劉春潮，于振濤，余 森，韓建業(yè)，牛金龍

(西北有色金屬研究院，陜西 西安 710016)

0 引言

生物醫(yī)用鈦合金材料由于其良好的生物相容性、在血液環(huán)境中極為卓越的耐腐蝕性能和物理化學(xué)穩(wěn)定性、出色的綜合力學(xué)性能匹配，而成為最具發(fā)展前途的生物材料，已在心腦血管介入醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注，并已開始部分替代目前臨床常用的316L不銹鋼。但是，血液接觸類金屬醫(yī)療器械由于自身固有的物理特性和表面特征，植入人體后，在充滿電解質(zhì)的血液中其表面會迅速產(chǎn)生蛋白質(zhì)吸附、腐蝕以及對血管壁的損傷等界面過程，而這些都會引起支架表面局部凝血，進而觸發(fā)產(chǎn)生血栓［1-2］。

已有大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物材料植入體內(nèi)后，幾秒鐘內(nèi)即有大量蛋白質(zhì)分子粘附在材料表面，形成蛋白質(zhì)吸附層(厚度10～20 nm)，然后再在蛋白質(zhì)吸附層上進一步吸附凝血因子并最終誘發(fā)血液凝固［3-7］。即植入材料抗凝血性能的優(yōu)劣與其表面對血漿蛋白的吸附行為和程度密切相關(guān)，且主要與蛋白質(zhì)種類緊密相關(guān)。人體血漿蛋白中主要包含三種蛋白質(zhì)，其中纖維蛋白會誘導(dǎo)血小板的激活、變形，并且會被替代為一種不溶性的高分子量蛋白而導(dǎo)致內(nèi)源性凝血。但有研究表明，當(dāng)有白蛋白覆蓋在材料表面時能形成很薄的白蛋白層，該膜層能起到隔離血液成分和材料反應(yīng)的作用，從而顯著減少纖維蛋白原和血小板等凝血組織在植入材料表面的粘附，提高材料的抗凝血性能，這一現(xiàn)象被稱之為“白蛋白鈍化”［6-8］，可用于血液接觸材料或器械的表面抗凝血改性處理。

Ti-3Zr-2Sn-3Mo-25Nb(TLM)合金是西北有色金屬研究院根據(jù)臨床數(shù)據(jù)反饋、需求及發(fā)展趨勢開發(fā)的一種新型近β型醫(yī)用鈦合金材料，它不含Al、Ni等細胞毒性元素，體內(nèi)生物相容性優(yōu)于目前臨床常用的316LSS、Ti-6Al-4V等金屬材料，且具有良好的生物力學(xué)性能匹配和冷加工性能，是有望獲得廣泛臨床應(yīng)用的新型介入醫(yī)用鈦合金材料［9-11］。為了進一步提高TLM合金的抗凝血性能，首先通過溶膠-凝膠法在其表面制備一層TiO2薄膜，并通過化學(xué)法對該薄膜進行活化處理，然后再通過靜電自組裝和共價交聯(lián)反應(yīng)將白蛋白分子固定在薄膜表面，最后對白蛋白修飾前后的TLM合金表面的抗凝血性能進行測試、對比評價和分析。

1 實驗

1.1 實驗材料

將TLM合金加工成φ10 mm×2 mm的圓片狀樣品，經(jīng)砂紙初步打磨平整后再在拋光機上拋光至鏡面，并依次在稀鹽酸、丙酮、去離子水和無水乙醇中超聲波清洗15 min，真空干燥備用。

1.2 TiO2薄膜的制備及活化處理

TiO2薄膜是通過溶膠-凝膠法制成的。前驅(qū)物為Ti(OC4H9)4，溶劑為乙二醇甲醚，配置好的溶膠靜置陳化 24 h 后備用［5-6，12-13］。

通過提拉法鍍膜。鍍膜后將樣品放入箱式電阻爐中緩慢升溫至500℃保溫l h，采用爐冷方式冷卻至室溫。

將鍍膜后的樣品依次在鹽酸、雙氧水混合溶液和丙稀酰胺、硝酸等的混合溶液中活化處理8 h。之后，將試樣依次在0.05 mol/L的NaOH溶液和去離子水中漂洗干凈，真空干燥。

