唐暉慧，金美東

1(黃山學(xué)院旅游學(xué)院，安徽 黃山，245021) 2(黃山學(xué)院教育科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山，245021)

精油是一種純天然的、成分復(fù)雜并具有良好香氣的植物精華成分，通常具有抗菌、抗氧化、抗炎、驅(qū)蟲和安神等功能活性，被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和醫(yī)療美容行業(yè)［1-3］。艾納香(Blumea balsamifera (L． )DC．)為菊科(Asteraceae)植物，廣泛分布于中國貴州、云南、廣西、海南以及東南亞多個國家［4］。艾納香在中國南方作為傳統(tǒng)民族草藥已有悠久歷史，醫(yī)書記載艾納香具有治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、產(chǎn)后痛風(fēng)、濕疹、皮炎等疾?。?］。在東南亞，艾納香常被用來熏蒸沐浴，添加到煙草和茶飲料中，并作為草藥用于緩解產(chǎn)后痛風(fēng)及防治皮膚病等［5］。艾納香精油在民間被認(rèn)為是艾納香的精華所在，因其獨(dú)特香氣和記載的藥用作用(消炎、消腫、止痛等)受到香精香料和醫(yī)療美容及化妝品行業(yè)親睞。目前，中國、孟加拉和泰國的多位學(xué)者研究了中國貴州、云南、廣西和泰國、孟加拉產(chǎn)艾納香揮發(fā)油的化學(xué)組成和抗菌及驅(qū)蟲活性［5-10］。這些學(xué)者多研究艾納香揮發(fā)油，Bhuiyan 等利用Clevenger裝置提取泰國和孟加拉產(chǎn)艾納香葉精油，并分析其化學(xué)組成［5，7］。

我國的海南島因氣候環(huán)境適宜艾納香生長，全島廣泛分布，蘊(yùn)藏量豐富，海南也成為即貴州之后又一個重要的艾納香產(chǎn)地。本研究利用GC-MS 分析瓊產(chǎn)艾納香葉精油的化學(xué)組成，通過DPPH 自由基清除試驗(yàn)、β-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)和硫代巴比妥酸法研究其抗氧化活性，通過抑菌圈和最小抑菌濃度2 個指標(biāo)考察其抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

艾納香葉，采自海南省五指山，自然陰干進(jìn)行破碎處理得干艾納香葉粉末;金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、假絲酵母、黃曲霉，均購于廣東省微生物研究所;DPPH、正己烷(色譜純)，美國Sigma-Aldrich 公司;C8-C22正構(gòu)烷烴，美國Accustand 公司;TBHQ、Ve、Vc、β-胡蘿卜素、亞油酸、吐溫40、AAPH、硫代巴比妥酸、十二烷基磺酸鈉、慶大霉素、酵母浸膏、牛肉膏蛋白胨、葡萄糖、NaCl、瓊脂條等，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SW-CJ-2C 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠;Varian 1200L GC/MS-MS 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Varian公司;DB-5 彈性石英毛細(xì)管柱(30 m ×0．25 mm，0．25 μm)，美國Agilent 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 提取艾納香葉精油

稱取50 g 艾納香葉粉末，置于2 L 蒸餾瓶中，再加入1 L 蒸餾水，使用Clevenger 氏裝置通過水蒸氣蒸餾法提取精油，蒸餾6 h 后收集裝置中的油相。以上試驗(yàn)重復(fù)8 次，將每次收得的精油集中并加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾后得到具有濃郁香氣的艾納香葉精油，得率為0．62%。

1．2．2 艾納香葉精油主要成分分析

將提取的艾納香葉精油溶解于正己烷(色譜純)，配置成濃度為200 μg/mL 待測樣，利用GC-MS對其進(jìn)行分析，確定其主要化學(xué)成分及其相對含量。升溫程序，初溫40 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣(He)流速1．0 mL/min。萃取頭在進(jìn)樣口于250 ℃解析3 min。質(zhì)譜條件，電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流35 μA，檢測器電壓1000 V，接口溫度280 ℃，掃描質(zhì)量范圍50 ～500 amu。

