黃干榮，李曉華，黃衍強(qiáng)，黃小鳳，韋連登，韋紅玉，陳源紅，唐華英，楊 珊，覃艷春

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000)

我國(guó)的中草藥資源豐富，中醫(yī)學(xué)是我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中醫(yī)的作用理論越來(lái)越明確，已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明部分中藥在抗菌作用方面效果顯著，但是很多中藥的有效成分和作用機(jī)制卻有待確定［1-3］。本研究通過(guò)檢測(cè)大黃素等中藥提取物對(duì)耐藥性大腸桿菌生物膜形成的影響，探索能有效抑制大腸桿菌的中藥成分，從生物膜作用層面闡述中藥有效成分的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株來(lái)源 耐藥性大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存，均經(jīng)過(guò)AUTOREADER快速細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀鑒定。對(duì)照菌株CMCC44103由廣東省微生物菌種保藏中心提供。耐藥性大腸桿菌對(duì)亞胺培南(Imipenem)、頭孢哌酮(Cefoperazone)、左氧沙星(Levofloxacin)耐藥。

1.2 中藥提取物 98%大黃素、97%黃連素、98%苦參堿、90%黃芩苷購(gòu)自陜西昂盛生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutirent Agar)、M-H培養(yǎng)基 ［pH(7.4+0.2)］、營(yíng)養(yǎng)肉湯 ［pH(7.4+0.2)］、蛋白胨、結(jié)晶紫購(gòu)自杭州天和生物有限公司;FITC標(biāo)記的刀豆球蛋白(FLUKA NO61361)及碘化丙啶(P4170-100MG)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.4 主要儀器 SPX—150—Z型恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng));低溫冰箱(日本SANYO公司);SW—CJ—2FD型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司);電子天平(Sartorius公司，BP221S型);紫外分光光度計(jì)(BIO—RAD);激光共聚焦顯微鏡FV500型(OLYM—PUS公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備對(duì)倍稀釋的藥物M-H瓊脂平板和肉湯液

把98%大黃素、97%黃連素、98%苦參堿、90%黃芩苷與M-H瓊脂液和肉湯液對(duì)倍稀釋?zhuān)阉幬镔|(zhì)量濃度分別調(diào)整為 1.00、2.00、4.00、8.00、 16.0、 32.0、 64.0、 128、 256 μg/mL，備用。

2.2 檢測(cè)中藥提取物對(duì)耐藥性大腸桿菌的MIC采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平板對(duì)倍稀釋法檢測(cè)MIC［4］。將MH肉湯過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝?相當(dāng)于1.0×108CFU/mL)，用移液器接種約2μL菌液到已經(jīng)制備好的含不同質(zhì)量濃度藥物的MH瓊脂平板上，每孔約105CFU，37℃孵育20 h后判斷結(jié)果。以能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低質(zhì)量濃度為MIC。敏感性判斷按照2012CLIS臨床微生物標(biāo)準(zhǔn)。菌株CMCC44103作為敏感菌株對(duì)照。

2.3 制備中藥提取物干擾耐藥性大腸桿菌生長(zhǎng)的96孔板 LB平板轉(zhuǎn)大腸桿菌過(guò)夜，分別挑單菌落于10 mL LB培養(yǎng)基，搖菌約18～20 h，將菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝缓笕?μL在96孔板中，用已經(jīng)制備好的質(zhì)量濃度分別為4、8、16、32、64、128μg/mL的含藥M-H肉湯液200μL稀釋?zhuān)?個(gè)復(fù)孔，放在37℃孵箱內(nèi)孵育18～20 h。

2.4 檢測(cè)中藥提取物干擾耐藥性大腸桿菌生長(zhǎng)的OD值 采用結(jié)晶紫染色法［4］檢測(cè)OD值。將2.2項(xiàng)中孵育好的孔板取出后棄去培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS液沖洗3次，風(fēng)干，用1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS液沖洗3次，風(fēng)干，用30%的乙酸溶解后稀釋兩倍，在波長(zhǎng)590 nm時(shí)測(cè)量吸光度，取其平均值。

2.5 檢測(cè)中藥提取物干擾后的耐藥性大腸桿菌活菌數(shù)量 參照GB4789.2-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》，采用菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)中藥提取物干擾后的耐藥性大腸桿菌活菌數(shù)量。

2.6 耐藥性大腸桿菌生物膜的制備 采用96孔板免疫熒光標(biāo)記技術(shù)［5］，將2.2項(xiàng)中孵育好孔板取出后棄去培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS液沖洗3次，2.5%戊二醛固定1.5 h;PBS液沖洗，在4℃環(huán)境，用FITC-CONA標(biāo)記30 min，PI標(biāo)記15 min;PBS沖洗后40%PBS-甘油封片，形成耐藥性大腸桿菌生物膜。

2.7 用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察耐藥性大腸桿菌生物膜形成 用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中形成的生物膜，每個(gè)標(biāo)本從生物膜底面朝向生物膜表面隨機(jī)選取3個(gè)視野。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 采用t檢驗(yàn)，比較多組均數(shù)間差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 中藥提取物對(duì)耐藥性大腸桿菌的MIC測(cè)定結(jié)果 大黃素、黃連素、苦參堿對(duì)耐藥性大腸桿菌的MIC分別是 32、64、128μg/mL，黃芩苷在 256μg/mL時(shí)無(wú)作用，見(jiàn)表1。

