用表示，采用DAS 2.0軟件(中國(guó)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì))計(jì)算各檢測(cè)成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷3個(gè)成分的C-t曲線見(jiàn)圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖2 大鼠靜脈注射低、中、高劑量赤芍提取物后氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的C-t曲線(，n=6)Fig.2 Concentration-time profiles of three components after i.v of 40，80，160 mg/kg of Radix Paeoniae Rubra extract to rat(，n=6)

表3 低、中、高劑量下氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(，n=6)Tab.3 Pharmacokinetic parameters describing disposition after i.v of 40，80，160 mg/kg of Radix Paeoniae Rubra extract to rat(，n=6)

表3 低、中、高劑量下氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(，n=6)Tab.3 Pharmacokinetic parameters describing disposition after i.v of 40，80，160 mg/kg of Radix Paeoniae Rubra extract to rat(，n=6)

氧化芍藥苷 芍藥內(nèi)酯苷 苯甲酰芍藥苷低劑量 中劑量 高劑量 低劑量 中劑量 高劑量 低劑量 中劑量 高劑量t1/2α/min 12.6±12.5 23.6±8.6 21.4±9.2 16.5±10.4 20.3±7.4 18.2±10.7 5.5±2.9 7.4±8.1 15.4±10.1 t1/2β/min 24.2±12.5 25.9±7.3 30.7±6.5 24.5±1.2 20.2±8.5 33.2±28.7 34.9±36.0 44.3±13.7 39.4±29.1 V/(L/kg) 19.4±15.9 33.4±19.9 28.1±9.6 1.7±0.98 3.0±2.9 1.7±1.2 30.1±25.9 75.1±39.7 39.5±42.5 CL/(L/min·kg)0.65±0.23 0.69±0.32 0.60±0.20 0.047±0.016 0.072±0.064 0.045±0.019 1.9±1.0 2.8±1.4 1.3±1.1 AUC(0－tmin)/(mg/L·min) 53.2±21.8 106.4±39.5235.1±34.1 760.6±0.13 1653.0±97.5 3407.3±73.6 28.7±36.6 33.7±36.5 178.9±24.4 AUC(0－∞)/(mg/L·min) 69.9±28.6 133.4±32.7292.8±38.1 977.6±23.4 1903.0±104.2 3489.9±87.8 41.5±3.2 43.8±43.房室參數(shù)0 237.5±24.5

4 討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-MS/MS測(cè)定大鼠靜脈注射赤芍提取物后血漿中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的分析方法，并對(duì)其方法進(jìn)行了全面的方法學(xué)考察，結(jié)果表明此方法對(duì)3種檢測(cè)成分可特異、快速、準(zhǔn)確、靈敏的同時(shí)測(cè)定。

4.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果表明，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷在大鼠體內(nèi)符合二室藥動(dòng)學(xué)模型，3個(gè)指標(biāo)成分在大鼠體內(nèi)分布半衰期(t1/2α)為5.5～23.6 min，消除半衰期(t1/2β)為20.2～44.3 min，表明其分布與消除均較迅速。分布容積(V)結(jié)果表明氧化芍藥苷(19.4～33.4 L/kg)、苯甲酰芍藥苷(30.1～75.1L/kg)與芍藥內(nèi)酯苷(1.7～3.0 L/kg)相比存在較大的差異，前兩者為后者的10～20倍，同時(shí)3者的清除率(CL)也與之相似，氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的CL分別為0.60～0.69L/(min/kg)、1.3～2.8 L/(min/kg)、0.045～0.072 L/(min/kg)，存在較大差異。

4.3 氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的藥時(shí)曲線下面積結(jié)果表明芍藥內(nèi)酯苷要明顯大于氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷，這不僅與3者在提取物中的含量有關(guān)，還可能與芍藥內(nèi)酯苷在體內(nèi)分布容積小、清除較慢(與氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷相比)而增加了其在血漿中的暴露量有關(guān)。赤芍提取物中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異性在一定程度上體現(xiàn)了中藥多成分、多作用機(jī)制的特征，因此開(kāi)展其多指標(biāo)成分藥動(dòng)學(xué)研究，有利于更為全面的了解其體內(nèi)過(guò)程，為赤芍藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

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