宣麗，劉長江

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽 遼寧，110866)

軟棗獼猴桃(Actinidia arguta(Sieb. et Zucc. )Planch. ex Miq. )又名軟棗子、獼猴梨、藤梨，是獼猴桃科、獼猴桃屬多年生落葉藤本植物［1］。果實為翠綠色，表皮光滑無毛，具有很強的加工適應(yīng)性［2－3］。軟棗獼猴桃中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及生物活性成分［4－7］。軟棗獼猴桃多糖具有降血糖降血脂的作用［8］，作者在前期試驗中也發(fā)現(xiàn)軟棗獼猴桃多糖具有一定的抗氧化活性，但關(guān)于其免疫調(diào)節(jié)活性鮮見報道。本試驗擬通過研究軟棗獼猴桃多糖純化組分對大鼠免疫功能的影響，確證該成分提高機體免疫力的功效成分，為軟棗獼猴桃的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試驗動物

軟棗獼猴桃鮮果，采自遼寧省沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)東北野生獼猴桃資源圃，該品種經(jīng)遼寧省種子管理局鑒定并進行新品種備案，命名為長江一號。

SD 大鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量180 ～200 g ，合格證號為SCXK(遼)2010 －0001，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。領(lǐng)回后飼養(yǎng)于清潔恒溫環(huán)境中，自由飲水進食。

1.2 儀器與試劑

U-2910 型紫外可見分光光度計，日立先端科技股份有限公司;Heto-LL3000 凍干機，賽默飛世爾科技公司;HC23B-AV 型微波爐，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;5805 型高速冷凍離心機，德國艾本德公司;HEPA CLASS 100 CO2培養(yǎng)箱，Thermo Labsystems公司;Synergy HT 多功能酶標儀，美國Biotek 公司;SA-1480-2 超凈無菌工作臺，上海上凈凈化設(shè)備有限公司;倒置顯微鏡，重慶光電儀器公司;96 孔培養(yǎng)板，Greiner 公司。

刀豆蛋白A(ConA)、噻唑藍(MTT)，Sigma 公司;RPMI-1640 培養(yǎng)液，Gibco 公司;胎牛血清，Hyclone 公司;香菇多糖，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 軟棗獼猴桃多糖純品的制備

軟棗獼猴桃鮮果破碎后采用確定的乙醇除雜工藝:乙醇濃度80%、料液比1∶2(g/mL)、時間60 min，去除軟棗獼猴桃果中大量的色素類雜質(zhì)及還原糖，抽濾，棄去上清液，沉淀部分采用微波輔助提取工藝:料液比1∶9(g/mL)、微波處理時間10 min、微波功率500 W 進行提取，提取結(jié)束后，離心獲得的上清液進行減壓濃縮，然后用4 倍體積的無水乙醇沉淀，4℃冷藏12 h，沉淀離心后依次用石油醚、丙酮、無水乙醇浸泡洗滌，抽濾后冷凍干燥，得軟棗獼猴桃多糖粗品。

將軟棗獼猴桃多糖粗品復(fù)溶(5 mg/mL)，其水溶液經(jīng)DEAE-纖維素柱層析(D1.6 cm ×30 cm)，每次上樣10 mL，依次用蒸餾水、0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫，洗脫速度為1.25 mL/min，每管5 mL 分步收集，逐管檢測多糖含量(苯酚-硫酸法A490nm)，收集0.1 mol/L 鹽洗組分，透析脫鹽濃縮后經(jīng)SephadexG-100(D1.0 cm×40 cm)凝膠柱進行純化。凝膠層析柱先用0.1 mol/L NaCl 溶液平衡48 h，再以0.1 mol/L NaCl 溶液進行洗脫，每次上樣5mL，流速為0.5 mL/min，每管5 mL 分步收集，逐管檢測多糖含量(苯酚-硫酸法A490nm)，收集單一峰組分，透析脫鹽濃縮后，冷凍干燥，得軟棗獼猴桃多糖純品。

1.4 軟棗獼猴桃多糖對大鼠單核巨噬細胞吞噬活性的影響

SD 雄性大鼠40 只，隨機分為5 組，即空白對照組(生理鹽水)、陽性對照組［香菇多糖2 mg/(kg·d)］、多糖低劑量組［2mg/(kg·d)］、多糖中劑量組［10 mg/(kg·d)］和多糖高劑量組［20 mg/(kg·d)］，每組8 只，每只每日按相應(yīng)劑量灌胃1 次，連續(xù)給藥28 d。末次給藥30 min 后，大鼠稱重，按3 mL/kg 尾靜脈注射生理鹽水稀釋3 倍的印度墨汁，注入墨汁后2min 和10 min 分別從眼眶靜脈叢取血20 μL，并立即加到2mL 質(zhì)量分數(shù)為0.1%的Na2CO3溶液中，于波長675 nm 處測定吸光值，以Na2CO3溶液作為空白對照。最后將大鼠頸椎脫臼處死，分別稱取肝臟、脾臟、胸腺質(zhì)量。計算吞噬指數(shù)α 和免疫臟器指數(shù)［9］。

