黃海 ，張秀娟 ，謝佩雯 ，王學(xué)軍 ，王升啟

1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。目前，治療乙肝病毒的藥物主要有2大類(lèi)，即干擾素和核苷類(lèi)似物，但這2類(lèi)藥物仍然存在不同程度的副作用且均不能徹底清除HBV，尤其對(duì)HBV表面抗原（hepatitis B surface protein，HBsAg）的清除作用微弱，而HBsAg的表達(dá)是造成HBV免疫耐受的關(guān)鍵因素之一[1]。因此，尋找能抑制HBsAg的藥物將是未來(lái)抗HBV治療的重中之重。

尋找病毒和宿主之間的相互作用關(guān)系并發(fā)現(xiàn)有效的抗病毒藥物靶點(diǎn)，是當(dāng)前病毒學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，治療方法從傳統(tǒng)的靶向病毒向靶向宿主基因發(fā)展已成為一種新趨勢(shì)，并且在許多抗病毒治療探索中均取得了重要進(jìn)展[2-5]。HBV感染是引起人類(lèi)肝細(xì)胞癌的重要潛在致病因子。HBV基因組中具有轉(zhuǎn)錄激活活性的HBx蛋白，可引發(fā)c-Raf-1/MEK激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]，促進(jìn)HBV的表達(dá)，致使細(xì)胞增殖周期失調(diào)，進(jìn)而形成腫瘤。眾多研究數(shù)據(jù)表明，宿主基因c-Raf-1參與了HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[7]，并且c-Raf-1的活化在肝癌的發(fā)展中也起重要作用[8]。這就提示我們c-Raf-1基因可能是抗HBV藥物設(shè)計(jì)的潛在作用靶點(diǎn)，抑制c-Raf-1可能起到抗HBV復(fù)制及其疾病進(jìn)程的作用。

反義核酸（antisense oligonucleotide）是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，利用一段特異互補(bǔ)的DNA或RNA片段抑制或封閉特定基因表達(dá)的一門(mén)技術(shù)，是在mRNA水平干擾基因功能，開(kāi)發(fā)新藥的一種方法[9]。我們通過(guò)設(shè)計(jì)并篩選能特異性抑制c-Raf-1基因的反義核酸，驗(yàn)證通過(guò)干擾c-Raf-1基因的功能是否具有抑制HBV表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

4～5周齡C57/BL6雄性小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2.2.15由本實(shí)驗(yàn)保存，在含10%胎牛血清（FBS，Hyclone公司）、380 μg/mL G418的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液［M&C Gene Technology（Beijing）Ltd.］中，于 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；GenJet Ver.II轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自SignaGen公司；HBsAg及乙肝e抗原（HBeAg）定性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?？迫A有限公司；HBsAg及HBeAg定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京泰格有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所（Dojin?do）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 靶向c-raf-1基因反義核酸的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中人和小鼠c-raf-1基因mRNA序列（人：NM_002880；小鼠：NM_029780）的同源區(qū)，用 Antisense Design軟件（http://sfold.wadsworth.org）進(jìn)行基于RNA二級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助反義核苷酸設(shè)計(jì)，通過(guò)GenBank聯(lián)機(jī)BLAST比對(duì)，保證所選擇的靶序列具有較好的特異性，設(shè)計(jì)并合成3條靶向 c-raf-1 的反義核苷酸 Raf-565（5′-TTGCTTGTC TTAGAAGGATC-3′）、Raf-943（5′-TAGTAGGTACT TTGGTGCTA-3′）和 Raf-3145（5′-AAACCTGTATT CCTGGCTTC-3′）。

1.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染寡核苷酸

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2.2.15細(xì)胞分別按7×103/孔接種于96孔板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)12～24 h，待細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合時(shí)，參照SignaGen公司GenJet Ver.II轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將脂質(zhì)體和寡核苷酸按3∶1的體積質(zhì)量比混勻，每孔轉(zhuǎn)染的反義核酸體積為 100 μL，終濃度為 0.4 μmol/L。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，轉(zhuǎn)染8 h后去除含脂質(zhì)體-寡核苷酸的轉(zhuǎn)染液，用含10%FBS的DMEM正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染96 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測(cè)HBsAg和HBeAg的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞上清HBsAg和HBeAg的檢測(cè)

收集細(xì)胞上清，按照HBsAg和HBeAg的ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。即取50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液加入包被有HBsAg或HBeAg抗體的96孔板中，每孔加入50 μL的HBsAg或HBeAg對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)結(jié)合物，封板，振蕩混勻，于37℃溫箱孵育30 min，手工洗板5次，加入顯色液A和B，封板，振蕩混勻，于37℃溫箱孵育15 min，加終止液50 μL，振蕩混勻，酶標(biāo)儀上測(cè)定D450nm值。