化合物定性采用保留指數(shù)和質(zhì)譜圖對照2 種方法?；衔锏谋Ａ糁笖?shù)是根據(jù)其保留時間與C8-C22正構(gòu)烷烴的保留時間按照保留指數(shù)計(jì)算公式計(jì)算而得;采集到的質(zhì)譜圖與NIST 和Wiley 標(biāo)準(zhǔn)譜庫對照，對組分定性，僅報(bào)道正反匹配度均大于800(最大值1000)的鑒定結(jié)果。用峰面積歸一法計(jì)算各化學(xué)成分的相對含量。

1．2．3 艾納香葉精油抗氧化活性研究

1．2．3．1 DPPH 自由基清除試驗(yàn)

通過DPPH 自由基清除率表現(xiàn)艾納香葉精油的抗氧化活性。配制濃度分別為1、2、4、6、8、10、15、20和40 g/L 的受試樣品乙醇溶液。分別取1 mL 受試品溶液與2 mL 濃度為0．1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液混合，立刻于517 nm 處測定吸光度，在避光處靜置1 h，再測吸光度，不加樣的DPPH 乙醇液為空白樣。實(shí)驗(yàn)平行測定3 次。自由基清除率按下式計(jì)算:

清除率/% = ［( AC(0)－ AC(t)) /AC(0)］× 100

式中:AC(0)，t = 0 時的空白吸光度，AC(t)，測試樣在t = 1 h 時的吸光度。

1．2．3．2 β-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)法

將0．1 mg β-胡蘿卜素用10 mL 三氯甲烷于圓底瓶中溶解，加入20 mg 亞油酸和100 mg 吐溫40，然后于50 ℃旋轉(zhuǎn)真空干燥。加入50 mL 含氧蒸餾水，在超聲波中形成乳化液A。取200 μL 濃度分別為0．1，0．5，1，2，4，6 和8 g/L 的受試樣品乙醇液與5 mL乳化A 液于試管中混合，等量乙醇代替作為空白樣。在50 ℃保溫，于470 nm 測定吸光度。測定平行3次?？寡趸视孟率接?jì)算。

式中:AA(120)，測試物在t =120 min 時的吸光度，AC(120)，空白在t=120 min 是的吸光度，AC(0)，空白在t=0 min 時的吸光度。

1．2．3．3 硫代巴比妥酸法

分別取0．1 mL 濃度為10，20，40 g/L 的樣品乙醇液與0．5 mL 蛋黃乳濁液混合，加入0．05 mL 的AAPH 自由基溶液(0．07 mol/L)引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。隨后即加入1．5 mL 乙酸溶液(20%，pH 3．5)和1．5 mL 濃度為0．8%硫代巴比妥酸液(用11 g/L)十二烷基硫酸鈉溶液配制)，振蕩均勻。不加精油樣品的為空白樣。然后于95 ℃水浴保持60 min。冷卻后，每個試管中加入5 mL 正丁醇，充分萃取，于1 200 g 離心15 min。傾出有機(jī)層在532 nm 處測定吸光度值。測定平行3 次。抗氧化指數(shù)AI 用下式計(jì)算。

式中:AC，完全氧化空白的吸光度，AT，測試樣品的吸光度。

1．2．4 艾納香葉精油抗菌活性研究

1．2．4．1 菌懸液的制備

將受試細(xì)菌菌株按1∶100 接種活化，在固體LB培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取單個菌落，接種到液體培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)18 h。采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕河靡后w培養(yǎng)基稀釋到合適濃度，本實(shí)驗(yàn)中菌液濃度為106CFU/mL。將受試真菌菌株用液體SDA培養(yǎng)基使菌種融化分散，30 ℃培養(yǎng)24 h，在SDA 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)48 ～72 h。將孢子刮入吐溫80 生理鹽水溶液作為母液，調(diào)整濃度為106CFU/mL。

1．2．4．2 濾紙方法(瓊脂擴(kuò)散法)

濾紙片(6 mm)經(jīng)滅菌后，分別點(diǎn)上5 μL 精油DMSO 溶液，無菌條件下貼在涂有菌液的固體培養(yǎng)基上，并用DMSO 做空白對照，細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測抑菌圈直徑，真菌在30 ℃下培養(yǎng)48 ～72 h 后測抑菌圈直徑，每種受試物6 次重復(fù)。

