孫衛(wèi)國(guó),李邦印,劉艷華,張靈霞,熊志紅,程小星
解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所,北京 100091
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tu?berculosis,MTB)引起的慢性傳染病,目前死亡率仍然比較高。人群中絕大多數(shù)MTB感染為潛伏感染,MTB處于休眠狀態(tài),在機(jī)體免疫力低下或伴隨其他感染時(shí),休眠的MTB受激活引發(fā)結(jié)核病。結(jié)核病人的繼發(fā)感染成為結(jié)核病傳播和再發(fā)的重大隱患[1]。快速靈敏的診斷技術(shù)和規(guī)范有效的治療是控制結(jié)核病的關(guān)鍵[2]。結(jié)核病的臨床診斷有諸多方法,而基于特異性抗原的結(jié)核病血清學(xué)診斷快速具有特異性高、敏感性強(qiáng)、重復(fù)穩(wěn)定性好的特點(diǎn),操作簡(jiǎn)便,可以肉眼判斷結(jié)果,有望成為結(jié)核病臨床診斷的首選方法。尋找一種高敏感性和高特異性的結(jié)核抗原成分,是利用血清學(xué)進(jìn)行早期快速準(zhǔn)確診斷的前提。結(jié)核分枝桿菌PPE蛋白家族是一類(lèi)富含甘氨酸且為結(jié)核分枝桿菌特有的蛋白[3],這類(lèi)蛋白含有共同的Pro-Pro-Glu結(jié)構(gòu)域,蛋白間沒(méi)有共同的作用位點(diǎn),相互間沒(méi)有交叉反應(yīng)[4]。Rv3425是PPE家族第3亞族的一個(gè)成員,由176個(gè)氨基酸殘基組成,為免疫顯性的B細(xì)胞目標(biāo)抗原,為RD11區(qū)蛋白。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明,Rv3425的19~176位殘基覆蓋了Rv3425全部的抗原指數(shù)較強(qiáng)的B細(xì)胞抗原決定簇[5]。
我們以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板,常規(guī)PCR擴(kuò)增Rv3425基因,獲得原核表達(dá)的重組Rv3425蛋白,探討了其免疫學(xué)活性及在檢測(cè)血清中抗結(jié)核抗體方面的應(yīng)用價(jià)值,為研制更有效的結(jié)核病免疫診斷試劑及新型治療藥物奠定了基礎(chǔ)。
臨床診斷病人血清和健康人血清均由本所臨床檢驗(yàn)室提供;大腸桿菌BL21(DE3)、結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA、質(zhì)粒pET-28a均系本室保存;內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶和dNTP均購(gòu)自TaKaRa公司;PCR引物由上海生工生物工程公司合成;酶標(biāo)羊抗人IgG(HRP)購(gòu)自中山生物工程技術(shù)公司;親和色譜填料購(gòu)自Bio-rad公司;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
根據(jù)GenBank中的結(jié)核桿菌H37Rv株Rv3425基因序列(Gene ID:887635)設(shè)計(jì)合成特異性引物,在反向引物中將原有終止密碼子改為大腸桿菌偏性的TAA。上下游引物分別為P1(5'-GGAATTC?CATATGCATCCAATGATACCAGCGGAG-3')和 P2(5'-CCGCTCGAGTTACCCGCCCCTGTAGATC-3'),下劃線(xiàn)序列分別為NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。
以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板,用引物P1、P2通過(guò)PCR擴(kuò)增Rv3425核酸序列并回收PCR產(chǎn)物。用NdeⅠ和XhoⅠ酶切PCR產(chǎn)物,然后在T4DNA連接酶的作用下,把回收片段克隆到經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。
將測(cè)序正確的工程菌接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37℃振搖培養(yǎng)至菌液D600nm達(dá)0.4時(shí),立即加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L,37℃繼續(xù)誘導(dǎo)7 h,離心收集菌體,按1∶10的比例將菌體溶于1×PBS緩沖液中,充分混勻,低溫條件下超聲波破碎,離心后收集上清和沉淀,進(jìn)行14%的SDS-PAGE,分析目的蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式。
Rv3425蛋白以包涵體的形式存在,將包涵體先后用1%的Triton X-100和3 mol/L鹽酸胍交替洗滌,洗滌后的包涵體用含6 mol/L鹽酸胍、10 mmol/L β-巰基乙醇的TE緩沖液變性溶解,高速離心取上清,上清液以1∶50的比例和5 mL/h的速度滴加到復(fù) 性 液(25 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L EDTA,0.1 mmol/L GSSG,0.2 mmol/L GSH,pH8.0)中,4℃放置過(guò)夜,高速離心除去沉淀,在4℃條件下取上清過(guò)鎳離子親和柱,分別以50、150 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白,收集穿過(guò)峰和洗脫峰蛋白,進(jìn)行14%的 SDS-PAGE,分析純化的目的蛋白的純度,對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行水透析后凍干保存。
取純化的Rv3425蛋白,經(jīng)SDS-PAGE后采用半干法轉(zhuǎn)到PVDF膜上,依次經(jīng)5%脫脂奶粉封閉、3例臨床確診的結(jié)核病病人血清、HRP標(biāo)記的羊抗人IgG孵育后,漂洗干凈,加入化學(xué)發(fā)光試劑,在ECL暗室中自動(dòng)曝光顯影,初步分析Rv3425蛋白的抗原特異性。
