王媛

【摘 要】目的 對(duì)地紅霉素腸溶片釋放度測(cè)定的三種方法進(jìn)行系統(tǒng)的研究和比較，并建立其最佳測(cè)定方法。方法 分別采用口占 噸氫醇顯色法、硫酸顯色法以及高效液相色譜法測(cè)定地紅霉素腸溶片的釋放度，對(duì)每種方法進(jìn)行方法學(xué)的研究和驗(yàn)證。結(jié)果 采用三種方法均可以準(zhǔn)確地測(cè)定地紅霉素腸溶片的釋放度，不同方法測(cè)得結(jié)果差異較小。結(jié)論 硫酸顯色法因試劑易得，操作簡(jiǎn)便，快捷、準(zhǔn)確，將其作為最佳測(cè)定方法。

【關(guān)鍵詞】地紅霉素；測(cè)定方法

地紅霉素（dirithromycin）是一種新的第二代紅霉素類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由紅霉環(huán)胺與脂肪醛酸縮合而成。地紅霉素通過阻礙細(xì)菌轉(zhuǎn)肽過程，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。體外試驗(yàn)證明地紅霉素對(duì)臨床上多種常見致病菌有抗菌作用。地紅霉素具有與紅霉素相似的抗菌譜，其特點(diǎn)是藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，半衰期長達(dá)20～50h，不良反應(yīng)相對(duì)較輕。

1.儀器與試藥

1.1儀器

ZRS-8型智能溶出試驗(yàn)儀（天津大學(xué)無線電廠）；ShimadzuUV-2401PC型紫外-可見分光光度計(jì)；Shi-madzu高效液相色譜儀（LC-10ATvp泵、SPD-10Avp可見紫外檢測(cè)器、SCL-10Avp控制器）；AE200電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2試藥

地紅霉素對(duì)照品（純度99.83%）為自制，并由中國藥品生物制品檢定所標(biāo)定；地紅霉素腸溶片（規(guī)格：0.25g）為自制產(chǎn)品；10%口占噸氫醇甲醇溶液購自北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉及硫酸等均為分析純。

2.方法與結(jié)果

2.1口占噸氫醇顯色法

在采用口占噸氫醇顯色法測(cè)定本品釋放度的過程中發(fā)現(xiàn)，完全依照USP23中的顯色條件，方法的線性和耐受性不佳；經(jīng)過改良顯色條件，可使方法具有較好的線性和顯色穩(wěn)定性。其他條件如對(duì)照品溶液的濃度、檢測(cè)波長等則與USP23中條件相同。

2.1.1美國藥典中的顯色條件

精密量取待測(cè)溶液0.50ml，加入0.50ml乙酐，混勻。然后加入5.0ml冰乙酸，靜置5min，加入0.50ml口占噸氫醇試液，放置30min使顯色。

2.1.2改良后顯色條件

精密量取待測(cè)溶液1.0ml，加入0.10mol/L鹽酸溶液4.0ml，搖勻，再加口占噸氫醇試液10.0ml，混勻，于沸水中加熱5min，于冰浴中冷卻，再于室溫放置15min。

口占噸氫醇試液的配制取10%口占噸氫醇甲醇溶液0.02ml，置100ml量瓶中，加冰乙酸20ml及鹽酸1ml，搖勻，用冰乙酸稀釋至刻度。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取地紅霉素對(duì)照品適量，用pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解并分別稀釋成0.07、0.14、0.21、0.28、0.35、0.42、0.49和0.56mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取1.0ml，按上述方法進(jìn)行顯色，測(cè)定540nm波長處吸收度。以吸收度A對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（mg/ml）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=1.8452C-0.0042，r=0.9998。

2.1.4溶液室溫放置穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述0.28mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫下放置，分別于0、1、2、4、6和8h精密量取1.0ml進(jìn)行顯色，測(cè)定。結(jié)果表明溶液的吸收度在4h內(nèi)變化不大。

2.1.5回收率試驗(yàn)

精密稱取地紅霉素11、14及17mg，分別置50ml量瓶中，加入處方量的空白輔料，用pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾。分別精密量取續(xù)濾液1.0ml，按上述方法進(jìn)行顯色，于540nm波長處分別測(cè)定吸收度。計(jì)算測(cè)得量及回收率。

2.1.6測(cè)定法

取本品，先以鹽酸溶液（9→1000）900ml為溶劑，采用籃法，轉(zhuǎn)速100r/min，經(jīng)2h，每片腸溶膜均不得有裂縫或軟化現(xiàn)象；繼以磷酸鹽緩沖液（pH6.8）900ml為溶劑，45min時(shí)取溶液10ml，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另精密稱取地紅霉素對(duì)照品適量，用pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解，并稀釋成0.28mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液；精密量取上述溶液各1.0ml，加入0.10mol/L鹽酸溶液4.0ml，搖勻，再加入 口 占 噸氫醇試液10.0ml，混勻，于沸水中加熱5min，于冰浴中冷卻，再于室溫放置15min。以空白試劑溶液作對(duì)照，于540nm波長處測(cè)定吸收度，以兩者的比值計(jì)算釋放百分率。

