魏濤，孫浩，申玉龍，毛多斌

1(鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450002)

2(山東大學微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東 濟南，250100)

高溫酸性α-淀粉酶是淀粉制糖工業(yè)中重要的酶制劑，有著非常廣泛的應(yīng)用前景。發(fā)展淀粉制糖工業(yè)也是解決當前淀粉生產(chǎn)積壓的重要途徑。淀粉水解包括液化和糖化2 個步驟，高溫α-淀粉酶在液化過程中起關(guān)鍵作用，現(xiàn)在常用的高溫α-淀粉酶其最適pH 范圍為6 ～7，并且在酸性糖化條件下酶活力會明顯降低，不能滿足在酸性條件下淀粉原料液化的要求，因此開發(fā)一種高溫酸性α-淀粉酶具有重要意義［1－4］。

極端超嗜熱古菌Sulfolobus tokodaiistrain 7 于1983 年在日本九州島的別府熱泉中發(fā)現(xiàn)，是一種好養(yǎng)性異養(yǎng)微生物，能利用淀粉等多種多糖營養(yǎng)物，最適生長條件為80 ℃，pH 2.5 ～3，分類上屬泉古菌［5］?；蚪M測序結(jié)果和序列分析表明，在S.tokodaiistrain 7 基因組中存在多個淀粉酶基因［6］。本文將S.tokodaiistrain 7 中α-淀粉酶基因ST0817 在大腸桿菌中克隆表達，并詳細研究了酶學性質(zhì)，為對該酶進行定向進化以及高溫酸性α-淀粉酶工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

嗜熱古菌S.tokodaiistrain 7 購自JCM (Japan Collection of Microorganisms);大腸桿菌Escherichia coliDH5a 與E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL 為本實驗室保存?？寺∨c表達質(zhì)粒pET15b 購自Novagen公司。

1.2 工具酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA 連接試劑盒、ProbestTMDNA聚合酶，TaKaRa 公司產(chǎn)品;PCR 引物，由上海生工公司合成;質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自北京天根生物科技有限公司;直連淀粉、可溶性淀粉、支鏈淀粉、β-極限糊精、糖原、環(huán)糊精和普魯蘭糖，購自Sigma 公司。

1.3 高溫酸性α-淀粉酶基因克隆

根據(jù)S.tokodaiistrain 7 高溫酸性α-淀粉酶基因(ST0817)設(shè)計引物:上游:下游:5'- GCCCTCA TTT CAG CCA CTC TTTT AAAT ATTTTTC -3'，劃線部分分別為上游引物的NdeⅠ酶切位點與下游引物的SalⅠ酶切位點。100 μL PCR反應(yīng)體系:模板0.5 μL(25 ng)，dNTP (25 mmol/l)0.5 μL，引物(100 μmol/L)各0.5 μL，10 ×緩沖液10 μL，ProbestTMDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，超純水87.5 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃30s，55℃30s，72℃1 min，30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物回收經(jīng)NdeⅠ和SalⅠ酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的pET15b 上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切NdeⅠ和SalⅠ及上海生工測序驗證后將其命名為pET15b-ST0817。

1.4 蛋白的表達與純化

將測序正確的重組質(zhì)粒pET15b-ST0817 轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL 中。帶有重組質(zhì)粒的表達菌在20 mL 含100 mg/L 氨芐青霉素和34 mg/L 氯霉素的LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后按1∶100 的體積比接到1 000 mL LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm為0.5，加入終濃度0.2 mmol/L IPTG 于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，4℃8 000 r/min 離心10 min。收集菌體懸浮破壁buffer(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl)中，超聲波破碎菌體(功率300W，超聲時間5s，間隔時間5s，超聲次數(shù)150 次)。破壁后的菌液于75℃熱處理30 min，用10 000 g 離心10 min，去除不耐熱的蛋白沉淀，得到粗酶液。將粗酶過Ni-NTA 瓊脂糖親和層析得到純化的酶蛋白。將過鎳柱后的蛋白在50 mmol/L Tris/HCl (pH 8.0)緩沖液中透析，然后繼續(xù)過Superdex-200 (16/60)分子篩柱。利用50 mmol/L Tris/HCl，50 mmol/L NaCl(pH 8)的緩沖液進行洗脫，洗脫速度為0.5 mL/min，收集體積為0.5 mL。將純化后的酶蛋白液用離心過濾器(10 kDa，Millipore)進行濃縮，然后加入等體積的50%(V/V)的甘油，于－20℃保存。蛋白質(zhì)濃度用考馬斯亮藍比色Bradford 方法測定［7］。

1.5 高溫α-淀粉酶的活性檢測

高溫α-淀粉酶活性測定參照文獻［8］。酶活定義:1 g 固體酶粉(或1mL 液體酶)，于70℃、pH 6.0條件下，1 h 液化1 g 可溶性淀粉，即為1 個酶活力單位。