1．2．4．3 瓊脂稀釋法

用固體培養(yǎng)基以二倍稀釋法對精油進(jìn)行梯度稀釋，稀釋成13 個2 倍系列濃度，最后一平皿不加精油作為陰性對照，并用DMSO 做空白對照。最后點(diǎn)上配置的菌懸液。細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h，真菌在30℃下培養(yǎng)48 ～72 h，無明顯菌落生長的平皿的精油濃度即為精油的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。試驗(yàn)平行3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊產(chǎn)艾納香葉精油的化學(xué)成分分析

聯(lián)合GC-MS 技術(shù)對艾納香葉精油進(jìn)行分析，通過質(zhì)譜庫檢索和保留指數(shù)比對分析，檢出精油的成分組成見表1。初步定性組分45 種，其中有37 種屬于萜類化合物，單萜19 種(48．55%)，倍半萜18 種(39．91%)。在單萜中，萜烯種類最多，共10 種(8．65%);萜醇相對含量最高，6 種總含量達(dá)29．95%;其他依次為萜酮2 種(9．64%)，萜酯1 種(0．31%)。在倍半萜中，萜烯種類最多，共10 種，相對含量也最高，達(dá)到37．59%;另一類是萜醇8 種(2．32%)。圖1 為精油的GC-MS 總離子圖。精油的相對含量前 5 位的組分分別是(- )-龍腦(28．45%)、石竹烯(22．98%)、樟腦(9．56%)、α-蓽澄茄烯(8．32%)和β-蒎烯(4．32%)。這些組分賦予了艾納香葉精油濃郁的中藥香氣，主體表現(xiàn)為樟腦香和草藥香氣［11］。目前已有多個產(chǎn)地的艾納香揮發(fā)油或精油的化學(xué)成分報(bào)道，如貴州羅甸產(chǎn)艾納香揮發(fā)油主要含有(-)-龍腦(57%)、石竹烯(8%)和樟腦(5%)［6，10］;廣 西 南 寧 產(chǎn) 艾 納 香 精 油 主 要 成 分 是(-)-龍 腦(12%)、1，8-桉 葉 醇(20%)、石 竹 烯(10%)和樟腦(8%);云南普洱產(chǎn)艾納香揮發(fā)油主要成分是(-)-龍腦(52%)和樟腦(18%)［8］;泰國產(chǎn)艾納香精油主要成分是(- )-龍腦(25%)和樟腦(20%)［9］;孟加拉產(chǎn)艾納香精油的主要成分是(-)-龍腦(33%)、石竹烯(8%)、喇叭茶醇(7%)和氧化石竹烯(4%)［7］。本研究中瓊產(chǎn)艾納香葉精油與以上多個產(chǎn)地的艾納香揮發(fā)油或精油比較后發(fā)現(xiàn)，瓊產(chǎn)艾納香葉精油中(-)-龍腦相對含量依然是最高的，但并未超過半數(shù)，而其石竹烯、α-蓽澄茄烯和β-蒎烯的相對含量都是其他揮發(fā)油或精油所不具備的高含量，這說明瓊產(chǎn)艾納香葉精油具有主要成分豐富的特點(diǎn)，也可能給其帶來獨(dú)特的活性特征。這些組分已經(jīng)被報(bào)道具有抗氧化和抗菌的等活性，艾納香葉精油也可能具有這類活性，下面就對艾納香葉精油的抗氧化和抗菌活性進(jìn)行初步研究。

2.2 瓊產(chǎn)艾納香葉精油抗氧化活性

抗氧化物主要通過兩種機(jī)制清除自由基，即氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)和電子轉(zhuǎn)移(SET)［12-13］。沒有某種單一的測試方法足以評價樣品的抗氧化活性，所以需要多種方法應(yīng)用于樣品的抗氧化試驗(yàn)中。通過DPPH自由基清除試驗(yàn)、β-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)和硫代巴比妥酸法研究瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抗氧化活性，同時與商業(yè)化抗氧化劑水溶性Vc、VE、TBHQ 比較效果。DPPH 自由基是一種穩(wěn)定的氮中心的自由基，DPPH 自由基清除能力是一種最常見的衡量化合物抗氧化活性指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于定量測定生物樣品和食品等物質(zhì)的抗氧化能力［14］。DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)屬于SET類方法，DPPH 自由基有單電子，當(dāng)有自由基清除劑存在時，與其單電子配對而使褪色，褪色程度與其接受電子的數(shù)量成線性定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)快速定量分析［15］。由圖2 可知，艾納香葉精油對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)，在1 ～20 mg/mL 濃度內(nèi)成線性關(guān)系。從表2 發(fā)現(xiàn)，Vc、VE和TBHQ 3 種商業(yè)化的強(qiáng)抗氧化劑的DPPH 自由基清除能力很高，而且效果接近，IC50在11 ～14 μg/mL;而瓊產(chǎn)艾納香葉精油對DPPH 自由基清除率的IC50為11．26 mg/mL。精油的DPPH 自由基清除能力與強(qiáng)抗氧化劑相比效果差距巨大，但是也表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性，可推測電子轉(zhuǎn)移作用機(jī)制不是其抗氧化作用的主要機(jī)制。