1.3 白蛋白的靜電自組裝固定

牛血清白蛋白為生物純，由Sigma公司提供，并配制成1 mg/mL的白蛋白的檸檬酸溶液，調(diào)節(jié)pH至4.8。隨機挑取TLM鍍膜活化試樣9個，先將全部試樣浸入白蛋白溶液中，恒溫振蕩2 h后徹底清洗干凈，再將上述樣品全部浸沒入1 mg/L的硫酸葡聚糖特征溶液中，并繼續(xù)恒溫振蕩1 h，隨后在去離子水中超聲波清洗30 min。重復(fù)以上操作6次，然后在2.5%的戊二醛溶液中浸泡2 h，最后在磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)中超聲清洗30 min，真空晾干。

1.4 涂層相組成測試

通過X射線衍射儀檢測分析白蛋白涂層的相組成。測試條件:銅靶，管電壓30 kV，電流20 mA，掃描速度0.03°/s，掃描區(qū)間15°～80°，掠射角1°。通過掃描電鏡(JSM-6460)觀察涂層的表面微觀形貌。通過原子力顯微鏡(Veeco)表征白蛋白涂層表面的三維特征。

1.5 薄膜親水性的測定

用接觸角測試儀(Phoenix-300)檢測白蛋白處理前后TLM合金樣品對蒸餾水的接觸角，比較其表面親水性的變化。

1.6 凝血時間的測定

通過測量動態(tài)凝血時間來對比研究白蛋白改性前后TLM合金的抗凝血性能變化，具體操作如下:精確移取0.2 mL新鮮抗凝人血，分別滴加在白蛋白改性涂層及TLM合金空白樣品表面，再精確移取濃度為0.2 mol/L的CaCl2溶液0.2 μL于樣品表面，依次在10、20、30、40、50和60 min時用蒸餾水緩慢沖洗樣品表面，并將各次沖洗的洗液分別收集在96孔板中，用酶標(biāo)儀(CliniBio128C，Austria)在550 nm波長處測定各洗液的吸光度值。重復(fù)測量5次，取平均值。

1.7 血小板黏附實驗

通過血小板黏附實驗評價白蛋白涂層對主要凝血組織——血小板的激活反應(yīng)。具體操作如下:分別通過微量進樣器移取30 μL新鮮富血小板血漿滴加在白蛋白涂層和空白樣品表面，室溫接觸30 min后用PBS緩沖液緩慢清洗各樣品，隨后將樣品完全浸沒在2.5%的戊二醛溶液中30 min，最后經(jīng)超臨界干燥后，采用掃描電鏡(JSM-6700)觀察各樣品表面黏附的血小板的形態(tài)和數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 涂層相組成

TLM合金表面抗凝血涂層的XRD衍射曲線如圖1所示?？梢钥闯?，涂層基體主要是TiO2薄膜，除少量雜質(zhì)峰外，主要由金紅石和銳鈦礦組成，且衍射峰尖銳狹窄，沒有寬化和分裂，說明結(jié)晶度較高［12］。

圖1 抗凝血涂層的XRD衍射譜圖Fig.1 XRD pattern of the anticoagulant coating

雖然鈦合金在有氧的環(huán)境下，其表面也會迅速原位生成一層Ti-O膜，并且該氧化鈦膜也具有較好的抗凝血性能，但是這種自發(fā)生成的Ti-O膜通常為非晶態(tài)，其血液相容性不如金紅石或銳鈦礦。

2.2 薄膜的表面分析

圖2為TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后的微觀形貌。從TLM合金表面溶膠-凝膠膜的SEM照片(圖2a)可以看出，TiO2薄膜表面平整，但含有少量微裂紋，經(jīng)表面活化和白蛋白覆膜處理后(圖2b)，薄膜表面微小裂紋進一步減少，表面更為光滑，平均粗糙度為200 nm(圖2c)。