1.5 反義核酸細(xì)胞毒性檢測(cè)

分 別 以 0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L 的 濃 度 轉(zhuǎn) 染HepG2.2.15細(xì)胞，每個(gè)藥物做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組（按最高劑量），參照SignaGen公司GenJet Ver.II轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將脂質(zhì)體和寡核苷酸按3∶1的體積質(zhì)量比混勻，每孔轉(zhuǎn)染的反義核酸體積為 100 μL，終濃度為 0.4 μmol/L。轉(zhuǎn)染8 h后換正常細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液）繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染96 h后按照CCK-8說(shuō)明書(shū)檢測(cè)反義核酸的細(xì)胞毒性，細(xì)胞加入CCK-8后于37℃孵育箱中孵育0.5～1 h，酶標(biāo)儀上測(cè)定D450nm值。

1.6 RT-PCR檢測(cè)c-Raf-1基因mRNA水平

反義核酸 Raf-3145分別以 0.4、0.8、1.6 μmol/L的濃度轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，并設(shè)正義序列（1.6 μmol/L，5′-TTTGGACATAAGGACCGAAG-3′）、隨機(jī)序 列（1.6 μmol/L，5′-CGGTACAGCCGTTCAATCG A-3′）和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組（按最高劑量）。轉(zhuǎn)染8 h后換正常細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液），37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染96 h后用TRIzol RNA提取試劑盒提取HepG2.2.15細(xì)胞總RNA，并取 1～2 μg RNA 作為模板，加入 2 μL 5×cDNA緩沖液及無(wú)RNase的ddH2O 6 μL，于42℃孵育 3 min，再將其與 2 μL 10×Fast RT 緩沖液、1 μL RT Enzyme Mix和2 μL RQ-RT Primer Mix混合，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，得到cDNA。參照GenBank中人c-Raf-1的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。c-Raf-1基因上游引物為5′-AAGATGCCGTGTTTG ATGGC-3′，下 游 引 物 為 5′-ATCCTGGAAACAGAC TCTCG-3′；GAPDH 上 游 引 物 為 5′-GCGGGAAATC GTGCGTGACATT-3′，下游引物為 5′-GATGGAGTT GAAGGTAGTTTCGTG-3′[10]。 PCR 反 應(yīng) 體 系 包 括2.5 ng cDNA，Taq酶（TaKaRa公司）0.25 μL，10×PCR緩沖液5 μL，dNTP混合液4 μL，上、下游引物各 1 μL，滅菌蒸餾水 35 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 反義核酸體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)

取4～5周齡C57/BL6雄性小鼠50只，每只尾靜脈注射相當(dāng)于體重10%的PBS和6 μg pHBV1.18質(zhì)粒[11]，在 5～8 s內(nèi)注射完畢，2 d 后檢測(cè) HBsAg和HBeAg的表達(dá)，并分為模型對(duì)照組和3個(gè)給藥組（劑量分別為 30、10、3 mg/kg），每組10只；腹腔注射隔天給藥，給藥容積0.2 mL，對(duì)照組注射0.2 mL PBS，檢測(cè)體重變化；分別于第 2、8、14、21、28、42 d尾靜脈取血，取 10 μL 血與 190 μL PBS 混勻，5000 r/min離心5 min取上清，定量檢測(cè)HBsAg和HBeAg的含量。按化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，取已離心上清50 μL加入已包被有HBsAg或HBeAg抗體的96孔板中，每孔再加入50 μL酶標(biāo)結(jié)合物，封板，振震蕩混勻，于37℃溫箱中孵育30 min，手工洗板5次，加入發(fā)光液A和B，封板，避光，振蕩混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)光值。

1.8 做圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用軟件Graph Pad Prism 5做圖，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，假設(shè)檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)或方差分析，P值以星號(hào)表示（***為P＜0.001，**為P＜0.01，*為P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 靶向c-Raf-1的反義核酸抗HBV篩選

以0.4 μmol/L劑量轉(zhuǎn)染反義核酸至HepG2.2.15細(xì)胞，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中的HBsAg和HBeAg表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖1，反義核酸Raf-3145對(duì)HBsAg具有較好的抑制作用。

2.2 反義核酸Raf-3145抗HBV的劑量依賴(lài)關(guān)系

分別將反義核酸Raf-3145以0.2、0.4、0.8和1.6 μmol/L的劑量轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，正義序列與反義序列劑量為1.6 μmol/L，考察Raf-3145抑制HBV的劑量依賴(lài)關(guān)系，ELISA方法檢細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg水平，結(jié)果顯示Raf-3145對(duì)HBsAg的表達(dá)具有一定的抑制作用，并和劑量呈正相關(guān)（圖2）。

圖1 反義核酸對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg表達(dá)的抑制作用

2.3 反義核酸Raf-3145對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性檢測(cè)

