向 勤，蒲 明，胡微煦，文 珠，何 丹，胡國柱*

(1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部，江西南昌 330006;2.江西省人民醫(yī)院，江西南昌 330006;3.復(fù)旦大學(xué)上海市腫瘤醫(yī)院，上海 200032;4.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，江西南昌 330006)

研究發(fā)現(xiàn)缺血/缺氧性腦損傷的病理過程引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，尤其是慢性腦缺血。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中補(bǔ)氣為主的方劑在治療腦中風(fēng)，特別是對(duì)于腦神經(jīng)功能的恢復(fù)等療效顯著。動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)也證明人參皂苷、黃芪注射液、黨參皂苷、黃精多糖、甘草酸二銨等均具有抗神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性凋亡作用。山藥是食藥同源的補(bǔ)氣中藥，山藥多糖(Chinese Polysaccharide from Yam，CYPS)具有抗氧化與衰老等作用［1］。本研究運(yùn)用SD胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷體外模型，研究山藥多糖抑制神經(jīng)細(xì)胞缺氧性凋亡的機(jī)制，以期為缺氧性腦病治療藥物的開發(fā)與應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 山藥多糖(Chinese Yam Polysaccharide)，購于南京澤朗生物科技有限公司，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95%，使用培養(yǎng)液稀釋成不同質(zhì)量濃度。

1.2 動(dòng)物 清潔級(jí)孕15～18 d SD大鼠(購自江西省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(贛)2005-0001)。

1.3 試劑 Neurobasal Medium和B27 Supplement(GIBCOBRL公司產(chǎn)品);神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和兔抗小鼠多克隆抗體(Boster產(chǎn)品);膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP);兔抗人多克隆抗體，DAB顯色試劑盒(中杉金橋產(chǎn)品);ABC-抗兔IgG試劑盒(Vector產(chǎn)品);羅丹明123染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品);TransS-criptTMTwo-Step RT-PCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品);抗Bcl-2抗體及抗Bax抗體，兔抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz公司產(chǎn)品，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司分裝);抗Caspase-3抗體(Anbo公司產(chǎn)品)。

1.4 儀器 3164型CO2培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司);厭氧培養(yǎng)箱(YQX—Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);PCR擴(kuò)增儀(型號(hào):MyCyclerTMThermal Cycler，美國BIO—RAD公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(型號(hào):Universal HoodⅡ，美國 BIO—RAD公司);DMI3000型倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司);流式細(xì)胞儀(型號(hào):COULTER EPICS XL，美國BECKMANCOULTER公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組，神經(jīng)細(xì)胞在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d;凋亡陽性組，神經(jīng)細(xì)胞在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)4 d后缺氧12 h，復(fù)氧24 h培養(yǎng);山藥多糖0.025 g/L組、山藥多糖0.05 g/L組、山藥多糖0.1 g/L組、山藥多糖0.25 g/L組，神經(jīng)細(xì)胞在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后加入以上不同質(zhì)量濃度的山藥多糖預(yù)處理4 h，再進(jìn)行缺氧12 h，復(fù)氧24 h培養(yǎng)。

1.6 方法

1.6.1 神經(jīng)細(xì)胞原代無血清培養(yǎng)，鑒定及缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)等方法詳見參考文獻(xiàn) ［2］方法。

1.6.2 羅丹明123(Rhodamine 123)染色按說明書所述方法操作，流式細(xì)胞儀測(cè)定按常規(guī)方法進(jìn)行，流式細(xì)胞儀測(cè)定采用FlowJo 6.5軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.6.3 RT-PCR操作步驟按照說明書所述方法進(jìn)行，Bax正向引物序列:5'-GATCAGCTCGGGC ACTTTAG-3'，反向引物序列:5'-TGCAGAGGATGATTGCTGAC-3';擴(kuò)增長度173 bp;Bcl-2正向引物序列:5'-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3'，反向引物序列:5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3';擴(kuò)增長度223 bp;Caspase-3正向引物序列:5'-GCATGCCATATCATCGTCAG-3';反向引物序列:5'-GGACCTGTGGACCTGAAAAA-3';擴(kuò)增長度159 bp;β-actin正向引物序列:5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3';反向引物序列:5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3';擴(kuò)增長度432 bp;Bax與Bcl-2擴(kuò)增條件:94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 10 min，32個(gè)循環(huán)，Caspase-3與β-actin退火溫度為55℃，其余相同，用Quantity One測(cè)量條帶的OD值，并以O(shè)D值目的基因/OD值內(nèi)參值的比值作為目的基因的表達(dá)量。

1.6.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色按參考文獻(xiàn) ［2］方法操作，Caspase-3(1 ∶1000)、Bax(1 ∶400)、Bcl-2(1∶400)，染為棕黃色或棕褐色的細(xì)胞計(jì)為陽性細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性率。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 所有結(jié)果均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)細(xì)胞鑒定 胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)6 d后，經(jīng)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色證明，NSE陽性細(xì)胞達(dá)到(93.70±0.56)%(n=5)，GFAP陽性細(xì)胞達(dá)到(8.87±0.55)%(n=5)。細(xì)胞漿染色成棕黃色為陽性，未染色或淡黃色為陰性(見圖1)。