溶膠-凝膠法是一種經(jīng)典的化學(xué)薄膜制備方法［12-13］，但在薄膜干燥和熱處理過程中，由于凝膠是一種有機混合物，受熱時會迅速干燥揮發(fā)，質(zhì)量損失極大，導(dǎo)致收縮率也很大。本實驗中，由于基體材料是鈦合金，其熱膨脹率很小，因此薄膜在干燥和高溫?zé)崽幚頃r會產(chǎn)生裂紋。此外，由于凝膠的表層與空氣接觸后，會馬上凝膠化，干燥形成一層硬殼，而凝膠內(nèi)部固化較慢，并且在熱處理時，凝膠有機物大部分會變成氣體，氣體受熱膨脹從而沖破表層硬殼，也會在薄膜表面產(chǎn)生裂紋。因此，溶膠-凝膠薄膜表面通常都會有少量的微小裂紋。但經(jīng)長時間在熱的官能化溶液中活化處理和靜電自組裝涂膜后，薄膜表面微裂紋會明顯減少，表面更加光滑。光滑的表面不利于血小板和纖維蛋白等凝血組織的黏附，因此抗凝血性能更好。

圖2 TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后的微觀形貌Fig.2 Micrographs of the coatings before and after modification by albumin

2.3 親水性測試

TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后蒸餾水的接觸角如表1所示。

表1 TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后對蒸餾水的接觸角Table 1 Contact angle of TLM alloy before and after surface modification by albumin

從表1可以看出，試樣表面經(jīng)白蛋白修飾處理以后，接觸角從34.5°降低到19.1°，即親水性變好。TiO2薄膜本身具有很好的親水性［14-16］，且TLM合金經(jīng)過溶膠-凝膠膜和白蛋白修飾處理后，材料表面形成了一個生物活性白蛋白層，并且在此過程中，涂層表面引入了OH-和NH2-親水基團，同時白蛋白分子也帶有大量親水基團，從而材料的親水性能得到了改善［17］。

研究表明，生物材料植入人體組織并與血液接觸后，血漿中的各種蛋白質(zhì)以及部分凝血因子、抗凝血因子會迅速吸附在植入材料表面［7］，且吸附的蛋白質(zhì)的類別、數(shù)量及立體空間構(gòu)象等特性與植入材料的物理、化學(xué)等表面特征密切相關(guān)，并會對血小板等凝血組織與植入材料表面的交互作用、動態(tài)吸附與解吸附過程產(chǎn)生巨大的影響［7，17-18］。例如，吸附在材料表面的蛋白質(zhì)發(fā)生變性、活化將誘導(dǎo)或啟動血液內(nèi)源、外源凝血途徑，與此同時，血小板在材料表面的黏附、變形和激活等反應(yīng)又會進一步引起其它血小板發(fā)生凝血反應(yīng)，最終大量不溶性的纖維蛋白和血小板等物質(zhì)共同形成血栓［7，17］。

而材料表面的親/疏水性能是影響材料表面蛋白質(zhì)吸附、細胞黏附的一個重要因素。對于抗凝血材料，材料表面的親水性越好，蛋白質(zhì)吸附量越小，抗凝血性越好。這是由于親水性材料含有大量的水，與蛋白質(zhì)和細胞中的水分子的有序排列極為相似，它們之間的相互作用力很小，與血液的界面能很小，因此，具有良好的抗凝血性。

2.4 凝血時間的測定

圖3為TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾處理前后的動態(tài)凝血時間測試結(jié)果。

圖3 TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后的動態(tài)凝血時間測試結(jié)果Fig.3 Test result of dynamic coagulation time of TLM alloy before and after surface modifacation by albumin

植入材料與血液接觸時會發(fā)生溶血反應(yīng)，未凝血的紅細胞溶解在洗脫液中，溶解的自由紅細胞數(shù)量越多，洗脫液的吸光度值就越高，即凝結(jié)在植入材料表面的紅細胞數(shù)量就越少，說明材料的抗凝血作用越好。

