游玉明，黃琳琳

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 永川，402160)

山胡椒(Litsea cubeba)，又稱山蒼子、木姜子、山雞椒，為樟科(Lauraceae)木姜子屬多年生落葉小喬木，廣泛分布于亞洲熱帶，亞熱帶及澳洲等地，在我國(guó)多分布于長(zhǎng)江流域以南各?。?－2］。據(jù)研究山胡椒果實(shí)中含有豐富的揮發(fā)油、生物堿、黃酮類、γ-丁內(nèi)酯類及半萜類化合物，具有廣譜抗菌、溫中理氣、消腫止痛等多方面功效，是我國(guó)衛(wèi)生部公布的藥食兼用植物材料，有較高的食用及藥用價(jià)值［3－5］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)山胡椒的研究主要集中在山胡椒精油的提取、化學(xué)成分分析及其生物活性等方面［6－9］，而對(duì)山胡椒提取物抑菌活性方面的研究鮮有報(bào)道?，F(xiàn)代食品工業(yè)中使用的防腐劑大多是化學(xué)防腐劑，由于化學(xué)防腐劑的安全性問(wèn)題，開(kāi)發(fā)植物天然防腐劑是目前食品防腐研究的熱點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了山胡椒提取物對(duì)常見(jiàn)食品腐敗菌的抑制作用及其影響因素，以期為山胡椒的綜合利用及新型安全天然食品防腐劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山胡椒，采摘于重慶市開(kāi)縣趙家街道漁樂(lè)基地，自然條件下陰干;乙酸乙酯、無(wú)水乙醇(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

供試菌種:大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、熒光假單孢菌(P.Fluorescens)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，由西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用于細(xì)菌培養(yǎng);馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)，用于酵母菌培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;SPX-250B-II 型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;LDZX-40AL 型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;RE-301 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義予華儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山胡椒不同溶劑提取物的制備

參照楊冬梅［10］的方法并做修改。將干燥的山胡椒粉碎過(guò)55 目篩，稱取山胡椒粉10 g，按1∶10 的固液比分別加3 種提取溶劑(水、75%乙醇溶液、乙酸乙酯)混合，在40℃恒溫?fù)u床(140 r/min)中浸提4h，抽濾得到提取液，于55℃條件下減壓干燥至膏狀。實(shí)驗(yàn)前將3 種提取物稀釋成2 g/mL(每1 mL 溶液中所含的有效成分來(lái)源于2 g 山胡椒粉)。

1.3.2 山胡椒提取物抑菌效果的測(cè)定

采用濾紙片法［11］。將滅菌后的濾紙片(直徑6 mm)分別放入3 種山胡椒提取物中浸泡30 min，取出晾干，備用。吸取100 μL 菌懸液(106～107個(gè)/mL)于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上涂布均勻，用無(wú)菌鑷子取含山胡椒提取物的濾紙片貼在固體平板上，每皿貼3 片，同時(shí)作對(duì)照。細(xì)菌37℃培養(yǎng)24 h，酵母菌28℃培養(yǎng)48 h 后觀察，測(cè)定濾紙片的抑菌圈直徑，結(jié)果取3 次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.3.3 最低抑菌濃度( MIC) 的確定

采用兩倍稀釋法［12］。分別以75%乙醇和乙酸乙酯為溶劑，將山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物分別配制成一系列濃度梯度的溶液，加入已融化好的培養(yǎng)基中，混合均勻，使培養(yǎng)液中提取物質(zhì)量濃度分別為1、1/2、1/4、1/8、1/16。待培養(yǎng)基凝固后，分別接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌及釀酒酵母，培養(yǎng)后觀察。以肉眼無(wú)可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)的最小質(zhì)量濃度為其MIC，以相應(yīng)溶劑作對(duì)照。

1.3.4 山胡椒提取物的抑菌穩(wěn)定性

1.3.4.1 熱處理對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

取10 mL 山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物于25 mL 具塞比色管中，分別置于80、100℃水浴和121℃濕熱條件下處理30 min，用濾紙片法測(cè)定樣品抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4.2 pH 對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

用0.1 mol/L 的NaOH 和0.1 mol/L 的HCl 分別將75%乙醇及乙酸乙酯提取液的pH 值調(diào)為3、5、7、9、11，用濾紙片法測(cè)定樣品抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4.3 紫外照射對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

取10 mL 山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物于25 mL 具塞比色管中，置于20 W 的紫外燈下30 cm處分別照射10、30、60 min，用濾紙片法測(cè)定樣品抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 山胡椒不同溶劑提取物的抑菌效果

由表1 可以看出，山胡椒不同溶劑提取物對(duì)供試菌抑菌能力不同，其中乙酸乙酯提取物對(duì)5 種供試菌的抑制效果最好，其對(duì)5 種供試菌的抑制效果按照抑菌圈直徑由大到小的順序?yàn)?枯草芽孢桿菌(14.3 mm)＞熒光假單胞菌(12.9 mm)＞金黃色葡萄球菌(12.0 mm)＞釀酒酵母(10.9 mm)＞大腸桿菌(6.5 mm)。其次是75%乙醇提取物，其對(duì)熒光假單胞菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為11.1 mm，說(shuō)明山胡椒提取物對(duì)微生物的抑制作用具有選擇性。而山胡椒水提取在每1 mL 溶液中所含有效成分來(lái)源于2 g山胡椒粉的濃度下，對(duì)5 種微生物的抑菌圈直徑均為濾紙片直徑(6.0 mm)，即均沒(méi)有抑制效果。這可能是因?yàn)樯胶分械闹饕行С煞秩缇?、生物堿及萜類等化合物為極性較弱的物質(zhì)，在水中溶解度較小，而在75%乙醇及乙酸乙酯這兩種提取溶劑中的溶解度較大。

