彭帆，童貽剛，柏長青

1.中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410013；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.附屬醫(yī)院呼吸危重癥科；北京 100071

鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌，多感染老年患者、危重患者、腫瘤放化療等抵抗力低下的患者，尤其是重癥監(jiān)護(hù)室的患者。隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素的運(yùn)用，多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院的主要病原體[1]。噬菌體是針對(duì)耐藥菌治療與消毒的一種有效手段[2]。我們通過生物學(xué)方法，對(duì)多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體進(jìn)行了分離，并對(duì)分離的噬菌體的形態(tài)、一步生長曲線、裂解特性和不同保存條件對(duì)其活性的影響進(jìn)行了初步研究,為噬菌體制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鮑曼不動(dòng)桿菌AB6分離自解放軍307醫(yī)院患者血液，用VITEK-2全自動(dòng)微生物檢測(cè)儀進(jìn)行菌種及藥敏測(cè)定。

1.2 噬菌體分離與純化

從解放軍307醫(yī)院取消毒前污水離心，除去固體雜質(zhì)，收集上清，再經(jīng)濾器過濾上清；取4 mL濾液加到2 mL 3×LB中，加入100 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的鮑曼不動(dòng)桿菌富集；過夜培養(yǎng)后離心收集上清，經(jīng)濾器過濾后的濾液即為噬菌體原液[3]；以LB固體培養(yǎng)基做下層平板，將上述濾液梯度稀釋，分別取100與500 μL指示菌加入上層半固體LB培養(yǎng)基中，凝固后于37℃培養(yǎng)6 h，觀察噬菌斑，計(jì)算滴度；挑單個(gè)噬菌斑挑入對(duì)數(shù)期菌液中過夜富集，離心過濾后與指示菌鋪板，連續(xù)幾次便得到純化的噬菌體[4]。

1.3 噬菌體濃縮

將單個(gè)噬菌斑挑入5 mL對(duì)數(shù)期菌液中6 h，之后將其接種于500 mL對(duì)數(shù)期菌液中，37℃過夜培養(yǎng)；在含噬菌體的裂解培養(yǎng)物中加入0.1%體積的氯仿，室溫靜置30 min；向培養(yǎng)物中加入NaCl（終濃度為1 mol/L），攪拌使其溶解；將培養(yǎng)物冰浴1 h，4℃、11 000×g離心10 min去除細(xì)胞碎片；將培養(yǎng)物的上清加固體聚乙二醇（PEG）至終濃度為100 g/L，室溫下用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解PEG[5]；將溶液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中，冰水浴冷卻，至少放置1 h，以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀；4℃、11 000×g離心10 min回收沉淀的噬菌體，去上清，將噬菌體沉淀輕輕重懸于SM中；加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的PEG和細(xì)胞碎片，溫和振蕩30 s；11 000×g離心10 min分離有機(jī)相和親水相，回收含噬菌體顆粒的親水相，經(jīng)0.22 μm濾器過濾，4℃保存。

1.4 透射電鏡形態(tài)觀察

取25 μL噬菌體液滴在銅網(wǎng)上，待其沉淀15 min，用濾紙吸去多余液體，用2%的磷鎢酸染色30 min，干燥后用Philip TECNAI-10透射電鏡進(jìn)行形態(tài)觀察[6]。

1.5 一步生長曲線

在1.5 mL EP管中加入感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1的噬菌體及其宿主菌（D600nm=0.6），混勻，37℃溫育15 min，11 000 ×g離心 30 s，吸去上清，再用預(yù)熱的LB培養(yǎng)液洗滌2次（11 000 ×g離心30 s），棄上清，用預(yù)熱的LB液混懸沉淀并充分混勻，加入含5 mL預(yù)熱的LB液體的試管中，迅速于37℃搖床上振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別在0、10、20、30、40、50、60、90、120 min取出 0.2 mL，13 000 r/min離心 2 min，吸取100 μL上清，用預(yù)熱的LB液倍比稀釋后，用雙層瓊脂法測(cè)定噬菌體滴度[7]。

1.6 溫度敏感性測(cè)定

將噬菌體原液分別置于50、60、70和80℃的恒溫水浴中[8]，經(jīng)梯度稀釋后，采用雙層瓊脂法分別測(cè)定水浴1 h的噬菌體存活數(shù)目。

1.7 噬菌體裂解特性分析

將鮑曼不動(dòng)桿菌于5 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測(cè)定其起始D600nm值，加入200 μL噬菌體（濃度為1010PFU/mL）IME-AB6，于37℃振蕩培養(yǎng)，同時(shí)以不加噬菌體作為對(duì)照組，分別于 0、1、2、3、4 h 檢測(cè)D600nm值的變化[9]。

1.8 保存方法

將效價(jià)為1013PFU/mL的噬菌體IME-AB6在LB液體培養(yǎng)基中分別存放于4、-20和-70℃[10]，分別于0、1、2、3、4、6個(gè)月時(shí)經(jīng)梯度稀釋后測(cè)定其滴度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌藥敏結(jié)果

細(xì)菌藥敏結(jié)果見表1，此株鮑曼不動(dòng)桿菌耐多種藥物，表1頁給出了其最小抑菌濃度（MIC）。

2.2 噬菌斑的觀察與滴度測(cè)定

以多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌AB6為宿主菌分離出一株噬菌體，命名為IME-AB6。經(jīng)3～5次純化后，用雙層瓊脂平板培養(yǎng)的噬菌斑呈圓形，大小均一，邊緣光滑，透明，直徑約3 mm（圖1），具有強(qiáng)裂解性噬菌體的噬菌斑特征。統(tǒng)計(jì)噬菌斑數(shù)，計(jì)算得本試驗(yàn)中分離純化的噬菌體效價(jià)為1×1010pfu/mL，經(jīng)PEG濃縮后的滴度達(dá)1×1013pfu/mL，提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.3 噬菌體的形態(tài)觀察