1.6 高溫α-淀粉酶反應(yīng)最適溫度和最適pH

酶最適反應(yīng)溫度:在50 ～80 ℃，每隔5℃測定1次酶活力，最大的活性定義為100%。

酶最適反應(yīng)pH:分別使用檸檬酸鈉緩沖液、乙酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液和Tris-HCl 緩沖液體系配制pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的系列緩沖液，以最適反應(yīng)pH 下所得酶活力定義為100%。

1.7 高溫α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性及耐酸性

酶的熱穩(wěn)定性:將適量的酶加入到500 μL 50 mmol/L Tris-HCl (pH 5.8)緩沖液中，分別在75、85、95℃處理2、4、6 和8 h 后取出樣品，用標準測定方法測定殘余的酶活力。未處理前的酶活力定義為100%。

酶的pH 穩(wěn)定性:將適量的酶加入各種緩沖液中:在pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 中分別處理60 min，然后再分別在對應(yīng)的pH 檢測酶活，以處理前的酶活性為100%。

酶的耐酸性:將適量的酶加入50 mmol/L 乙酸鈉緩沖液，pH 5.5、5.2 和5.0 處理30、60、90 和120 min后取出樣品，用標準測定方法測定殘余的酶活力。未處理前的酶活力定義為100%。

1.8 高溫α-淀粉酶底物特異性

對以下底物進行底物特異性檢測［9］:直鏈淀粉、可溶性淀粉、支鏈淀粉、β-極限糊精、糖原、環(huán)糊精和普魯蘭糖(濃度均為1 mg/mL)。

1.9 高溫α-淀粉酶對變性劑抗性的研究

為研究各種變性劑對酶活性的影響，適量酶蛋白在于各種試劑中于室溫下處理30 min，然后用標準酶活檢測方法測定殘余的酶活力。各種添加劑或變性劑為:重金屬鹽離子Mg2+，Mn2+，Co2+，Ca2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e2+(分別為5 mmol/L);金屬螯合劑EDTA(5 mmol/L);還原劑DTT(5 mmol/L);變性劑SDS(5%，W/V)、尿 素(4，8 mol/L)、Tween20、Tween80 和Trtion-X100(1%，5%，W/V);有機溶劑(50%，90%，W/V):乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇、甲苯、氯仿和DMSO;絲氨酸變性劑PMSF(5 mmol/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫α-淀粉酶基因的擴增和表達質(zhì)粒pET15b-ST0817 的構(gòu)建

以S.tokodaiistrain 7 全基因組DNA 序列為模板，PCR 擴增得到與預(yù)期大小相符的目的片段(1 332bp)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET15b-ST0817 經(jīng)雙酶切分析和DNA 測序驗證。結(jié)果表明，克隆的高溫酸性α-淀粉酶基因ST0817 與預(yù)期產(chǎn)物一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2 重組蛋白的表達與純化

將重組質(zhì)粒pET15b-ST0817 轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21-CodonPlus (DE3)-RIL 中，經(jīng)0.2 mmol/L IPTG 誘導表達目的蛋白，經(jīng)超聲破壁、70℃熱處理、鎳柱親核層析和分子篩純化，得到純化高溫α-淀粉酶，分子質(zhì)量是53.0 kDa，如圖1 所示。

圖1 α-淀粉酶的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE of the recombinant α-amylase

2.3 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

酶最適反應(yīng)溫度為75℃，表明該酶為耐高溫α-淀粉酶(如圖2)。熱穩(wěn)定性實驗表明，在85℃處理8 h，仍然保持50%左右的酶活力;75℃處理8 h，酶活力穩(wěn)定在90%以上(如圖3)。

圖2 最適反應(yīng)溫度Fig.2 Optimal temperature of the recombinant α-amylase

圖3 熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermostability of the recombinant α-amylase

2.4 最適pH、pH 穩(wěn)定性及耐酸性

該酶最適pH 為5.5，pH 4.5 ～7.5 處理60 min酶活力能保持最大活力的50%以上(如圖4 所示)。在pH 5.2 處理120 min，仍然保持50%左右的酶活力(如圖5 所示)。該酶的最適pH、pH 穩(wěn)定性及耐酸性相關(guān)實驗結(jié)果表明該酶是酸性α-淀粉酶。

圖4 最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性Fig.4 Optimal pH and pH stability of the recombinant α-amylase

圖5 耐酸性Fig.5 The acid tolerance of the recombinant α-amylase

2.5 α-淀粉酶底物特異性

α-淀粉酶對各種底物的催化活性如表1 所示。可以看出，該酶專一性水解直鏈淀粉和可溶性淀粉中的α-1，4 糖苷鍵，對這2 種底物的水解活性最高，對支鏈淀粉和β-極限糊精活性次之，糖原、環(huán)糊精和普魯蘭糖水解活性較小。