表1 耐藥性大腸桿菌菌株對(duì)中藥提取物的MIC測(cè)定結(jié)果Tab.1 MIC of drug resistance Escherichia coli to extractive of Chinese medicine

3.2 中藥提取物干擾耐藥性大腸桿菌生長(zhǎng)的OD值 大黃素16μg/mL、黃連素32μg/mL、苦參堿64μg/mL時(shí)，菌株孔板OD值均小于1，黃芩苷作用組和對(duì)照組OD值無(wú)明顯變化，在相同質(zhì)量濃度

表2 中藥提取物干擾耐藥性大腸桿菌生長(zhǎng)的OD值Tab.2 Growth OD of Escherichia coli to interference on Chinese medicine extractive

3.3 中藥提取物干擾后的耐藥性大腸桿菌活菌數(shù)量 檢測(cè)不同質(zhì)量濃度大黃素(8、16μg/mL)、黃連素(16、32μg/mL)、苦參堿(32、64μg/mL)干擾耐藥性大腸桿菌的活菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)大黃素和黃連素作用組在菌液100倍和1000倍稀釋時(shí)菌落數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，苦參堿組在菌液1000倍稀釋時(shí)菌落數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 中藥提取物干擾后的耐藥性大腸桿菌活菌數(shù)量Tab.3 Drug resistance Escherichia coli number to interference on Chinese medicine extractive

3.4 檢測(cè)中藥提取物抑制耐藥性大腸桿菌生物膜形成 激光共聚焦顯微鏡掃描可發(fā)現(xiàn)生物膜從培養(yǎng)皿底部向上形成，空白對(duì)照組和黃芩苷作用組菌株形成的生物膜厚度較厚，蘑菇狀突起，厚薄不均，部分連成片(見(jiàn)圖1A、1B)。大黃素16μg/mL、黃連素32μg/mL、苦參堿64μg/mL干擾組菌株生物膜較稀疏，大多為散在小斑塊狀，顯著少于對(duì)照組菌株(見(jiàn)圖1C、1D、1F)。圖中紅色為細(xì)菌，綠色為細(xì)菌產(chǎn)生的多糖，細(xì)菌及多糖重疊產(chǎn)生圖像中的黃色。

4 討論

近年來(lái)，隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥細(xì)菌不斷增多，大腸桿菌的耐藥性也非常嚴(yán)重［6-7］，因此尋找安全有效的抗菌藥物是目前研究的熱點(diǎn)之一。中草藥是我國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中最珍貴財(cái)富之一，它存在很多抗菌活性強(qiáng)、毒性低的有效成分，如大黃等對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用［8-12］，但是它們提取物的抑菌作用以及對(duì)生物膜形成的影響未見(jiàn)有報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃素、黃連素、苦參堿對(duì)耐藥性大腸桿菌均有較明顯的抑制作用，MIC分別是32、64、128μg/mL，可以用來(lái)治療耐藥性大腸桿菌引起的疾病，黃芩苷無(wú)作用。

圖1 耐藥性大腸桿菌生物膜掃描圖Fig.1 Drug resistance Escherichia coli biofilm scans picture on the control group

細(xì)菌生物膜是由許多細(xì)菌聚集黏結(jié)在一起分泌的一種黏性物質(zhì)，主要是多糖、核酸、脂類(lèi)和蛋白等，交織粘附非生物或生物表面形成“薄膜”，能對(duì)抗外來(lái)危險(xiǎn)，增強(qiáng)耐受抗生素的能力［13-14］。大腸桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，形成生物膜導(dǎo)致感染易慢性化并難于控制。有研究表明含糖的LB培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌的生物膜有一定的影響［15-16］，是否還有其它物質(zhì)也能干擾大腸桿菌生物膜的形成，有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)選用大黃素、黃連素、苦參堿、黃芩苷，在小于MIC質(zhì)量濃度的96孔板中觀(guān)察耐藥性大腸桿菌生物膜的形成和活菌數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素16μg/mL、黃連素32μg/mL、苦參堿64μg/mL時(shí)，菌株孔板OD值均小于1，而且活菌數(shù)量明顯減少，共聚焦顯微鏡掃描顯示多糖的綠色部分已經(jīng)消失，生物膜形成受到明顯抑制。其原因可能是部分菌株被抑制，存活菌株的莢膜被破壞，分泌多糖的能力下降，影響菌株的黏附，其它黏附分子，如菌毛黏附素，是否也被破壞需要進(jìn)一步研究。另外，對(duì)比OD值與活菌數(shù)量、生物膜的掃描圖，發(fā)現(xiàn)OD值小于1時(shí)，對(duì)應(yīng)濃度菌孔生物膜的形成明顯減少，活菌數(shù)量明顯減少，因此可以借助OD值小于1指標(biāo)初步判斷菌株生物膜形成效果。

目前本研究發(fā)現(xiàn)大黃素、黃連素、苦參堿能明顯抑制耐藥性大腸桿菌形成生物膜，這只是表象，它們的分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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