由圖3可以看出，與血液的接觸時間相同時，表面經(jīng)白蛋白修飾處理后的TLM合金的吸光度值較未處理的高。由此說明，白蛋白修飾后的TLM合金具有較好的抗凝血性，即通過上述白蛋白修飾處理使TLM合金的抗凝血性能得到了提高。

圖4為TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后材料表面的血小板黏附照片。由圖4可以看出，表面經(jīng)白蛋白涂層改性后(圖4a)，試樣表面黏附的血小板數(shù)量很少，且黏附的血小板形態(tài)沒有發(fā)生明顯的變形、團聚等激活跡象。而未經(jīng)處理的空白TLM合金表面(圖4b)不僅黏附著大量的血小板，而且血小板明顯被激活。

圖4 TLM合金表面經(jīng)白蛋白修飾前后的血小板黏附照片F(xiàn)ig.4 SEM micrographs of platelets adhered of TLM alloy before and after modifacation by albumin

蛋白質(zhì)在植入材料表面的吸附是一個非常復(fù)雜的過程，目前對其微觀機理也沒有形成完全統(tǒng)一的解釋。一般認為:血漿蛋白在高分子生物材料表面上的吸附雖然與蛋白質(zhì)的濃度有關(guān)，但更取決于蛋白質(zhì)的種類和材料表面的組成與結(jié)構(gòu)。

纖維蛋白原(凝血因子I)是和凝血密切相關(guān)的血漿蛋白質(zhì)，在材料表面的吸附不僅會啟動人體凝血途徑，還可轉(zhuǎn)化為不溶性的纖維蛋白，它是血栓的主要成分之一。而Wahid Khan等［18-19］的研究結(jié)果表明，人工植入材料表面可逆吸附的血漿白蛋白層則具有良好的抗凝血性能。但是，在醫(yī)用金屬材料表面，白蛋白的競爭吸附率卻顯著低于纖維蛋白原及其它凝血因子［20］。而且，蛋白質(zhì)在人工植入生物材料表面吸附后，其空間構(gòu)象會發(fā)生不同程度的變化，在疏水性材料上的變化較在親水性材料上的要大。而 Y.L.Jeyachandran等［19-20］的研究結(jié)果表明，只有吸附后構(gòu)象變化小，具有可逆吸附特性的血漿白蛋白層才具有良好的抗凝血性能。

因此，本實驗通過化學(xué)方法提高TLM合金表面的親水性，并將白蛋白共價固定在具有良好血液相容性的TiO2表面［14-15］，不僅可增加材料表面的白蛋白濃度，還能盡量保持白蛋白的空間構(gòu)象，極大程度協(xié)同利用TiO2和白蛋白的抗凝血效果，顯著提高TLM合金的抗凝血性能。

3 結(jié)論

(1)通過溶膠-凝膠法在TLM合金表面鍍TiO2膜，并將該薄膜活化處理后通過靜電自組裝可在其表面制備出白蛋白涂層。

(2)經(jīng)白蛋白涂層修飾后，TLM合金表面的親水性增強，動態(tài)凝血時間也有所延長，合金表面黏附的血小板數(shù)量很少且沒有被明顯激活，即白蛋白涂層可明顯提高TLM合金的抗凝血性能。

［1］Pradier C M，Costa D，Rubio C，et al.Role of salts on BSA adsorption on stainless steel in aqueous solutions.I.FTIRRAS and XPS characterization［J］.Surface and Interface Analysis，2002，34(1):50-54.

［2］Weng Y J，Qi F，Huang N，et al.Photochemical immobilization of bovine serum albumin on Ti-O and evaluations in vitro and in vivo［J］.Applied Surface Science，2008，255(2):489-493.

［3］Brynda E，Milan Houska，Markéta Jirou?ková，et al.Albumin and heparin multilayer coatings for blood-contacting medical devices［J］.Journal of Biomedical Materials Research，2000，51(2):249-257.

