張金龍，任軍，付玲，宋曉紅，陳儉勤，呂鵬，侯利華

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，以成年雄性小鼠頜下腺中含量最高，其次是豚鼠前列腺和蛇毒中。NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、修復(fù)和再生等均有很重要的作用[1-3]。NGF由α、β、γ亞基組成，具有生物學(xué)活性的為β亞基[4-6]。已有多家公司提取自小鼠頜下腺的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（mNGF）產(chǎn)品上市，對(duì)許多疾病如多發(fā)性硬化癥、老年性癡呆及各種外周神經(jīng)損傷等均具有潛在醫(yī)療價(jià)值[7-10]。分子排阻高效液相色譜法（SEC-HPLC）作為測(cè)定生物大分子純度的方法，與SDS-PAGE等方法相比，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。我們擬建立測(cè)定mNGF純度的SEC-HPLC法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)樣品mNGF（批號(hào)20120602）為本實(shí)驗(yàn)室制備；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。采用Waters公司的2695液相色譜系統(tǒng)、2487紫外檢測(cè)儀，用Empower 2工作站軟件采集并處理數(shù)據(jù)；色譜柱為TOSOH的TSK G3000 SWXL（7.8 mm×30 cm）。

1.2 方法

流動(dòng)相為0.25 mol/L磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸氫二鈉54.65 g、磷酸二氫鈉15.25 g、氯化鈉8.5 g溶解于1 L水中，pH6.8），流動(dòng)相流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。采集后用Em?power 2對(duì)各譜圖進(jìn)行積分，分析計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)。

對(duì)SEC-HPLC測(cè)定mNGF純度的方法的專屬性、線性、重復(fù)性、中間精密度、檢測(cè)限、耐用性等進(jìn)行驗(yàn)證，步驟如下。

1.2.1 專屬性 取不含mNGF的空白溶劑（20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，150 mmol/L NaCl），連續(xù)進(jìn)樣3次，然后取濃度為150 μg/mL的mNGF溶液，連續(xù)進(jìn)樣3次，觀察空白溶劑在積分時(shí)間內(nèi)是否存在吸收峰。判定標(biāo)準(zhǔn)：空白溶劑分析時(shí)在mNGF積分范圍內(nèi)無(wú)吸收峰出現(xiàn)。

1.2.2 線性 將mNGF分別稀釋至50、100、150、250、400 μg/mL，每個(gè)稀釋度溶液混勻后取3份樣品上樣，對(duì)目標(biāo)峰面積進(jìn)行線性評(píng)估。判定標(biāo)準(zhǔn)：相關(guān)系數(shù)大于0.98。

1.2.3 重復(fù)性 將mNGF稀釋至100 μg/mL，連續(xù)進(jìn)樣6次。判定標(biāo)準(zhǔn)：峰面積RSD≤2.0%。

1.2.4 中間精密度 由分析員1對(duì)樣品重復(fù)進(jìn)樣5次，3 d后由分析員2對(duì)相同樣品再重復(fù)進(jìn)樣5次。判定標(biāo)準(zhǔn)：峰面積RSD≤2.0%。

1.2.5 檢測(cè)限 將mNGF樣品分別稀釋至100、10、1 μg/mL后分別進(jìn)樣3次，計(jì)算峰面積及信噪比。判定標(biāo)準(zhǔn)：以峰面積的RSD低于20%且信噪比不低于10∶1的最低濃度作為定量限。

1.2.6 耐用性 分別以濃度為0.05、0.10、0.20、0.25、0.30 mol/L的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相，分別進(jìn)樣2次，觀察保留時(shí)間及峰面積的變化。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

見(jiàn)圖1，空白溶劑與mNGF溶液均在15.5～17 min出現(xiàn)典型的鹽峰，經(jīng)分析，是由于樣品中磷酸鹽含量與流動(dòng)相不一致所致。mNGF主峰保留時(shí)間約為13.5 min，峰開(kāi)始時(shí)間約為12.8 min，結(jié)束時(shí)間約為14.2 min，考慮到有可能有聚集體存在，確定積分范圍為0～15 min。結(jié)果表明，在此范圍內(nèi)空白溶劑無(wú)峰出現(xiàn)。專屬性符合要求。

2.2 線性

對(duì)圖2各峰積分（見(jiàn)表1），而后以樣品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積平均值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 y=17521x-435768，相關(guān)系數(shù) R2=0.9998（圖 3）。結(jié)果表明，mNGF溶液濃度與吸收峰面積之間為線性回歸，相關(guān)系數(shù)＞0.999，符合預(yù)定驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，表明在50～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)呈線性相關(guān)。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)比較圖

2.3 重復(fù)性 見(jiàn)圖4，6次進(jìn)樣譜圖基本一致。分析結(jié)果見(jiàn)表2，6次進(jìn)樣峰面積RSD為1.18%，小于2.0%。本方法重復(fù)性符合要求。

2.4 中間精密度 見(jiàn)圖5，2名分析員分別于3 d內(nèi)進(jìn)樣5次所得到的譜圖基本一致，分析結(jié)果見(jiàn)表3，mNGF的RSD小于2.0%，本方法中間精密度符合要求。

表1 線性實(shí)驗(yàn)峰面積（μV·s）

圖2 線性實(shí)驗(yàn)各濃度色譜峰比較圖

圖3 線性關(guān)系圖

圖4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)色譜比較圖

2.5 檢測(cè)限 見(jiàn)圖6，1 μg/mL樣品在主峰保留時(shí)間范圍內(nèi)無(wú)明顯洗脫峰出現(xiàn)。積分并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明（表4），10 μg/mL樣品3次進(jìn)樣峰面積RSD為12.441%，小于20%，且信噪比大于10∶1，符合標(biāo)準(zhǔn)，故將濃度為10 μg/mL、進(jìn)樣量20 μL即0.2 μg定為檢測(cè)限。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間、峰面積、純度

表3 中間精密度實(shí)驗(yàn)峰面積（μV·s）

圖5 中間精密度實(shí)驗(yàn)色譜比較圖

2.6 耐用性 見(jiàn)圖7，當(dāng)磷酸鹽濃度過(guò)低時(shí)，由于蛋白質(zhì)與填料的非特異性吸附等原因，譜帶展寬，回收率降低；但磷酸鹽濃度在較小范圍（0.2～0.3 mol/L）內(nèi)波動(dòng)時(shí)，保留時(shí)間RSD為0.07%，峰面積RSD為1.67%（結(jié)果未在表5中列出），即磷酸鹽濃度小范圍波動(dòng)對(duì)mNGF的純度檢測(cè)影響很小。本方法耐用性符合要求。

3 討論

圖6 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)各濃度比較圖

圖7 耐用性各條件比較圖

表4 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間、峰面積及信噪比

表5 耐用性實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間及峰面積

我們采用的TSK G3000 SWXL分析柱，填料由剛性極好的孔徑分布均勻的球形硅膠化學(xué)鍵合親水化合物構(gòu)成，顆粒大小為5 μm，專用于HPLC系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)與多肽，分離效率只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。以上驗(yàn)證結(jié)果表明，本方法分離效率高，選擇性好，檢測(cè)靈敏度高，操作自動(dòng)化程度高，適用于mNGF純度的檢測(cè)，有著極好的應(yīng)用前景。

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