表1 瓊產(chǎn)艾納香葉精油化學(xué)成分Table 1 Chemical compounds of essential oil from Qiong B. balsamifera (L.)DC. leaves

圖1 瓊產(chǎn)艾納香葉精油的GC-MS 總離子圖Fig．1 GC-MS total ion chromatogram of essential oil of Qiong B． balsamifera (L．)DC． leaves

表2 瓊產(chǎn)艾納香葉精油和商業(yè)化抗氧化劑的抗氧化作用Table 2 Antioxidant activities of essential oil of Qiong B. balsamifera (L.)DC.leaves and commercial antioxidants

圖2 瓊產(chǎn)艾納香葉精油的DPPH 自由基清除率Fig．2 DPPH radical scavenging of essential oil of Qiong Blumea balsamifera (L．)DC． leaves

β-胡蘿卜素漂白(BCB)試驗(yàn)主要是評價抗氧化物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中抑制脂質(zhì)氫過氧化前期的能力，屬于HAT 類方法。圖3 為采用β-胡蘿卜素漂白法測定的瓊產(chǎn)艾納香葉精油抗氧化活性。表2 為幾種抗氧化物活性的比較，在脂質(zhì)體系中醇溶性的VE是公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化劑，在本試驗(yàn)條件下，VE再現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化性，其半抑制濃度IC50約為0．017 g/L。但是作為強(qiáng)抗氧化劑的水溶性Vc 幾乎不顯現(xiàn)其抗氧化活性，未能測出其IC50值。這種現(xiàn)象稱為脂質(zhì)體系中的“極性反?！?polar para-dox)，其原因是由于水溶性極性物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中主要集中在水相，而脂相中的濃度極低。瓊產(chǎn)艾納香葉精油在高濃度時也表現(xiàn)出較好的抑制β-胡蘿卜素漂白的活性，IC50約為3．55 g/L。與2 種強(qiáng)抗氧化劑比較發(fā)現(xiàn)，精油的IC50值與強(qiáng)抗氧化劑之間的差距較DPPH 自由基清除試驗(yàn)縮小，說明精油在脂質(zhì)體系中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。

圖3 瓊產(chǎn)艾納香葉精油的β-胡蘿卜素漂白抑制活性Fig．3 BCB inhibition of essential oil of Qiong Blumea balsamifera (L．)DC． leaves

硫代巴比妥酸法(TBARS)主要衡量的是抗氧化劑清除能導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的自由基的能力，同時也能衡量弱親脂性抗氧化劑的抗氧化能力，屬于HAT 類方法，此法也被認(rèn)為是最接近真實(shí)環(huán)境的測試方法。由于水溶性抗氧化劑會出現(xiàn)“極性反?！爆F(xiàn)象，所以該法僅對瓊產(chǎn)艾納香葉精油和脂溶性的VE、TBHQ進(jìn)行測試。如表3 所示，精油和其他抗氧化劑的抗氧化指數(shù)均隨受試濃度的升高而上升，同時還發(fā)現(xiàn)精油與VE和TBHQ 的差距并未表現(xiàn)出DPPH 和BCB 試驗(yàn)中巨大的差距。精油表現(xiàn)出的抗氧化活性主要來源于其中萜烯類化合物，如石竹烯等。從3 個測試結(jié)果看，精油抗氧化作用機(jī)制主要是氫原子轉(zhuǎn)移作用，電子轉(zhuǎn)移作用較弱。雖然精油的抗氧化能力與公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化劑仍存在差距，但是TBARS 結(jié)果說明瓊產(chǎn)艾納香葉精油在接近真實(shí)環(huán)境的體系中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化能力?？梢哉J(rèn)為瓊產(chǎn)艾納香葉精油作為一種純天然產(chǎn)物，具有成為保健食品和化妝品等高檔產(chǎn)品中天然抗氧化添加劑的潛力。

