馮勁松，李瑋，劉燕，熱米拉，周文文，鄭曉冬

(浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州，310058)

有效霉素A(Validamycin A)又被稱作井岡霉素，是一種安全高效的抗真菌抗生素。目前在我國(guó)以及東南亞各主要糧食產(chǎn)區(qū)，有效霉素A 作為一種優(yōu)質(zhì)農(nóng)藥在防治水稻、玉米以及小麥紋枯病方面取得了顯著的成效［1］。另外，作為合成抗糖尿病臨床藥物阿卡波糖(拜糖平)和伏格列波糖(倍欣)的重要原料，有效霉素A 的發(fā)酵生產(chǎn)在醫(yī)藥領(lǐng)域也受到了廣泛關(guān)注［2］。目前工業(yè)化發(fā)酵采用的菌株是上海農(nóng)藥所報(bào)道的吸水鏈霉菌5008 變種(Streptomyces hygroscopicus 5008)，盡管自70 年代開始該菌株使用已有近40 年，但其代謝產(chǎn)物有效霉素A 仍是最為有效、應(yīng)用面積最廣的農(nóng)用抗生素。現(xiàn)階段我國(guó)的年需求量超過(guò)6萬(wàn)t，年產(chǎn)值超5 億元［3－4］。因此如何提高有效霉素A 產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

氨基酸作為重要的生物小分子，在微生物發(fā)酵過(guò)程中對(duì)菌體生長(zhǎng)以及抗生素合成起著關(guān)鍵性作用。作為抗生素合成的前體物質(zhì)，氨基酸可以直接參與到抗生素合成途徑中參與合成反應(yīng);氨基酸或其功能肽結(jié)構(gòu)可以作為抗生素合成過(guò)程的激活劑或抑制劑對(duì)代謝途徑中關(guān)鍵酶的活力進(jìn)行調(diào)節(jié);作為氮源，培養(yǎng)基中氨基酸的種類與含量也會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)速率;而作為兩性小分子，氨基酸的水解產(chǎn)物會(huì)造成培養(yǎng)基中pH 波動(dòng)，改變微生物的生長(zhǎng)環(huán)境。

在發(fā)酵過(guò)程中添加氨基酸促進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)量的方法已在很多微生物中進(jìn)行了應(yīng)用［5－8］。Cheng 等［9］發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加氨基酸會(huì)對(duì)鏈霉菌生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝產(chǎn)物合成有著顯著的影響。在吸水鏈霉菌5008的發(fā)酵過(guò)程中，其次級(jí)代謝物-有效霉素A 的合成會(huì)受多方面因素的影響［10－11］。汪世山等［12］利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)證實(shí)以黃豆餅粉作為氮源時(shí)，有效霉素A 產(chǎn)量會(huì)顯著提高。隨后Wei 等［13］進(jìn)一步驗(yàn)證了氮源的種類與含量對(duì)有效霉素A 產(chǎn)量影響的作用。有效霉素A 作為氨基糖苷類抗生素，其生物合成必定需要結(jié)合氮源提供的氨基以完成結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，所以氨基酸對(duì)其生物合成尤為重要，但目前對(duì)氨基酸影響有效霉素A 生物合成的研究十分有限。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在搖瓶中添加9 種不同種類的氨基酸，研究其對(duì)有效霉素A發(fā)酵過(guò)程的影響，以便系統(tǒng)地闡述氨基酸對(duì)吸水鏈霉菌5008 生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物積累的作用，為深入研究有效霉素A 合成過(guò)程中氨基的來(lái)源提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)菌種為吸水鏈霉菌5008(S. hygroscopicus 5008)，孢子懸浮于25%甘油中，－20℃保存。

產(chǎn)孢平板培養(yǎng)基(SFM)(g/L):黃豆餅粉20、甘露醇20、瓊脂20。

種子培養(yǎng)基(g/L):玉米粉30、黃豆餅粉22、酵母提取物10、NaCl 2、KH2PO40.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米粉100、黃豆餅粉25、酵母提取物5、NaCl 1、KH2PO41.5。

1.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):在250 mL 搖瓶中裝入50 mL 種子培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。在超凈工作臺(tái)中，接種0.1 mL 孢子懸浮液。培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)時(shí)間1d。

發(fā)酵培養(yǎng):在250 mL 搖瓶中裝入50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。在超凈工作臺(tái)中，接種5 mL 種子培養(yǎng)液。在接種12 h 后，在超凈臺(tái)中將滅菌好的氨基酸按照1、10、100 mmol/L 的終濃度加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。每隔24 h，用滅菌槍頭對(duì)同一發(fā)酵條件下的3 個(gè)搖瓶進(jìn)行取樣，每次吸取2 mL 培養(yǎng)液于離心管中用于后續(xù)檢測(cè)。培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)時(shí)間5d。