用碳酸鹽緩沖液將Rv3425蛋白稀釋至1 μg/mL,酶標(biāo)板每孔包被100 μL,室溫2 h,洗板5次后用30%的BSA于37℃封閉2 h,洗板5次,瞬時(shí)倒扣濾紙吸干;待測(cè)血清用PBS緩沖液稀釋至1/200,取100 μL加入反應(yīng)孔,37℃溫箱放置1 h,洗板5次;每孔加入用PBS稀釋至1/1000的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 100 μL,于37℃溫箱放置1 h,洗板5次,加入TMB顯色液,于37℃溫箱中反應(yīng)30 min顯色,酶標(biāo)儀檢測(cè)D450nm值,大于1.0為陽(yáng)性。
以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板,通過(guò)常規(guī)PCR方法擴(kuò)增得到成熟Rv3425核酸序列。經(jīng)1%瓊脂糖電泳,在約530 bp處獲得單一的電泳條帶(圖1)。將PCR片段經(jīng)酶切后克隆至表達(dá)載體pET-28a中,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL(DE3),篩選測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全一致的克隆。
取測(cè)序正確的克隆菌落接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)至菌液D600nm為0.4時(shí)加入IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)7 h,菌體經(jīng)超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE,在相對(duì)分子質(zhì)量20×103處有表達(dá)條帶,與Rv3425分子大小一致,表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的20%~25%,基本以包涵體形式存在于超聲波破碎后的細(xì)菌沉淀中(圖2)。
圖1 凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增的Rv3425基因
將包涵體初步提純后,用6 mol/L鹽酸胍和10 mmol/L β-巰基乙醇變性,在配制的復(fù)性液中進(jìn)行滴加復(fù)性,低溫過(guò)夜放置后高速離心除去沉淀。在4℃條件下取上清,用鎳離子親和柱純化,分別以50、150 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白和目的蛋白,收集穿過(guò)峰和洗脫峰蛋白進(jìn)行14%的SDS-PAGE,分析純化的目的蛋白的純度,結(jié)果如圖3,純化后Rv3425蛋白的純度達(dá)90%以上,用水透析后凍干保存。
取純化后的Rv3425蛋白,用PBS緩沖液配制成1 mg/mL的儲(chǔ)存液,行14%的SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,封閉后,分別與3例強(qiáng)陽(yáng)性人血清和6例健康人血清孵育,與HRP標(biāo)記的羊抗人二抗結(jié)合反應(yīng),ECL暗室中自動(dòng)曝光顯影,結(jié)果見(jiàn)圖4。Rv3425蛋白能與3例陽(yáng)性血清結(jié)合,而與6例健康人血清的反應(yīng)不明顯。Western印跡結(jié)果證實(shí)Rv3425具有較強(qiáng)的抗原性。
圖2 pET-28a-Rv3425原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
圖3 SDS-PAGE分析親和純化的Rv3425蛋白
圖4 Western印跡分析重組蛋白R(shí)v3425的抗原性
實(shí)驗(yàn)表明最佳重組抗原包被濃度為1 μg/mL,血清稀釋度為1∶200。以復(fù)性純化后的Rv3425蛋白抗原分別對(duì)60份陽(yáng)性血清和40份陰性血清進(jìn)行檢測(cè),其中陽(yáng)性血清檢出30例,檢出率為50%;健康人血清檢出2例,檢出率為5%,特異度為95%。結(jié)核病人組的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組健康人。ELISA結(jié)果說(shuō)明,重組蛋白R(shí)v3425可作為待選抗原,用于結(jié)核病人的血清學(xué)診斷。
目前臨床采用的結(jié)核桿菌細(xì)菌學(xué)診斷方法檢出率低、培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng),很難滿(mǎn)足檢測(cè)需要。血清學(xué)檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn),一直是臨床結(jié)核分枝桿菌診斷研究的重點(diǎn),但至今未找到理想的靶抗原[6]。Rv3425是由結(jié)核桿菌RD11區(qū)編碼的PPE蛋白家族成員,僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中,作為診斷抗原在結(jié)核病臨床診斷方面有廣闊的應(yīng)用前景[7]。在本研究中,我們用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組Rv3425蛋白具有較強(qiáng)的抗原性,對(duì)60例陽(yáng)性患者血清的總體檢出率達(dá)到50%。使用單一抗原時(shí)陽(yáng)性檢出率往往都比較低,目前還沒(méi)有一種結(jié)核抗原能夠全部檢測(cè)出陽(yáng)性血清。研究發(fā)現(xiàn),采用CFP10-ES?AT6-Rv3425融合抗原可以提高結(jié)核桿菌檢出率,同時(shí)將多個(gè)單獨(dú)監(jiān)測(cè)抗原聯(lián)合用于結(jié)核病的血清診斷可獲得較高的陽(yáng)性檢出率[8]。綜上,我們得到了高純度重組Rv3425蛋白,為今后開(kāi)發(fā)能區(qū)別結(jié)核感染狀態(tài)的血清學(xué)鑒別診斷試劑,及針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染者的治療性疫苗的候選抗原打下了基礎(chǔ)。
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