分別將反義核酸 Raf-3145 以 0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L的劑量轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，8 h后換液正常培養(yǎng)，并于轉(zhuǎn)染96 h后加入CCK-8，于37℃、5%CO2孵育箱中孵育0.5～1 h，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)D450nm值，結(jié)果顯示當(dāng)給藥濃度在3.2 μmol/L時(shí)細(xì)胞稍顯毒性（圖3）。

2.4 RT-PCR檢測(cè)反義核酸Raf-3145對(duì)c-Raf-1基因mRNA水平的抑制作用

分別將反義核酸Raf-3145以0.4、0.8和1.6 μmol/L的劑量轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，正義序列與反義序列濃度為1.6 μmol/L，8 h后換液正常培養(yǎng)，并于轉(zhuǎn)染96 h后提取細(xì)胞總RNA，濃度結(jié)果顯示細(xì)胞總RNA純度較好（D260nm/D280nm為1.8～2.0），瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示無(wú)降解。取等量的總RNA 1 μg，按要求進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，Raf-3145對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中靶基因c-Raf-1的抑制效果比較明顯，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)關(guān)系（圖4）。

圖2 Raf-3145對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清HBsAg和HBeAg表達(dá)抑制的劑量依賴(lài)關(guān)系

圖3 CCK-8檢測(cè)反義核酸對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用

圖4 Raf-3145對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)c-Raf-1基因mRNA水平的抑制作用

2.5 反義核酸Raf-3145抗HBV體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)

利用HBV小鼠水動(dòng)力模型評(píng)價(jià)了反義核酸Raf-3145的體內(nèi)抗HBV活性，ELISA定量檢測(cè)結(jié)果表明只有Raf-3145高劑量組對(duì)HBsAg呈現(xiàn)出較明顯的抑制作用，其他組對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制作用不明顯，個(gè)別時(shí)間點(diǎn)還呈現(xiàn)了一定的促進(jìn)作用（圖5）。與對(duì)照組比較，各給藥組均無(wú)明顯的體重下降趨勢(shì)；解剖結(jié)果肉眼未見(jiàn)明顯器質(zhì)性病變，表明在該劑量范圍內(nèi)未見(jiàn)明顯毒性（圖6）。

圖5 反義核酸Raf-3145對(duì)小鼠血清中HBsAg、HbeAg表達(dá)的抑制作用

圖6 反義核酸Raf-3145對(duì)小鼠體重的影響

3 討論

Raf激酶有3種不同亞型，即Raf-1/c-Raf-1、Raf-A和Raf-B。Raf-A和Raf-B表現(xiàn)出獨(dú)特的組織表達(dá)形式，但c-Raf-1的表達(dá)更廣泛[12]。目前，對(duì)于HBV是如何調(diào)節(jié)c-Raf-1表達(dá)的機(jī)制還不是很清楚，但有研究顯示，HBV能通過(guò)增強(qiáng)Raf-1啟動(dòng)子的活性，提高其在HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)[13]。以往研究c-Raf-1在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)多數(shù)與Raf1/MAPK信號(hào)通路的激活有密切關(guān)系，且c-Raf-1在此過(guò)程中起重要作用[14]。HBV轉(zhuǎn)錄激活的2種蛋白均可引發(fā)該通路的激活，HBV的X蛋白更是與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系[15]。另外，c-Raf-1還與其他多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[3，16-19]。c-Raf-1作為癌癥治療的靶點(diǎn)已有相關(guān)報(bào)道，Kasid等證明用特異反義核酸ISIS-5132干擾c-Raf-1基因后，能夠抑制無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)的人類(lèi)肺、卵巢及乳腺腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)[20]，并首次證明了c-Raf-1基因是抗癌癥研究中有效的靶點(diǎn)；還有研究顯示用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的靶向c-Raf-1的反義核酸可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞c-Raf-1蛋白的表達(dá)[21]。

當(dāng)前治療乙肝的藥物主要靶向病毒自身，容易產(chǎn)生耐藥性，靶向HBV復(fù)制必需的宿主基因有望解決這一問(wèn)題。c-Raf-1在HBV復(fù)制過(guò)程中的機(jī)制雖不是很清楚，但其在HBV復(fù)制中的關(guān)鍵角色卻是確定的。本研究的新穎之處在于首次利用反義技術(shù)設(shè)計(jì)靶向宿主基因c-Raf-1的反義核酸，探討c-Raf-1作為抗HBV靶點(diǎn)的有效性。為了便于體內(nèi)外同步篩選驗(yàn)證，我們選擇的靶序列為人鼠同源序列，同時(shí)盡量避免脫靶效應(yīng)。體內(nèi)外結(jié)果顯示Raf-3145對(duì)HBsAg的表達(dá)表現(xiàn)出較好的抑制作用?？紤]到c-Raf-1基因參與了HBV的復(fù)制過(guò)程，且有研究顯示c-Raf-1在肝癌患者體內(nèi)的表達(dá)與HBV有關(guān)[13]，因此靶向c-Raf-1的藥物不但可抑制HBsAg的表達(dá)，有利于打破免疫耐受，而且可能延緩HBV導(dǎo)致的肝癌發(fā)展進(jìn)程，具有重要的研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