1.3 分析方法

1.3.1 有效霉素A 產(chǎn)量測(cè)定

本研究結(jié)合相關(guān)文章報(bào)道，以0 ～20 g/L 濃度范圍的有效霉素A 純品溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定有效霉素A 產(chǎn)量［11］。

吸取2 mL 發(fā)酵液于離心管，10 000 g 離心5 min，吸取0.5 mL 上清液于新離心管。加入0.5 mL氯仿，劇烈振蕩直至形成乳濁液。將乳濁液常溫靜置15 min，12 000 g 離心5 min。上清液用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。配制液相磷酸鹽溶液:吸取7.8 g/L的NaH2PO4·2H2O 溶液51 mL，吸取17.9 g/L 的Na2HPO4·12H2O 溶液49 mL，去離子水定容到1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 到7.0。溶液用0.22 μm 濾膜抽濾后超聲30 min，待用。色譜柱采用Elite Hypersil ODS2 C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流動(dòng)相為98%的磷酸鹽緩沖液與2%的甲醇，流速為1 mL/min，柱溫為35℃，出峰時(shí)間約為8 min。

1.3.2 菌體生長(zhǎng)量測(cè)定

由于發(fā)酵培養(yǎng)基中用作營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的玉米粉和黃豆餅粉都是實(shí)際生產(chǎn)中使用的固體顆粒材料，所以常規(guī)的干重法并不能準(zhǔn)確反映菌體生長(zhǎng)的情況。本實(shí)驗(yàn)采用Bradford 法測(cè)量細(xì)菌裂解后的蛋白量來(lái)反映菌體生長(zhǎng)［11－14］。

1.3.3 殘?zhí)呛繙y(cè)定

通過(guò)計(jì)算培養(yǎng)基中各組分的含糖量(玉米粉82.92%，黃豆餅粉24.57%，酵母粉25.89%)，得出培養(yǎng)基的初始糖濃度為90.35 g/L，并采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定殘?zhí)呛浚?0］，以反映培養(yǎng)基中總糖利用情況。

1.3.4 三磷酸甘油醛脫氫酶( GAPDH) 與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶( G6PD) 活力測(cè)定

G6PD 的測(cè)定方法參照Lee 的報(bào)道并進(jìn)行修改［15］。GAPDH 的測(cè)定方法參照Ralser 和Griffiths 的報(bào)道［11，16］。

以上數(shù)據(jù)均是取自3 個(gè)獨(dú)立樣本的平均值，在SPSS 軟件中采用獨(dú)立樣品t 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行分析，如果P值小于0.05，差異被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸最適添加濃度篩選及其對(duì)有效霉素A產(chǎn)量的影響

不同種類、不同添加量的氨基酸添加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同氨基酸添加量對(duì)有效霉素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of additive amounts of different amino acids on Val-A production

圖1 結(jié)果表明，所有氨基酸添加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)氨基酸添加濃度只有1 mmol/L 時(shí)，與對(duì)照組相比，有效霉素A 產(chǎn)量受到的影響有限;而當(dāng)氨基酸添加濃度達(dá)到10 mmol/L 時(shí)，除去半胱氨酸與甲硫氨酸添加組，其余組中有效霉素A 產(chǎn)量都有明顯的上升;當(dāng)氨基酸添加濃度提高至100 mmol/L，發(fā)酵產(chǎn)量并未有更為明顯的升高，這說(shuō)明10 mmol/L 的氨基酸濃度是促進(jìn)有效霉素A 產(chǎn)量的閾值濃度，并且從成本角度考慮也認(rèn)為10 mmol/L 是氨基酸添加發(fā)酵策略的最適添加濃度。這一現(xiàn)象與Stirrett［8］和Bouras［17］的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)添加氨基酸對(duì)抗生素產(chǎn)量的提升作用存在最適濃度，當(dāng)添加量超過(guò)這一濃度時(shí)，次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量并不會(huì)再有顯著提升。隨后在最適添加濃度下，對(duì)氨基酸影響有效霉素A 產(chǎn)量的結(jié)果進(jìn)行分類分析。