2.2硫酸顯色方法

采用顯色條件與地紅霉素腸溶片試行標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的相同條件，即以（75→100）硫酸液5ml為顯色試劑，室溫下反應(yīng)1h，檢測(cè)波長為482nm。

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取地紅霉素對(duì)照品適量，用pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解并分別稀釋成32、64、96、128和160μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取5.0ml，加入（75→100）硫酸液5ml，搖勻，室溫下放置1h，測(cè)定482nm處吸收度。以吸收度A對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（μg/ml）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.0064C-0.0766（r=0.9993）。

2.2.2溶液室溫放置穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述96μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫下放置，分別于0、1、2、4、6和8h精密量取5.0ml，進(jìn)行顯色，測(cè)定。結(jié)果表明，溶液的吸收度在4h內(nèi)變化不大。

2.2.3回收率試驗(yàn)

精密稱取地紅霉素及處方比例的輔料，加pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解，過濾，分別稀釋成含地紅霉素80、100和120μg/ml的溶液，分別精密量取5.0ml，按上述方法顯色，測(cè)定482nm處吸收度。計(jì)算測(cè)得量及回收率，結(jié)果三個(gè)劑量的回收率分別為99.6%、100.2%和99.1%，對(duì)應(yīng)的RSD分別為0.8%、0.6%和0.5%。

2.3高效液相色譜法（HPLC法）

2.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamond-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈∶甲醇∶磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.41g與磷酸氫二鉀6.91g，加水至1000ml）（44∶19∶37）；檢測(cè)波長205nm；流速2ml/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μl。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)依照USP23中地紅霉素腸溶片含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定，地紅霉素16R異構(gòu)體峰與9（S）紅霉胺峰之間分離度R12 不得小于5.0，地紅霉素16R異構(gòu)體峰與16S異構(gòu)體峰之間分離度R23不得小于2.0。

2.3.2空白輔料及溶劑的干擾試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，空白輔料及溶劑（pH6.8磷酸鹽緩沖液）均在2min之前出峰，不干擾樣品的測(cè)定。

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取地紅霉素對(duì)照品適量，加pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解并分別稀釋成0.05、0.10、0.20、0.40和0.60mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，以峰面積A對(duì)濃度C（mg/ml）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=553934C+894.69（r=0.9999）。

2.3.4溶液穩(wěn)定性及精密度

取上述0.20mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫條件下放置，分別于0、1、2、4和6h吸取10μl，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，6h內(nèi)峰面積變化不大，RSD為0.75%。0時(shí)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，量取峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.66%。

2.3.5回收率試驗(yàn)

精密稱取地紅霉素及處方比例的輔料，加pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解，過濾，分別稀釋成含地紅霉素0.20、0.25和0.30mg/ml的溶液，分別吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算測(cè)得量及回收率。結(jié)果表明，三個(gè)劑量的回收率分別為100.0%，99.7%和99.4%，對(duì)應(yīng)的RSD分別為0.5%、0.6%和0.5%。

2.3.6測(cè)定法

分別吸取2.1.6項(xiàng)下所述供試品溶液和對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算釋放百分率。

3.討論

（1）比較上述三種地紅霉素腸溶片的釋放度測(cè)定方法，口占噸氫醇顯色法為美國藥典中規(guī)定的方法，操作繁瑣，且顯色試劑國內(nèi)沒有生產(chǎn)，必須進(jìn)口；硫酸顯色法為我國試行藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法，優(yōu)點(diǎn)為試劑易得，操作簡(jiǎn)便快捷；HPLC法為參考美國藥典中地紅霉素腸溶片含量測(cè)定方法建立的，優(yōu)點(diǎn)為準(zhǔn)確，靈敏度高，但所需時(shí)間較長，成本較高。

（2）三種方法均具有較高的準(zhǔn)確度，所測(cè)得的釋放曲線間差異較小。但綜合考慮，硫酸顯色法成本較低，操作方便，為地紅霉素腸溶片釋放度測(cè)定的最佳方法。

（3）采用上述三種方法測(cè)得的自制地紅霉素腸溶片45min的釋放量均達(dá)標(biāo)示量的100%左右，說明該制劑的釋放性能良好。

（4）USP23規(guī)定的方法中，口占噸氫醇是采用的固體，而國內(nèi)僅有其10%的甲醇溶液銷售，因此，上述口占噸氫醇顯色法中采用了10% 口占噸氫醇甲醇溶液，方法學(xué)研究表明，這種變動(dòng)不會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【參考文獻(xiàn)】

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