綜上所述，本研究篩選并證實(shí)靶向基因c-Raf-1的反義序列Raf-3145具有一定的抑制HBsAg表達(dá)的活性，進(jìn)而驗(yàn)證了靶基因c-Raf-1的可靠性?？紤]到反義序列Raf-3145具有的潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值，值得對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的藥效學(xué)和毒性研究。

[1]Dandri M,Locarnini S.New insight in the pathobiology of hepatitis B virus infection[J].Gut,2012,61(Suppl 1):i6-17.

[2]Ding X,Yang J,Wang S.Antisense oligonucleotides targeting abhydrolase domain containing 2 block human hepatitis B vi?rus propagation[J].Oligonucleotides,2011,21(2):77-84.

[3]Chen Y,Ouyang G L,Yi H,et al.Identification of RKIP as an invasion suppressorprotein in nasopharyngealcarcinoma byproteomicanalysis[J].JProteome Res,2008,7(12):5254-5262.

[4]HaoL,SakuraiA,WatanabeT,etal.DrosophilaRNAi screen identifies host genes important for influenza virus repli?cation[J].Nature,2008,454(7206):890-893.

[5]Konig R,Stertz S,Zhou Y,et al.Human host factors re?quired for influenza virus replication[J].Nature,2010,463(7282):813-817.

[6]Stockl L,Berting A,Malkowski B,et al.Integrity of c-Raf-1/MEK signal transduction cascade is essential for hepatitis B virus gene expression[J].Oncogene,2003,22(17):2604-2610.

[7]Qu J,Li J,Chen K,et al.Hepatitis B virus regulation of Raf1 promoter activity through activation of transcription fac?tor AP-2alpha[J].Arch Virol,2012.

[8]殷飛,趙雅娟,姚樹(shù)坤.Raf-1在肝細(xì)胞肝癌組織的表達(dá)[J].世界華人消化雜志,2009,17(6):618-622.

[9]呂艷秋.反義寡核苷酸技術(shù)研究進(jìn)展.[J].廣東醫(yī)學(xué),2006,27(8):1270-1272.

[10]吳永忠,任慶蘭,李少林.C-erbB-2與c-raf-1基因反義寡核苷酸聯(lián)合對(duì)人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治療作用][J].癌癥,2003,22(8):836-839.

[11]Wang X J,Li Y,Huang H,et al.A simple and robust vec?tor-based shRNA expression system used for RNA interference[J].PLoS One,2013,8(2):e56110.

[12]Morrison D K,Cutler R E.The complexity of Raf-1 regulation[J].Curr Opin Cell Biol,1997,9(2):174-179.

[13]Tian Y,Hu Y,Wang Z,et al.Hepatitis B virus regulates Raf1 expression in HepG2.2.15 cells by enhancing its promot?er activity[J].Arch Virol,2011,156(5):869-874.

[14]Hwang Y H,Choi J Y,Kim S,et al.Over-expression of c-raf-1 proto-oncogene in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J].Hepatol Res,2004,29(2):113-121.

[15]李鋼,胡明道.乙型肝炎病毒X蛋白在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(11):1666-1668.

[16]Fransén K K M,Osterstr?m A,Dimberg J,et al.Mutation analysis of the BRAF,ARAF and RAF-1 genes in human colorectal adenocarcinomas[J].Carcinogenesis,2004,25(4):527-533.

[17]Meng F D J,Liu N,Zhang J.Inhibition of gastric cancer an?giogenesis by vector-based RNA interference forRaf-1[J].Cancer Biol Ther,2005,4(1):113-117.

[18]Chattopadhyay I P R,Singh A,Vasudevan M.Molecular pro?filing to identify molecular mechanism in esophageal cancer with familial clustering[J].Oncol Rep,2009,21(5):1135-1146.

[19]Mullen P M F,Monia B P,Smyth J F.Comparison of strate?gies targeting Raf-1 mRNA in ovarian cancer[J].Int J Can?cer,2006,118(6):1565-1571.

[20]Kasid U D A.RAF antisense oligonucleotide as a tumor ra?diosensitizer[J].Oncogene,2003,22(37):876-5884.

[21]Cheng Y C,Stein C A.Antisense inhibition of gene expres?sion[J].Cancer:Princ Pract Oncol,1997,63(5):3057-3070.