“生命之根”能不能留??？——這是不是當(dāng)今時(shí)代，比屈原的《天問》更其迫切更帶根本的“諸心之問”或“指天之問”？

圖1 神經(jīng)細(xì)胞NSE、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色(放大倍數(shù)10×20)Fig.1 In vitro cultured cerebral cortical neurons stained by immunocytochemistry(10×20)

2.2 山藥多糖對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞線粒體的影響 神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)4 d后加入不同質(zhì)量濃度的山藥多糖預(yù)處理4 h，再缺氧12 h復(fù)氧24 h培養(yǎng)，經(jīng)流式羅丹明123檢測(cè)發(fā)現(xiàn)山藥多糖在0.025～0.25 g/L組平均熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，但與凋亡陽性組相比均顯著升高(P＜0.05)，且質(zhì)量濃度在0.1 g/L時(shí)抑制作用最強(qiáng)(見表1，圖2)。證明山藥多糖能夠在一定程度上減少缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷及所引起的細(xì)胞凋亡。

表1 山藥多糖對(duì)各組缺氧的神經(jīng)細(xì)胞線粒體的影響(，n=3)Tab.1 Effect of polysaccharide from Yam against mitochondrial injury of hypoxic neurons(，n=3)

表1 山藥多糖對(duì)各組缺氧的神經(jīng)細(xì)胞線粒體的影響(，n=3)Tab.1 Effect of polysaccharide from Yam against mitochondrial injury of hypoxic neurons(，n=3)

注:與正常對(duì)照組比較，▽P＜0.05;與凋亡陽性組比較，▼P＜0.05;與山藥多糖0.025 g/L組比較，*P＜0.05;與山藥多糖0.05 g/L組比較，#P＜0.05;與山藥多糖0.1 g/L組比較，◇P＜0.05

組 別 質(zhì)量濃度/(g·L－1) 平均熒光強(qiáng)度(MFI)232.33 ±17.62凋亡陽性組 0 34.30±13.00▽山藥多糖 0.025 54.87±8.95▽▼山藥多糖 0.05 159.33±4.51▽▼＊山藥多糖 0.1 180.33±13.43▽▼＊#山藥多糖 0.25 45.90±3.53▽▼#◇正常對(duì)照組0

2.3 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)4 d后加入不同質(zhì)量濃度的山藥多糖預(yù)處理4 h，再缺氧12 h復(fù)氧24 h培養(yǎng)，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與凋亡陽性組比較，山藥多糖在0.1～0.25 g/L之間顯著下調(diào)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，在0.05～0.25 g/L之間顯著下調(diào)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞 Bax mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，在0.05～0.1 g/L之間顯著上調(diào)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)(見表2，圖3)。證明山藥多糖預(yù)處理缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞通過下調(diào)Caspase-3和Bax基因的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞。

2.4 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)4 d后加入不同質(zhì)量濃度的山藥多糖預(yù)處理4 h，再缺氧12 h復(fù)氧24 h培養(yǎng)，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)與凋亡陽性組比較，山藥多糖在0.025～0.25 g/L之間顯著地下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，且在0.1 g/L時(shí)作用最強(qiáng)(P＜0.05)，在0.05～0.25 g/L之間顯著下調(diào)Bax蛋白表達(dá)(P＜0.05)，在0.05～0.25 g/L之間顯著上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，且質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)作用最強(qiáng)(P＜0.05)(見表3，圖4～6)。證明山藥多糖預(yù)處理可通過下調(diào)Caspase-3、Bax凋亡蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2抗凋亡蛋白表達(dá)保護(hù)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞減少凋亡。

圖2 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞線粒體的影響Fig.2 Effect of polysaccharide from Yam against mitochondrial injury of hypoxic neurons

2.5 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2/Bax比值的影響 神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)4 d后加入不同質(zhì)量濃度的山藥多糖預(yù)處理4 h，再缺氧12 h復(fù)氧24 h培養(yǎng)，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)與凋亡陽性組比較，山藥多糖在0.005～0.1 g/L之間顯著地降低缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2/Bax mRNA比值(P＜0.05)，在0.025 g/L至0.25 g/L之間顯著地降低缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白比值(P＜0.05)(見表2～3)，其中以0.1 g/L最為顯著。證明山藥多糖預(yù)處理可通過提高抗凋亡基因和蛋白與凋亡基因和蛋白Bcl-2/Bax比值保護(hù)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞減少凋亡。

3 討論

細(xì)胞缺血/缺氧影響線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)的功能，引起線粒體通透性改變(MPT)，從而使線粒體膜電位(MMP)降低，導(dǎo)致過度產(chǎn)生的氧自由基、凋亡誘導(dǎo)因子及細(xì)胞色素C的釋放，致使細(xì)胞凋亡［3-4］。黃芪的有效成分能夠通過抑制PC12細(xì)胞活性氧的生成，提高M(jìn)MP抑制氧化損傷性細(xì)胞凋亡［5］。黃芪多糖治療腹主動(dòng)脈縮窄的大鼠后發(fā)現(xiàn)心肌MMP較模型組明顯升高［6］。本研究證明山藥多糖在0.025～0.25 g/L抑制了缺氧的神經(jīng)細(xì)胞線粒體的損傷，羅丹明-123檢測(cè)發(fā)現(xiàn)平均熒光強(qiáng)度較凋亡陽性組顯著提高，可能山藥多糖修復(fù)MPTP的功能，提高線粒體的膜電位。