表1 重組α-淀粉酶的底物特異性Table 1 The substrate specificity of the recombinant α-amylase

2.6 金屬離子和抑制劑對α-淀粉酶的作用

如表2 所示，重金屬離子Mg2+，Mn2+，Co2+，Ca2+，Ni2+(為5 mmol/L)對該α-淀粉酶活性沒有影響，金屬螯合劑EDTA 對活力也沒有影響，說明該α-淀粉酶不是金屬離子依賴性酶。然而，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e2+明顯的抑制酶的活力，分別使酶活下降了55%、45%，32%左右。在5 mmol/L 還原劑DTT 作用下，該酶保持98%活性;絲氨酸變性劑PMSF(50 mmol/L)能使酶活力完全喪失(為起始酶活的1%)，說明絲氨酸殘基在酶的催化過程中起重要作用。

表2 金屬離子和抑制劑對重組α-淀粉酶的作用Table 2 Effect of various metals and inhibitors on the activity of the recombinant α-amylase

2.7 有機溶劑和變性劑對α-淀粉酶的作用

有機溶劑和變性劑對α-淀粉酶的作用情況見表3。

該酶在有機溶劑(50%，90%，W/V)乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇、甲苯、氯仿和DMSO 中保持起始酶活的80%以上，表明該酶具有較好的有機溶劑抗性;變性劑Tween20、Tween80 和Trtion-X100(5%，W/V)對酶活具有明顯的抑制作用，分別使酶活下降了20%、45%，48%左右;酶在變性劑SDS(5%，W/V)、尿素(4、8 mol/L)中活性穩(wěn)定(保持起始酶活的88%以上)。

表3 有機溶劑和變性劑對重組α-淀粉酶的作用Table 3 Effect of organic solvents and detergents on the activity of the recombinant α-amylase

續(xù)表3

3 結(jié)論

本文將來自超嗜熱古菌S.tokodaiistrain 7 預(yù)測的α-淀粉酶(ST0817)基因在大腸桿菌中克隆表達，IPTG 誘導表達，經(jīng)超聲波破壁，熱處理，Ni-NTA 柱親和層析和分子篩層析純化后，得到純化的α-淀粉酶。酶學性質(zhì)研究表明，該酶的最適溫度與最適pH 分別為75℃與pH 5.5，表明該酶是高溫酸性α-淀粉酶。同時該酶具有明顯的熱穩(wěn)定性，在85℃時的半衰期為8h。該酶對不同底物水解活性不同，直鏈淀粉＞可溶性淀粉＞支鏈淀粉＞β-極限糊精＞糖原＞環(huán)糊精＞普魯蘭糖。該酶對有機溶劑(乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇、甲苯、氯仿和DMSO)、變性劑(SDS)、尿素和重金屬離子(Mg2+、Mn2+、Co2+、Ca2+和Ni2+)等具有抵抗作用。金屬離子Ca2+和EDTA 對該酶的活性沒有影響，表明α-淀粉酶活性不依賴金屬離子，在液化和淀粉糖工藝中也無需添加金屬離子，可以簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本。由于該高溫酸性α-淀粉酶天然具有較強的pH 穩(wěn)定性，并且在酸性環(huán)境中具有較高的耐酸性，因此具有重要的潛在工業(yè)應(yīng)用前景。

［1］ 張麗萍，徐巖，金建中. 酸性α-淀粉酶的研究與應(yīng)用［J］． 釀酒，2002，29(3):19 －21.

［2］ 趙熒，劉紅巖，宮正宇，等. 地衣芽孢桿菌A.4041 耐高溫α-淀粉酶的純化及性質(zhì)［J］． 吉林大學自然科學學報，1997，3(3):85 －88.

［3］ Crab W，Mitchinson C. Enzymes involved in the precessing of starch to sugars［J］． Trends Biotechnol，1997，15(9):349 －352.

［4］ 王希菊，蔣宇，邵蔚藍. 海棲熱胞菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表達［J］． 微生物通報，2005，32(4):25－30.

［5］ Suzuki T，Iwasaki T，Uzawa T，et al.Sulfolobus tokodaiisp. nov. (f.Sulfolobussp. strain 7)，a new member of the gennusSulfolobusisolated from Beppu Hot Springs，Japan［J］． Extremophiles，2002，6(1):39 －44.

［6］ Kawarabayasi Y，Hino Y，Horikawa H，et al. Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon，Sulfolobus tokodaiistrain 7［J］． DNA Res，2001，8 (4):123 －140.

［7］ Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microfram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］． Anal biochem，1976，72(5):248 －254.

［8］ 沈微，王正祥，唐雪明，等. 古細菌Pyrococcus furiosus高嗜熱α-淀粉酶基因在大腸桿菌中的分泌表達［J］． 中國釀造，2003，124(1):12 －14.

［9］ Lee H S，Shockley K R，Schut G J，et al. Transcriptional and biochemical analysis of starch metabolism in the hyperthermophilic archaeonPyrococcus furiosus［J］． J Bacteriol，2006，188 (6):2 115 －2 125.