表1 山胡椒不同溶劑提取物的抑菌效果Table 1 Inhibition zone diameters of different extracts from Litsea cubeba

2.2 山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物的MIC

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇研究山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物的MIC，采用2 倍稀釋法進(jìn)行測(cè)定。由表2 可知，山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物對(duì)不同供試菌具有不同的抑菌效果，2 種提取物均對(duì)熒光假單胞菌的抑制效果最好，MIC 為1/32 g/mL;其次為金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，MIC 為1/16 g/mL;而對(duì)釀酒酵母，乙酸乙酯提取物有較好的抑菌效果，其MIC 為1/16 g/mL。

表2 山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物MICTable 2 MICs of 60% ethanol and ethyl acetate extracts from Litsea cubeba

2.3 山胡椒提取物的抑菌穩(wěn)定性

2.3.1 熱處理對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

熱處理對(duì)提取物抑菌活性的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，山胡椒提取物經(jīng)不同溫度熱處理后仍保持較強(qiáng)的抑菌活性，在處理溫度不超過(guò)100℃時(shí)，與空白對(duì)照相比均沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，即使在121℃處理30 min 后，除75%乙醇提取物對(duì)熒光假單胞菌和乙酸乙酯提取物對(duì)釀酒酵母的抑菌性顯著性(P＜0.05)下降之外，對(duì)其他供試菌仍具有較高的活性，說(shuō)明了山胡椒中的抑菌成分具有較好的熱穩(wěn)定性，與顧仁勇等［2］對(duì)山胡椒精油抑菌穩(wěn)定性的研究結(jié)論一致。

2.3.2 pH 對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

圖1 熱處理對(duì)山胡椒提取物抑菌穩(wěn)定性的影響Fig 1 Effect of heat treatment on antimicrobial activity of extract from Litsea cubeba

pH 對(duì)提取物抑菌活性的影響見(jiàn)圖2。由圖2 可以看出，pH 值對(duì)山胡椒提取物抑菌活性有一定影響。當(dāng)pH ＜7 時(shí)，隨著pH 值的增加，抑菌性呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，當(dāng)pH ＞7 時(shí)，山胡椒75%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的抑菌性活性顯著(P＜0.05)下降;山胡椒乙酸乙酯提取物在pH ＞9 之后對(duì)釀酒酵母抑菌活性基本消失，而2 種提取物對(duì)枯草芽孢桿菌及熒光假單胞菌的抑制能力隨pH 值的升高而增加，這可能是因?yàn)樯胶诽崛∥镏写嬖邳S酮類等部分酸性抑菌成分和生物堿等堿性抑菌成分［13］，與溶液中的酸堿物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，喪失了對(duì)部分微生物的抑制作用。因此總體來(lái)看，山胡椒提取物在pH 值5 ～7時(shí)抑菌活性較強(qiáng)。

2.3.3 紫外照射對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

紫外照射對(duì)提取物抑菌穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3。從圖3 可知，紫外線照射對(duì)山胡椒提取物抑菌活性有較大的影響，但2 種提取物中的抑菌成分對(duì)紫外線的敏感性存在一定差異。75%乙醇提取物在經(jīng)紫外線照射30 min 后，對(duì)4 種供試菌的抑菌能力基本保持不變，但乙酸乙酯提取物僅在紫外照射10 min 后能保持較強(qiáng)的抑菌活性，當(dāng)經(jīng)紫外照射30 min 后，與對(duì)照相比其抑菌活性顯著性(P＜0.05)下降;2 種山胡椒提取物抑菌能力經(jīng)紫外照射60 min 后均顯著性下降(P＜0.05)，對(duì)釀酒酵母基本失去了抑制能力。這說(shuō)明山胡椒抑菌物質(zhì)中含有部分對(duì)紫外線敏感的抑菌成分，長(zhǎng)時(shí)間紫外照射，對(duì)山胡椒提取物抑菌能力有較大的破壞。因此，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)盡量縮短紫外照射時(shí)間。

圖2 pH 對(duì)山胡椒提取物抑菌穩(wěn)定性的影響Fig 2 Effect of pH on antimicrobial activity of extract from Litsea cubeba

圖3 紫外照射對(duì)山胡椒提取物抑菌穩(wěn)定性的影響Fig 3 Effect of UV irradiation on antimicrobial activity of extract from Litsea cubeba

3 結(jié)論

山胡椒75%乙醇提取物及乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌及釀酒酵母等5 種供試菌均有一定的抑制作用，3 種提取物抑菌效果大小順序?yàn)?乙酸乙酯提取物＞75%乙醇提取物＞水提物。MIC 實(shí)驗(yàn)表明，山胡椒提取物對(duì)不同菌種的抑制作用差別較大，其中抑制熒光假單孢菌的MIC 值最小，為1/32 g/mL。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，pH 值及紫外照射對(duì)山胡椒75%乙醇提取物及乙酸乙酯提取物的抑菌能力有一定影響，在pH 值為5 ～7 時(shí)對(duì)5 種供試菌的抑菌效果較好，但對(duì)紫外線的敏感性存在一定差異，75%乙醇提取物經(jīng)紫外照射30 min 后，其抑菌能力顯著下降(P＜0.05)，而乙酸乙酯提取物僅經(jīng)紫外照射10 min，則顯著性降低(P＜0.05)。2 種提取物熱穩(wěn)定良好，即使在121℃處理30 min 仍能保持較強(qiáng)抑菌能力。

本文主要考察了山胡椒提取物的抑菌活性及其穩(wěn)定性，但其中發(fā)揮主要抑菌活性的物質(zhì)組成還未能明確，下一步將進(jìn)行其主要抑菌活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析，從而明確抑菌的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)理。

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