［4］Kowalczyńska H M，Nowak-Wyrzykowska M，Szczepankiewicz A A，et al.Albumin adsorption on unmodified and sulfonated polystyrene surfaces，in relation to cell-substratum adhesion［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2011，84(2):536-544.

［5］Wojciech Chrzanowski，Ensanya Ali Abou Neel，David Andrew Armitage，et al.Effect of surface treatment on the bioactivity of nickel-titanium［J］.Acta Biomaterialia，2008，4(6):1969-1984.

［6］Claudia Sperling，Milan Houska，Eduard Brynda，et al.In vitro hemocompatibility of albumin-heparin multilayer coatings on polyethersulfone prepared by the layer-by-layer technique［J］.Journal of Biomedical Materials Research Part A，2006，76A(4):681-689.

［7］余森，于振濤，牛金龍，等.醫(yī)用鈦合金 Ti-3Zr-2Sn-3Mo-25Nb表面自組裝抗凝血復(fù)合涂層的構(gòu)建及其血液相容性研究［J］.金屬熱處理，2012(27):16-20.

［8］Weng Y J，Hou R X，Li G C，et al.Immobilization of bovine serum albumin on TiO2film via chemisorption of H3PO4interface and effects on platelets adhesion［J］.Applied Surface Science，2008，254(9):2712-2719.

［9］Zhentao Yu，Gui Wang，Xiqun Ma，et al.Development of biomedical near β titanium alloys［J］.Materials Science Forum，2009，618-619:303-306.

［10］張明華，于振濤，周廉，等.β型鈦合金材料的生物相容性評價［J］.稀有金屬材料與工程，2007，36(10):1815-1818.

［11］Milan Houska，Eduard Brynda，Andrey Solovyev，et al.Hemocompatible albumin-heparin coatings prepared by the layer-by-layer technique.The effect of layer ordering on thrombin inhibition and platelet adhesion［J］.Journal of Biomedical Materials Research Part A，2008，86A(3):769-778.

［12］Tianfa Wen，Jianping Gao，Juyun Shen，et al.Preparation and characterization of TiO2thin films by the sol-gel process［J］.Journal of Materials Science，2001，36(24):5923-5926.

［13］Michael Gr?tzel.Sol-gel processed TiO2films for photovoltaic applications［J］.Journal of Sol-Gel Science and Technology，2001，22(1/2):7-13

［14］Xuanyong Liu，Paul K.Chu，Chuanxian Ding.Surface modification of titanium，titanium alloys，and related materials for biomedical applications［J］.Materials Science and Engineering:R:Reports，2004，47(3/4):49-121.

［15］Huang N，Yang P，Leng Y X，et al.Hemocompatibility of titanium oxide films［J］.Biomaterials，2003，24(13):2177-2187.

［16］Wang Xianghui，Zhang Feng，Li Changrong，et al.Improvement of blood compatibility of artificial heart valves via titanium oxide film coated on low temperature isotropic carbon［J］.Surface and Coatings Technology，2000，128-129(1):36-42.

［17］Chang Zhang，Jing Jin，Jie Zhao，et al.Functionalized polypropylene non-woven fabric membrane with bovine serum albumin and its hemocompatibility enhancement［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2013，102(1):45-52.

［18］Wahid Khan，Mamta Kapoor，Neeraj Kumar.Covalent attachment of proteins to functionalized polypyrrole-coated metallic surfaces for improved biocompatibility［J］.Acta Biomaterialia，2007，3(4):541-549

［19］Jeyachandran Y L，Mielczarski J A，Mielczarski E，at al.Efficiency of blocking of non-specific interaction of different proteins by BSA adsorbed on hydrophobic and hydrophilic surfaces［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2010，341(1):136-142.

［20］Willem Norde，Carla E Giacomelli.BSA structural changes during homomolecular exchange between the adsorbed and the dissolved states［J］.Journal of Biotechnology.2000，79(3):259-268.