表3 瓊產(chǎn)艾納香葉精油和商業(yè)化抗氧化劑的硫代巴比妥酸試驗(yàn)Table 3 Essential oil of Qiong B. balsamifera (L.)DC. leaves and commercial antioxidants TBARS

2.3 瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抗菌活性

植物精油普遍表現(xiàn)出了抗菌性能，但是不同精油對不同菌種的抑制能力存在差異，需要做詳細(xì)的研究。選用2 種革蘭氏陽性細(xì)菌，2 種革蘭氏陰性細(xì)菌和2 種真菌作為測試菌，通過抑菌圈和最小抑菌濃度(MIC)2 個指標(biāo)對瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抑菌活性進(jìn)行初步研究。由表4 可知，比較抑菌圈發(fā)現(xiàn)精油對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑制效果明顯好于陰性細(xì)菌，對金黃色葡萄球菌的抑制效果最強(qiáng)。對真菌的抑制效果略強(qiáng)于細(xì)菌，對假絲酵母的抑制能力稍強(qiáng)于黃曲霉。比較MIC 發(fā)現(xiàn)精油對真菌的抑制能力明顯強(qiáng)于細(xì)菌，2種真菌的MIC 都是625 μg/mL，對金黃色葡萄球菌抑制效果較好(625μg/mL)，對其他3 種細(xì)菌的抑制能力相對較弱(2 500 μg/mL)。據(jù)泰國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，泰國產(chǎn)艾納香精油對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌都沒有表現(xiàn)出抑菌活性，僅對革蘭氏陽性菌蠟樣芽孢桿菌(MIC:0．15 mg/mL)和金黃色葡萄球菌(MIC:1．2 mg/mL)及真菌假絲酵母(MIC:1．2 mg/mL)表現(xiàn)出抑菌活性［5］。與其相比，瓊產(chǎn)艾納香葉精油具有更加廣泛的抗菌能力，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌都有抑制活性，而且對金黃色葡萄球菌、假絲酵母和黃曲霉具有更強(qiáng)的抑制能力。這種良好表現(xiàn)主要得益于其含有的(-)-龍腦、石竹烯和樟腦，這些物質(zhì)的抗菌活性已有報(bào)道［16-17］，還得益于瓊產(chǎn)艾納香葉精油中各化學(xué)組分相對含量較平均，呈現(xiàn)多樣性表現(xiàn)，從而表現(xiàn)出廣譜抗菌效果。雖然其表現(xiàn)出的抑菌活性遠(yuǎn)低于慶大霉素的抑菌能力，但作為天然植物精油已算較好的表現(xiàn)。面對使用抗生素易產(chǎn)生耐藥性的問題，瓊產(chǎn)艾納香葉精油表現(xiàn)出的抗菌活性說明其是一種很好的天然抗菌劑，可應(yīng)用于食品和醫(yī)療美容等行業(yè)。

表4 瓊產(chǎn)艾納香葉精油與抗生素的抑菌活性Table 4 Antimicrobial activities of essential oil and antibiotic

3 結(jié)論

通過體外實(shí)驗(yàn)對瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抗氧化和抗菌活性進(jìn)行了初步研究。利用水蒸氣蒸餾法獲得精油，得率為0．62%;經(jīng)過GC-MS 分析，精油被定性檢出化合物45 種，主要是單萜和倍半萜類化合物，相對含量較高的組分是(-)-龍腦、石竹烯、樟腦和α-蓽澄茄烯。通過DPPH 自由基清除試驗(yàn)、β-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)和硫代巴比妥酸法試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精油具有較強(qiáng)的抗氧化活性。同時，精油對6 種受試菌都表現(xiàn)出了抑制活性，對金黃色葡萄球菌、假絲酵母和黃曲霉具有較好的抑制能力，對大腸桿菌、李斯特氏菌和沙門氏菌也表現(xiàn)出了抑制活性。從以上抗氧化和抗菌活性看，瓊產(chǎn)艾納香葉精油具有開發(fā)成為食品和化妝品天然抗氧化劑及抗菌劑的潛力，應(yīng)用范圍和效果還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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