黃干榮，李曉華，黃衍強，黃小鳳，韋連登，韋紅玉，陳源紅，唐華英，楊 珊，覃艷春

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000)

我國的中草藥資源豐富，中醫(yī)學(xué)是我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中醫(yī)的作用理論越來越明確，已經(jīng)通過實驗證明部分中藥在抗菌作用方面效果顯著，但是很多中藥的有效成分和作用機制卻有待確定［1-3］。本研究通過檢測大黃素等中藥提取物對耐藥性大腸桿菌生物膜形成的影響，探索能有效抑制大腸桿菌的中藥成分，從生物膜作用層面闡述中藥有效成分的作用。

1 實驗材料

1.1 菌株來源 耐藥性大腸桿菌由本實驗室分離、鑒定、保存，均經(jīng)過AUTOREADER快速細菌自動鑒定儀鑒定。對照菌株CMCC44103由廣東省微生物菌種保藏中心提供。耐藥性大腸桿菌對亞胺培南(Imipenem)、頭孢哌酮(Cefoperazone)、左氧沙星(Levofloxacin)耐藥。

1.2 中藥提取物 98%大黃素、97%黃連素、98%苦參堿、90%黃芩苷購自陜西昂盛生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂(Nutirent Agar)、M-H培養(yǎng)基 ［pH(7.4+0.2)］、營養(yǎng)肉湯 ［pH(7.4+0.2)］、蛋白胨、結(jié)晶紫購自杭州天和生物有限公司;FITC標(biāo)記的刀豆球蛋白(FLUKA NO61361)及碘化丙啶(P4170-100MG)均購自美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.4 主要儀器 SPX—150—Z型恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);低溫冰箱(日本SANYO公司);SW—CJ—2FD型超凈工作臺(蘇凈集團安泰空氣技術(shù)有限公司);電子天平(Sartorius公司，BP221S型);紫外分光光度計(BIO—RAD);激光共聚焦顯微鏡FV500型(OLYM—PUS公司)。

2 實驗方法

2.1 制備對倍稀釋的藥物M-H瓊脂平板和肉湯液

把98%大黃素、97%黃連素、98%苦參堿、90%黃芩苷與M-H瓊脂液和肉湯液對倍稀釋，把藥物質(zhì)量濃度分別調(diào)整為 1.00、2.00、4.00、8.00、 16.0、 32.0、 64.0、 128、 256 μg/mL，備用。

2.2 檢測中藥提取物對耐藥性大腸桿菌的MIC采用標(biāo)準瓊脂平板對倍稀釋法檢測MIC［4］。將MH肉湯過夜培養(yǎng)的大腸桿菌稀釋至0.5麥氏單位(相當(dāng)于1.0×108CFU/mL)，用移液器接種約2μL菌液到已經(jīng)制備好的含不同質(zhì)量濃度藥物的MH瓊脂平板上，每孔約105CFU，37℃孵育20 h后判斷結(jié)果。以能完全抑制細菌生長的藥物最低質(zhì)量濃度為MIC。敏感性判斷按照2012CLIS臨床微生物標(biāo)準。菌株CMCC44103作為敏感菌株對照。

2.3 制備中藥提取物干擾耐藥性大腸桿菌生長的96孔板 LB平板轉(zhuǎn)大腸桿菌過夜，分別挑單菌落于10 mL LB培養(yǎng)基，搖菌約18～20 h，將菌液稀釋至0.5麥氏單位后取2μL在96孔板中，用已經(jīng)制備好的質(zhì)量濃度分別為4、8、16、32、64、128μg/mL的含藥M-H肉湯液200μL稀釋，取3個復(fù)孔，放在37℃孵箱內(nèi)孵育18～20 h。

2.4 檢測中藥提取物干擾耐藥性大腸桿菌生長的OD值 采用結(jié)晶紫染色法［4］檢測OD值。將2.2項中孵育好的孔板取出后棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS液沖洗3次，風(fēng)干，用1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS液沖洗3次，風(fēng)干，用30%的乙酸溶解后稀釋兩倍，在波長590 nm時測量吸光度，取其平均值。

2.5 檢測中藥提取物干擾后的耐藥性大腸桿菌活菌數(shù)量 參照GB4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》，采用菌落計數(shù)法檢測中藥提取物干擾后的耐藥性大腸桿菌活菌數(shù)量。

2.6 耐藥性大腸桿菌生物膜的制備 采用96孔板免疫熒光標(biāo)記技術(shù)［5］，將2.2項中孵育好孔板取出后棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS液沖洗3次，2.5%戊二醛固定1.5 h;PBS液沖洗，在4℃環(huán)境，用FITC-CONA標(biāo)記30 min，PI標(biāo)記15 min;PBS沖洗后40%PBS-甘油封片，形成耐藥性大腸桿菌生物膜。

