孫衛(wèi)國(guó)，李邦印，劉艷華，張靈霞，熊志紅，程小星

解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所，北京 100091

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tu?berculosis，MTB）引起的慢性傳染病，目前死亡率仍然比較高。人群中絕大多數(shù)MTB感染為潛伏感染，MTB處于休眠狀態(tài)，在機(jī)體免疫力低下或伴隨其他感染時(shí)，休眠的MTB受激活引發(fā)結(jié)核病。結(jié)核病人的繼發(fā)感染成為結(jié)核病傳播和再發(fā)的重大隱患[1]。快速靈敏的診斷技術(shù)和規(guī)范有效的治療是控制結(jié)核病的關(guān)鍵[2]。結(jié)核病的臨床診斷有諸多方法，而基于特異性抗原的結(jié)核病血清學(xué)診斷快速具有特異性高、敏感性強(qiáng)、重復(fù)穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，可以肉眼判斷結(jié)果，有望成為結(jié)核病臨床診斷的首選方法。尋找一種高敏感性和高特異性的結(jié)核抗原成分，是利用血清學(xué)進(jìn)行早期快速準(zhǔn)確診斷的前提。結(jié)核分枝桿菌PPE蛋白家族是一類(lèi)富含甘氨酸且為結(jié)核分枝桿菌特有的蛋白[3]，這類(lèi)蛋白含有共同的Pro-Pro-Glu結(jié)構(gòu)域，蛋白間沒(méi)有共同的作用位點(diǎn)，相互間沒(méi)有交叉反應(yīng)[4]。Rv3425是PPE家族第3亞族的一個(gè)成員，由176個(gè)氨基酸殘基組成，為免疫顯性的B細(xì)胞目標(biāo)抗原，為RD11區(qū)蛋白。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，Rv3425的19～176位殘基覆蓋了Rv3425全部的抗原指數(shù)較強(qiáng)的B細(xì)胞抗原決定簇[5]。

我們以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增Rv3425基因，獲得原核表達(dá)的重組Rv3425蛋白，探討了其免疫學(xué)活性及在檢測(cè)血清中抗結(jié)核抗體方面的應(yīng)用價(jià)值，為研制更有效的結(jié)核病免疫診斷試劑及新型治療藥物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

臨床診斷病人血清和健康人血清均由本所臨床檢驗(yàn)室提供；大腸桿菌BL21（DE3）、結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA、質(zhì)粒pET-28a均系本室保存；內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶和dNTP均購(gòu)自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；酶標(biāo)羊抗人IgG（HRP）購(gòu)自中山生物工程技術(shù)公司；親和色譜填料購(gòu)自Bio-rad公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中的結(jié)核桿菌H37Rv株Rv3425基因序列（Gene ID：887635）設(shè)計(jì)合成特異性引物，在反向引物中將原有終止密碼子改為大腸桿菌偏性的TAA。上下游引物分別為P1（5'-GGAATTC?CATATGCATCCAATGATACCAGCGGAG-3'）和 P2（5'-CCGCTCGAGTTACCCGCCCCTGTAGATC-3'），下劃線(xiàn)序列分別為NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.3 pET-28a-Rv3425重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，用引物P1、P2通過(guò)PCR擴(kuò)增Rv3425核酸序列并回收PCR產(chǎn)物。用NdeⅠ和XhoⅠ酶切PCR產(chǎn)物，然后在T4DNA連接酶的作用下，把回收片段克隆到經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3），篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.4 結(jié)核桿菌Rv3425蛋白的原核表達(dá)

將測(cè)序正確的工程菌接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)至菌液D600nm達(dá)0.4時(shí)，立即加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)7 h，離心收集菌體，按1∶10的比例將菌體溶于1×PBS緩沖液中，充分混勻，低溫條件下超聲波破碎，離心后收集上清和沉淀，進(jìn)行14%的SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式。

1.5 結(jié)核桿菌Rv3425蛋白的復(fù)性與純化

Rv3425蛋白以包涵體的形式存在，將包涵體先后用1%的Triton X-100和3 mol/L鹽酸胍交替洗滌，洗滌后的包涵體用含6 mol/L鹽酸胍、10 mmol/L β-巰基乙醇的TE緩沖液變性溶解，高速離心取上清，上清液以1∶50的比例和5 mL/h的速度滴加到復(fù) 性 液（25 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L GSSG，0.2 mmol/L GSH，pH8.0）中，4℃放置過(guò)夜，高速離心除去沉淀，在4℃條件下取上清過(guò)鎳離子親和柱，分別以50、150 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，收集穿過(guò)峰和洗脫峰蛋白，進(jìn)行14%的 SDS-PAGE，分析純化的目的蛋白的純度，對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行水透析后凍干保存。

1.6 結(jié)核桿菌Rv3425蛋白的免疫印跡分析

取純化的Rv3425蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后采用半干法轉(zhuǎn)到PVDF膜上，依次經(jīng)5%脫脂奶粉封閉、3例臨床確診的結(jié)核病病人血清、HRP標(biāo)記的羊抗人IgG孵育后，漂洗干凈，加入化學(xué)發(fā)光試劑，在ECL暗室中自動(dòng)曝光顯影，初步分析Rv3425蛋白的抗原特異性。