表2 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)(OD值)的影響(，n=3)Tab.2 Effect of polysaccharide from Yam on mRNA expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons((OD value)，n=3)

表2 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)(OD值)的影響(，n=3)Tab.2 Effect of polysaccharide from Yam on mRNA expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons((OD value)，n=3)

注:與正常對(duì)照組比較，▽P＜0.05;與凋亡陽性組比較，▼P＜0.05;與山藥多糖0.025 g/L組比較，*P＜0.05;與山藥多糖0.05 g/L組比較，#P＜0.05;與山藥多糖0.1 g/L組比較，◇P＜0.05

組別 質(zhì)量濃度/(g·L－1) Caspase-3 Bax Bcl-2 (Bax/Bcl-2)正常對(duì)照組0.62±0.02 0.28±0.04 0.88±0.13 3.16±0.54凋亡陽性組 0 1.24±0.03▽ 0.70±0.02▽ 0.49±0.09▽ 0.69±0.11▽山藥多糖 0.025 1.17±0.10▽ 0.65±0.07▽ 0.45±0.06▽ 0.70±0.16▽山藥多糖 0.05 0.87±0.10 0.52±0.06▽▼＊ 0.67±0.01▽▼ 1.30±0.14▽▼＊山藥多糖 0.1 0.78±0.05▼ 0.38±0.06▼＊# 0.71±0.05▽▼＊ 1.89±0.40▽▼＊#山藥多糖 0.25 0.97±0.03▽▼ 0.52±0.11▽▼＊◇ 0.63±0.11▽＊ 1.27±0.390▽◇

表3 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(，n=3)Tab.3 Effect of polysaccharide from Yam on protein expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons(，n=3)

表3 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(，n=3)Tab.3 Effect of polysaccharide from Yam on protein expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons(，n=3)

注:與正常對(duì)照組比較，▽P＜0.05;與凋亡陽性組比較，▼P＜0.05;與山藥多糖0.025 g/L組比較，*P＜0.05;與山藥多糖0.05 g/L組比較，#P＜0.05;與山藥多糖0.1 g/L組比較，◇P＜0.05

組 別 質(zhì)量濃度/(g·L－1) Caspase-3/% Bax/% Bcl-2/% (Bcl-2/Bax)正常對(duì)照組 0 37.03±0.38 53.32±0.77 59.36%±2.23 1.11±0.03凋亡陽性組 0 58.89±0.45▽ 65.08±1.02▽ 37.83% ±1.08▽ 0.58±0.01▽山藥多糖 0.025 55.65±0.24▽▼ 61.70±2.12 43.54% ±0.93▽ 0.71±0.02▽▼山藥多糖 0.05 53.54±0.79▽▼ 57.34±2.53▼ 46.82% ±0.63▽▼ 0.82±0.03▽▼＊山藥多糖 0.1 45.76±0.53▽▼ 53.74±1.72▼ 52.82% ±1.33▽▼ 0.98±0.06▽▼＊#山藥多糖 0.25 52.42±1.06▽▼ 58.38±1.11▽▼ 45.88% ±1.38▽▼ 0.79±0.04▽▼＊◇

圖3 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of polysaccharide from Yam on mRNA expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons

圖4 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of polysaccharide from Yam on protein expression of Bax in hypoxic neurons

圖5 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of polysaccharide from Yam on protein expression of Bcl-2 in hypoxic neurons

圖6 山藥多糖對(duì)缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of polysaccharide from Yam on protein expression of Caspase-3 in hypoxic neurons

本課題組對(duì)不同補(bǔ)氣強(qiáng)度的中藥進(jìn)行體外抗缺氧性神經(jīng)細(xì)胞凋亡研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1和西洋參總皂苷在 0.05～0.1 g/L［10-11］、黃精多糖在0.5 ～1.5 g/L［12］，白扁豆多糖在0.5 ～3.5 g/L［13］、山藥多糖則在0.025～1.0 g/L提高缺氧的神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2/Bax表達(dá)比值，并成劑量依賴性。這些結(jié)果證明，不同強(qiáng)度的補(bǔ)氣中藥均能有效地抑制缺氧性神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且抗神經(jīng)細(xì)胞缺氧性凋亡的強(qiáng)弱與中藥補(bǔ)氣強(qiáng)弱相一致;同時(shí)也初步證明同一藥性的中藥其功效相同。

綜上所述，山藥多糖通過降低凋亡基因及蛋白的產(chǎn)生，上調(diào)抗凋亡基因及蛋白的產(chǎn)生，提高Bcl-2/Bax的比值達(dá)到抗神經(jīng)細(xì)胞缺氧性凋亡作用。

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