2.7 用激光共聚焦顯微鏡觀察耐藥性大腸桿菌生物膜形成 用激光共聚焦顯微鏡觀察細菌在LB培養(yǎng)基中形成的生物膜，每個標(biāo)本從生物膜底面朝向生物膜表面隨機選取3個視野。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析方法 采用t檢驗，比較多組均數(shù)間差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 中藥提取物對耐藥性大腸桿菌的MIC測定結(jié)果 大黃素、黃連素、苦參堿對耐藥性大腸桿菌的MIC分別是 32、64、128μg/mL，黃芩苷在 256μg/mL時無作用，見表1。

表1 耐藥性大腸桿菌菌株對中藥提取物的MIC測定結(jié)果Tab.1 MIC of drug resistance Escherichia coli to extractive of Chinese medicine

3.2 中藥提取物干擾耐藥性大腸桿菌生長的OD值 大黃素16μg/mL、黃連素32μg/mL、苦參堿64μg/mL時，菌株孔板OD值均小于1，黃芩苷作用組和對照組OD值無明顯變化，在相同質(zhì)量濃度

表2 中藥提取物干擾耐藥性大腸桿菌生長的OD值Tab.2 Growth OD of Escherichia coli to interference on Chinese medicine extractive

3.3 中藥提取物干擾后的耐藥性大腸桿菌活菌數(shù)量 檢測不同質(zhì)量濃度大黃素(8、16μg/mL)、黃連素(16、32μg/mL)、苦參堿(32、64μg/mL)干擾耐藥性大腸桿菌的活菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)大黃素和黃連素作用組在菌液100倍和1000倍稀釋時菌落數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，苦參堿組在菌液1000倍稀釋時菌落數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 中藥提取物干擾后的耐藥性大腸桿菌活菌數(shù)量Tab.3 Drug resistance Escherichia coli number to interference on Chinese medicine extractive

3.4 檢測中藥提取物抑制耐藥性大腸桿菌生物膜形成 激光共聚焦顯微鏡掃描可發(fā)現(xiàn)生物膜從培養(yǎng)皿底部向上形成，空白對照組和黃芩苷作用組菌株形成的生物膜厚度較厚，蘑菇狀突起，厚薄不均，部分連成片(見圖1A、1B)。大黃素16μg/mL、黃連素32μg/mL、苦參堿64μg/mL干擾組菌株生物膜較稀疏，大多為散在小斑塊狀，顯著少于對照組菌株(見圖1C、1D、1F)。圖中紅色為細菌，綠色為細菌產(chǎn)生的多糖，細菌及多糖重疊產(chǎn)生圖像中的黃色。

4 討論

近年來，隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥細菌不斷增多，大腸桿菌的耐藥性也非常嚴重［6-7］，因此尋找安全有效的抗菌藥物是目前研究的熱點之一。中草藥是我國醫(yī)學(xué)寶庫中最珍貴財富之一，它存在很多抗菌活性強、毒性低的有效成分，如大黃等對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用［8-12］，但是它們提取物的抑菌作用以及對生物膜形成的影響未見有報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃素、黃連素、苦參堿對耐藥性大腸桿菌均有較明顯的抑制作用，MIC分別是32、64、128μg/mL，可以用來治療耐藥性大腸桿菌引起的疾病，黃芩苷無作用。

圖1 耐藥性大腸桿菌生物膜掃描圖Fig.1 Drug resistance Escherichia coli biofilm scans picture on the control group

細菌生物膜是由許多細菌聚集黏結(jié)在一起分泌的一種黏性物質(zhì)，主要是多糖、核酸、脂類和蛋白等，交織粘附非生物或生物表面形成“薄膜”，能對抗外來危險，增強耐受抗生素的能力［13-14］。大腸桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，形成生物膜導(dǎo)致感染易慢性化并難于控制。有研究表明含糖的LB培養(yǎng)基對大腸桿菌的生物膜有一定的影響［15-16］，是否還有其它物質(zhì)也能干擾大腸桿菌生物膜的形成，有待進一步研究。本實驗選用大黃素、黃連素、苦參堿、黃芩苷，在小于MIC質(zhì)量濃度的96孔板中觀察耐藥性大腸桿菌生物膜的形成和活菌數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素16μg/mL、黃連素32μg/mL、苦參堿64μg/mL時，菌株孔板OD值均小于1，而且活菌數(shù)量明顯減少，共聚焦顯微鏡掃描顯示多糖的綠色部分已經(jīng)消失，生物膜形成受到明顯抑制。其原因可能是部分菌株被抑制，存活菌株的莢膜被破壞，分泌多糖的能力下降，影響菌株的黏附，其它黏附分子，如菌毛黏附素，是否也被破壞需要進一步研究。另外，對比OD值與活菌數(shù)量、生物膜的掃描圖，發(fā)現(xiàn)OD值小于1時，對應(yīng)濃度菌孔生物膜的形成明顯減少，活菌數(shù)量明顯減少，因此可以借助OD值小于1指標(biāo)初步判斷菌株生物膜形成效果。

目前本研究發(fā)現(xiàn)大黃素、黃連素、苦參堿能明顯抑制耐藥性大腸桿菌形成生物膜，這只是表象，它們的分子作用機制還有待進一步研究。

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