1.7 結(jié)核桿菌Rv3425蛋白的人血清ELISA分析

用碳酸鹽緩沖液將Rv3425蛋白稀釋至1 μg/mL，酶標(biāo)板每孔包被100 μL，室溫2 h，洗板5次后用30%的BSA于37℃封閉2 h，洗板5次，瞬時(shí)倒扣濾紙吸干；待測(cè)血清用PBS緩沖液稀釋至1/200，取100 μL加入反應(yīng)孔，37℃溫箱放置1 h，洗板5次；每孔加入用PBS稀釋至1/1000的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 100 μL，于37℃溫箱放置1 h，洗板5次，加入TMB顯色液，于37℃溫箱中反應(yīng)30 min顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)D450nm值，大于1.0為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體pET-28a-Rv3425的構(gòu)建

以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，通過(guò)常規(guī)PCR方法擴(kuò)增得到成熟Rv3425核酸序列。經(jīng)1%瓊脂糖電泳，在約530 bp處獲得單一的電泳條帶（圖1）。將PCR片段經(jīng)酶切后克隆至表達(dá)載體pET-28a中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL（DE3），篩選測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全一致的克隆。

2.2 結(jié)核桿菌Rv3425蛋白的原核表達(dá)

取測(cè)序正確的克隆菌落接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至菌液D600nm為0.4時(shí)加入IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)7 h，菌體經(jīng)超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE，在相對(duì)分子質(zhì)量20×103處有表達(dá)條帶，與Rv3425分子大小一致，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的20%～25%，基本以包涵體形式存在于超聲波破碎后的細(xì)菌沉淀中（圖2）。

2.3 結(jié)核桿菌Rv3425蛋白的純化

圖1 凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增的Rv3425基因

將包涵體初步提純后，用6 mol/L鹽酸胍和10 mmol/L β-巰基乙醇變性，在配制的復(fù)性液中進(jìn)行滴加復(fù)性，低溫過(guò)夜放置后高速離心除去沉淀。在4℃條件下取上清，用鎳離子親和柱純化，分別以50、150 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集穿過(guò)峰和洗脫峰蛋白進(jìn)行14%的SDS-PAGE，分析純化的目的蛋白的純度，結(jié)果如圖3，純化后Rv3425蛋白的純度達(dá)90%以上，用水透析后凍干保存。

2.4 Western印跡鑒定Rv3425蛋白的抗原性

取純化后的Rv3425蛋白，用PBS緩沖液配制成1 mg/mL的儲(chǔ)存液，行14%的SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉后，分別與3例強(qiáng)陽(yáng)性人血清和6例健康人血清孵育，與HRP標(biāo)記的羊抗人二抗結(jié)合反應(yīng)，ECL暗室中自動(dòng)曝光顯影，結(jié)果見(jiàn)圖4。Rv3425蛋白能與3例陽(yáng)性血清結(jié)合，而與6例健康人血清的反應(yīng)不明顯。Western印跡結(jié)果證實(shí)Rv3425具有較強(qiáng)的抗原性。

圖2 pET-28a-Rv3425原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖3 SDS-PAGE分析親和純化的Rv3425蛋白

圖4 Western印跡分析重組蛋白R(shí)v3425的抗原性

2.5 ELISA分析

實(shí)驗(yàn)表明最佳重組抗原包被濃度為1 μg/mL，血清稀釋度為1∶200。以復(fù)性純化后的Rv3425蛋白抗原分別對(duì)60份陽(yáng)性血清和40份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，其中陽(yáng)性血清檢出30例，檢出率為50%；健康人血清檢出2例，檢出率為5%，特異度為95%。結(jié)核病人組的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組健康人。ELISA結(jié)果說(shuō)明，重組蛋白R(shí)v3425可作為待選抗原，用于結(jié)核病人的血清學(xué)診斷。

3 討論

目前臨床采用的結(jié)核桿菌細(xì)菌學(xué)診斷方法檢出率低、培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，很難滿(mǎn)足檢測(cè)需要。血清學(xué)檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，一直是臨床結(jié)核分枝桿菌診斷研究的重點(diǎn)，但至今未找到理想的靶抗原[6]。Rv3425是由結(jié)核桿菌RD11區(qū)編碼的PPE蛋白家族成員，僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中，作為診斷抗原在結(jié)核病臨床診斷方面有廣闊的應(yīng)用前景[7]。在本研究中，我們用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組Rv3425蛋白具有較強(qiáng)的抗原性，對(duì)60例陽(yáng)性患者血清的總體檢出率達(dá)到50%。使用單一抗原時(shí)陽(yáng)性檢出率往往都比較低，目前還沒(méi)有一種結(jié)核抗原能夠全部檢測(cè)出陽(yáng)性血清。研究發(fā)現(xiàn)，采用CFP10-ES?AT6-Rv3425融合抗原可以提高結(jié)核桿菌檢出率，同時(shí)將多個(gè)單獨(dú)監(jiān)測(cè)抗原聯(lián)合用于結(jié)核病的血清診斷可獲得較高的陽(yáng)性檢出率[8]。綜上，我們得到了高純度重組Rv3425蛋白，為今后開(kāi)發(fā)能區(qū)別結(jié)核感染狀態(tài)的血清學(xué)鑒別診斷試劑，及針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染者的治療性疫苗的候選抗原打下了基礎(chǔ)。

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