純化的噬菌體IME-AB6顆粒經(jīng)負(fù)染色后于透射電鏡下觀察其顆粒形態(tài)（圖2）。該噬菌體呈現(xiàn)典型的二十面體頭部和尾部結(jié)構(gòu)，頭部寬約40 nm，長約100 nm，尾部長60 nm，其下附有數(shù)根尾絲，因此該噬菌體屬于肌尾噬菌體科。

表1 多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌AB6的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 一步生長曲線

圖3顯示噬菌體感染細(xì)菌的潛伏期約10 min，爆發(fā)時(shí)間約40 min。感染宿主菌在D600nm為0.6時(shí)，細(xì)菌計(jì)數(shù)為5×107/mL，裂解量=爆發(fā)末期噬菌體滴度/感染宿主菌濃度=8×109/5×107=160，即噬菌體的爆發(fā)量為160 pfu/細(xì)胞。不同噬菌體的潛伏期、爆發(fā)期及爆發(fā)量的差異很大。對(duì)于那些在臨床上有應(yīng)用前景的噬菌體而言，潛伏期短、爆發(fā)量大是特別被看好的。

2.5 溫度敏感性測(cè)定

IME-AB6對(duì)熱較敏感，50℃保存1 h其存活率約為80%，60℃時(shí)存活率明顯下降，70℃時(shí)完全失活（圖4）。40～50℃下噬菌體能保持較高滴度，表示其在相對(duì)高溫下有一定的穩(wěn)定性。

圖1 以多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為指示菌分離出的噬菌體IME-AB6

圖2 噬菌體IME-AB6電鏡圖

圖3 噬菌體IME-AB6在宿主菌中的一步生長曲線

2.6 噬菌體裂解特性分析

如圖5所示，在不同起始D600nm值的菌液中加入噬菌體2 h后，其D600nm值下降明顯，肉眼可觀察到較對(duì)照組明顯澄清，作用 4 h后培養(yǎng)液透亮且澄清，而陰性對(duì)照組D600nm值仍在上升且培養(yǎng)液較為混濁。由此可見，噬菌體IME-AB6能有效裂解宿主菌，裂解效能強(qiáng)，裂解時(shí)間快。

2.7 保存方法

圖4 噬菌體IME-AB6在不同溫度下1 h后的滴度變化

圖5 不同濃度菌液中加入噬菌體后的D600nm值變化

表2 不同保存溫度對(duì)噬菌體效價(jià)的影響（PFU/mL）

從表2可見，4℃是最好的保存溫度，4℃保存與-70℃保存的噬菌體之間無明顯差別，6個(gè)月之內(nèi)噬菌體的效價(jià)降低不明顯。-20℃保存時(shí)，噬菌體的裂菌活性在半年內(nèi)降低了多個(gè)指數(shù)級(jí)。綜合來看，在LB培養(yǎng)基中于4℃保存噬菌體不需要特殊儀器，條件簡(jiǎn)單，操作方便，是最值得采用的保存方法。

3 討論

治療耐藥性細(xì)菌已成為臨床醫(yī)生的難題，新的抗菌藥物亟待開發(fā)[11]。但一種新抗生素的生產(chǎn)需要大量物力、人力和長時(shí)間的投入，而噬菌體治療能克服這些缺點(diǎn)。我們選取的鮑曼不動(dòng)桿菌AB6對(duì)耐大多數(shù)藥物，以它為指示菌分離的噬菌體IME-AB6的裂解性強(qiáng)。雖然已有很多關(guān)于利用噬菌體治療人類疾病的報(bào)道[12-13]，但宿主譜狹窄一直是治療中存在的問題。有很多雞尾酒療法的報(bào)道[14-15]，即將不同的噬菌體混合以提高宿主譜。另一種發(fā)展趨勢(shì)是個(gè)體化治療，即針對(duì)抗生素?zé)o效或治療不明顯的某個(gè)病人的某種耐藥菌分離噬菌體用于治療，這樣宿主譜狹窄就不再是影響治療的問題。

基于噬菌體在抗菌方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，我們開展了針對(duì)多耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體生物學(xué)特征的初步研究，從污水中分離出一株IME-AB6噬菌體，屬于肌尾噬菌體。一步生長曲線是研究噬菌體裂解細(xì)菌效能的重要指標(biāo)，包括潛伏期、爆發(fā)期、平臺(tái)期，也可以據(jù)其算出爆發(fā)量。隨著宿主菌的不斷裂解和新的子代噬菌體的釋放，當(dāng)宿主菌接近全部被裂解時(shí)，噬菌體的數(shù)量達(dá)到最大值。本株噬菌體潛伏期為10 min，顯示的爆發(fā)時(shí)間是40 min。潛伏期和爆發(fā)期的時(shí)間短，可反映噬菌體裂解的高效能。噬菌體具有天然殺菌特性，而本實(shí)驗(yàn)所分離的IME-AB6噬菌體能使菌液D600nm值迅速下降，在4 h內(nèi)能使菌液變清晰，也證實(shí)了其殺菌的高效能，為今后開發(fā)噬菌體制劑提供了基礎(chǔ)。在50℃以下能很好地保持噬菌體的高滴度，在LB培養(yǎng)基中于4℃保存也很方便，說明該噬菌體穩(wěn)定并易于保存，這是其作為制劑的一大優(yōu)勢(shì)。

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