在測(cè)試的氨基酸中，精氨酸和賴氨酸為堿性。氨基酸;天冬氨酸和谷氨酸為酸性氨基酸;半胱氨酸為極性中性氨基酸;亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和蛋氨酸均為非極性中性氨基酸。由表1 可知，9 種氨基酸中僅有半胱氨酸對(duì)有效霉素產(chǎn)量沒(méi)有影響，其他8 種氨基酸均有顯著影響。除甲硫氨酸對(duì)有效霉素A 合成表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，其余7 種氨基酸均表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用。其中異亮氨酸與亮氨酸對(duì)產(chǎn)量提升促進(jìn)作用最大，與對(duì)照相比，分別使有效霉素A 產(chǎn)量提高了48%和43%。根據(jù)氨基酸的酸堿性對(duì)有效霉素A 產(chǎn)量影響進(jìn)行分類分析，結(jié)果顯示中性氨基酸效果最優(yōu)，其次為酸性氨基酸，堿性氨基酸效果最差。根據(jù)Jin 等［18］報(bào)道，當(dāng)發(fā)酵環(huán)境中pH 較低時(shí)會(huì)降低有效霉素A 的終產(chǎn)量，但我們通過(guò)添加強(qiáng)酸弱堿鹽和強(qiáng)堿弱酸鹽調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中pH 模擬該報(bào)道結(jié)論，最終產(chǎn)量結(jié)果并未顯示出與氨基酸添加實(shí)驗(yàn)相同的效果，而且氨基酸添加實(shí)驗(yàn)中2 種含硫的中性氨基酸，甲硫氨酸與半胱氨酸也未對(duì)有效霉素A 產(chǎn)量產(chǎn)生促進(jìn)作用，所以推測(cè)氨基酸引起的pH 變化并不是影響有效霉素A 產(chǎn)量的唯一因素。

表1 不同種類氨基酸對(duì)有效霉素產(chǎn)量的影響Table 1 Effect of different kinds of amino acids on Val-A production

2.2 氨基酸對(duì)菌體生長(zhǎng)和糖利用的影響

在抗生素發(fā)酵過(guò)程中加入前體氮源物質(zhì)提高發(fā)酵效價(jià)的報(bào)道中，代煥梅等［19］發(fā)現(xiàn)添加絲氨酸會(huì)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)并提高寧南霉素產(chǎn)量;胡景等［20］發(fā)現(xiàn)在添加氨基酸之后，阿維菌素的產(chǎn)量會(huì)隨著菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)而得到提高。在確定了氨基酸的最適添加濃度和其對(duì)產(chǎn)量影響作用后，我們對(duì)10 mmol/L 添加濃度下不同種類氨基酸對(duì)菌體生長(zhǎng)和糖利用的影響進(jìn)行考察，如表2 所示，盡管氨基酸會(huì)對(duì)有效霉素A 產(chǎn)量產(chǎn)生影響，但是與對(duì)照組相比，所有氨基酸添加組中鏈霉菌生物量積累并無(wú)顯著差異，且整個(gè)過(guò)程中糖利用也未呈現(xiàn)顯著變化。由此可見，氨基酸添加對(duì)有效霉素A 產(chǎn)量的提升作用，不是通過(guò)增加細(xì)胞量或提高糖利用率實(shí)現(xiàn)的，而是通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)碳源流向，促進(jìn)單位細(xì)胞中有效霉素A 的合成效率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)有效霉素A 產(chǎn)量的提升作用。

表2 不同種類氨基酸對(duì)蛋白積累和糖利用的影響Table 2 Effect of different kinds of amino acids on protein accumulation and sugar utilization

2.3 氨基酸對(duì)菌體碳代謝的影響

曾有報(bào)道指出［21］在酵母發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)過(guò)脫氨作用的氨基酸碳骨架可經(jīng)特定的分解代謝途徑直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，導(dǎo)致碳代謝流在3-磷酸甘油醛節(jié)點(diǎn)處發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響次級(jí)代謝。由圖2 所示，在吸水鏈霉菌5008 中，磷酸戊糖途徑(PPP)是合成有效霉素A 前體物質(zhì)7-磷酸景天庚酮糖的主要代謝途徑，作為限速酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)的活力直接影響磷酸戊糖途徑中有效霉素A 前體的積累量。此外，糖酵解途徑(EMP)作為胞內(nèi)主要供能途徑與PPP 途徑對(duì)碳源存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是催化EMP 途徑中關(guān)鍵反應(yīng)的限速酶，因此其活力不僅會(huì)直接影響菌體生長(zhǎng)也會(huì)間接影響有效霉素A 前體的合成。我們選定對(duì)有效霉A 素產(chǎn)量有明顯影響作用的異亮氨酸與甲硫氨酸發(fā)酵組，對(duì)其碳代謝途徑中關(guān)鍵酶活力進(jìn)行了檢測(cè)，以反映氨基酸對(duì)碳代謝的影響。

圖2 碳代謝與有效霉素A 合成的關(guān)系Fig. 2 Relationship between carbon metabolism and Val-A biosynthesis