式中:A1和A2分別指注入墨汁后2 min 和10 min 取血測定的吸光值;t1為2 min;t2為10 min。

胸腺指數(shù)/% = 胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量×100

脾臟指數(shù)/% = 脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100

1.5 軟棗獼猴桃多糖對ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

試驗大鼠按1.4 節(jié)方法分組并給藥。

脾細胞懸液的制備:頸椎脫臼處死大鼠，75%酒精中浸泡消毒。無菌取大鼠脾臟，置于盛有適量無菌Hanks 液的平皿內(nèi)，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾，用Hanks 液洗2 次，每次離心10 min(1 000 r/min)。棄上清液，細胞沉淀用適量RPMI-1640 完全培養(yǎng)液重懸，得單個脾細胞懸液。用臺酚蘭染色計數(shù)，活細胞數(shù)大于95%，用RPMI-1640 培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為3 ×106個/mL。

將脾細胞懸液加入96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，實驗孔加入10 μL 100 μg/mL ConA，對照孔加入10 μL RPMI-1640 培養(yǎng)液，重復(fù)3 孔，置5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)68 h，加入5 mg/mL MTT 20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入酸性異丙醇100 μL/孔，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標儀測各孔吸光值，測定波長為570 nm［10］。

轉(zhuǎn)化指數(shù)=實驗孔A570nm－對照孔A570nm

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所得數(shù)據(jù)用均值±標準差(x±s)表示，采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析及多重比較檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃多糖對大鼠免疫器官的影響

表1 列出不同劑量的軟棗獼猴桃多糖對大鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響情況。與對照組比較，陽性對照組、多糖低劑量組和多糖中劑量組大鼠的脾臟指數(shù)都有所升高，但無顯著性差異;多糖高劑量組大鼠的脾臟指數(shù)顯著升高(P＜0.05)。

表1 軟棗獼猴桃多糖對大鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響(x±s，n=8)Table 1 Effect of Actinidia arguta polysaccharide on thymus index and splenetic index (x±s，n=8)

與對照組比較，陽性對照組、多糖中劑量組和多糖高劑量組大鼠的胸腺指數(shù)顯著升高(P＜0.05);多糖低劑量組大鼠的胸腺指數(shù)與對照組無顯著性差異;多糖低、中劑量組與高劑量組之間差異顯著(P＜0.05);陽性對照組大鼠的胸腺指數(shù)與多糖高劑量組之間無顯著性差異。

2.2 軟棗獼猴桃多糖對大鼠碳廓清能力的影響

軟棗獼猴桃多糖對大鼠單核巨噬細胞吞噬活性的影響見表2。與對照組比較，多糖低劑量組大鼠的吞噬指數(shù)略有升高，但無顯著性差異;陽性對照組、多糖中劑量組和多糖高劑量組的吞噬指數(shù)均顯著高于空白對照組(P＜0.05);陽性對照組的吞噬指數(shù)＞多糖高劑量組＞多糖中劑量組，但三者之間無顯著性差異。結(jié)果表明軟棗獼猴桃多糖能顯著增強大鼠單核巨噬細胞的吞噬能力，加速碳粒的清除。

表2 軟棗獼猴桃多糖對大鼠碳廓清能力的影響(x±s，n=8)Table 2 Effect of Actinidia arguta polysaccharide on carbon clearance capacity of rats (x±s，n=8)

2.3 軟棗獼猴桃多糖對ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

表3 列出軟棗獼猴桃多糖對ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響情況，陽性對照組、多糖中劑量組和多糖高劑量組對ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù)均顯著高于空白對照組(P＜0.01);但多糖低劑量組對ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù)與空白對照組無顯著性差異;多糖高劑量組的轉(zhuǎn)化指數(shù)＞多糖中劑量組＞陽性對照組，但三者之間無顯著性差異。結(jié)果表明軟棗獼猴桃多糖對大鼠的脾淋巴細胞有直接促進有絲分裂作用，可通過激活T 細胞增強大鼠的細胞免疫功能。

表3 軟棗獼猴桃多糖對ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響(x±s，n=24)Table 3 Effect of Actinidia arguta polysaccharide on lymphocyte transformation in splenic cells induced by ConA (x±s，n=24)

3 結(jié)論

試驗結(jié)果顯示，10、20 mg/(kg·d)劑量組軟棗獼猴桃多糖均可顯著提高大鼠的胸腺指數(shù)、吞噬指數(shù)及ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù);20 mg/(kg·d)劑量組軟棗獼猴桃多糖可顯著提高大鼠的脾臟指數(shù)。2 mg/(kg·d)劑量組軟棗獼猴桃多糖也可提高大鼠的臟器指數(shù)、吞噬指數(shù)及脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù)，但與對照組之間無顯著性差異，表明隨著軟棗獼猴桃多糖劑量的增加，其免疫活性有所增強，但10 mg/(kg·d)和20 mg/(kg·d)劑量組之間對吞噬指數(shù)和脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù)的影響無顯著性差異，表明當(dāng)軟棗獼猴桃多糖達到一定劑量時，免疫活性與劑量之間的相關(guān)性減弱。上述研究結(jié)果表明，軟棗獼猴桃多糖是一種良好的免疫增強劑，在醫(yī)藥和保健品等方面具有一定的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

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