由圖3a 所示，異亮氨酸組中，G6PD 活力在發(fā)酵初期就呈現(xiàn)出明顯的升高，在24 h，酶活力提高了41%，在48 h，酶活力也有24%的提高。而甲硫氨酸組卻在48 h 使G6PD 活力抑制了11%。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后，菌體生長(zhǎng)停滯，所有發(fā)酵組中G6PD 活力大幅度下降，與對(duì)照相比不再有差異。與G6PD 相比，作為主要供能途徑的限速酶，GAPDH 在整個(gè)生長(zhǎng)周期中都保持著較高的活性。由圖3b 所示，氨基酸添加對(duì)GAPDH 活力影響不大。在菌體生長(zhǎng)前期，GAPDH 活力并沒(méi)有展現(xiàn)出與對(duì)照組的區(qū)別。但是當(dāng)菌體生長(zhǎng)到48 h 向穩(wěn)定期過(guò)渡階段，異亮氨酸組中GAPDH 活力開始下降，到72 h，異亮氨酸組中GAPDH 活力受到明顯抑制，與對(duì)照組相比其活力降低了13%，到96 h，抑制解除，所有組中GADPH 活力一致。

結(jié)合2 種酶活力變化的結(jié)果分析，異亮氨酸在發(fā)酵初期就對(duì)PPP 途徑有明顯的促進(jìn)作用，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段并沒(méi)有抑制EMP 途徑，所以菌體生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體內(nèi)次級(jí)代謝逐漸增強(qiáng)，在這一階段異亮氨酸抑制了EMP 途徑的活力，使碳代謝從EMP 途徑流向PPP 途徑，促進(jìn)了有效霉素A前體的轉(zhuǎn)化，提高了有效霉素A 生物合成的效率。而甲硫氨酸在發(fā)酵初期便對(duì)PPP 途徑有明顯的抑制作用，但在整個(gè)發(fā)酵周期中對(duì)EMP 途徑的活力并沒(méi)有影響，其通過(guò)抑制有效霉素A 合成前體的積累，降低了有效霉素A 的產(chǎn)量。由此推測(cè)，氨基酸都是通過(guò)調(diào)節(jié)碳代謝途徑中關(guān)鍵酶活力，影響有效霉素A合成前體7-磷酸景天庚酮糖的積累量，從而造成對(duì)有效霉素A 生物合成的影響作用(包括異亮氨酸的促進(jìn)作用與甲硫氨酸的抑制作用)。

圖3 氨基酸對(duì)碳代謝途徑的影響Fig.3 Effect of amino acids on carbon metabolic pathway

3 結(jié)論

本研究將不同種類氨基酸添加到吸水鏈霉菌5008 發(fā)酵過(guò)程中并對(duì)其影響進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步探索了氮源種類和含量對(duì)有效霉素A 產(chǎn)量的影響作用，通過(guò)篩選氨基酸添加量，發(fā)現(xiàn)氨基酸添加的最適閾值濃度，根據(jù)氨基酸的酸堿性，將其影響進(jìn)行分類分析，在添加氨基酸的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，除去半胱氨酸與甲硫氨酸，其余各組都展現(xiàn)了對(duì)有效霉素A 產(chǎn)量顯著的促進(jìn)作用。雖然中性氨基酸會(huì)優(yōu)于酸性與堿性氨基酸，但是2 種含硫的中性氨基酸-半胱氨酸與甲硫氨酸并沒(méi)有提高有效霉素A 的產(chǎn)量，說(shuō)明氨基酸引起的pH變化并不是導(dǎo)致有效霉素A 產(chǎn)量提高的原因。隨后為了進(jìn)一步探索氨基酸的影響作用，對(duì)菌體生長(zhǎng)和糖利用情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)合對(duì)碳代謝關(guān)鍵酶活力的分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸是通過(guò)調(diào)節(jié)碳代謝途徑的活力，實(shí)現(xiàn)了碳源從糖酵解途徑到磷酸戊糖途徑代謝流向的變化，從而造成了有效霉素A 前體積累量的改變，影響有效霉素A 的生物合成。此外在有效霉素A 合成過(guò)程中，氮的來(lái)源尚不清楚，因而氨基酸還可能以氨基氮形式存在，直接參與到次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成反應(yīng)中，促進(jìn)有效霉素A 產(chǎn)量的提高。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2 種含硫氨基酸對(duì)有效霉素A 合成并無(wú)促進(jìn)作用，且甲硫氨酸還會(huì)顯著降低有效霉素A 的產(chǎn)量，這與氨基酸所攜帶基團(tuán)有著密切關(guān)聯(lián)，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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