王蓓，戎瑞雪，鄭聰毅，曹志然，羅都強

(1.河北大學 基礎醫(yī)學院，河北 保定 071000；2.河北大學 生命科學學院,河北 保定 071002)

牛耳楓生物堿2-hydroxyyunnandaphnine D體外抗腫瘤活性及作用機制

王蓓1，戎瑞雪1，鄭聰毅1，曹志然1，羅都強2

(1.河北大學 基礎醫(yī)學院，河北 保定 071000；2.河北大學 生命科學學院,河北 保定 071002)

為了研究牛耳楓生物堿2-hydroxyyunnandaphnine D體外抗腫瘤活性及作用機制，用MTT法檢測 6.25～100 mg/L 2-hydroxyyunnandaphnine D分別作用于人肝癌細胞(HepG-2)、人乳腺癌細胞(MCF-7)及人宮頸癌細胞(HeLa)后不同時間點的細胞存活并計算細胞增殖抑制率和IC50；FDA/PI雙染色熒光顯微鏡觀察細胞死亡情況；分光光度法檢測Caspase-3酶活性變化；MTT法檢測凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對2-hydroxyyunnandaphnine D抑瘤活性的影響.結(jié)果顯示:2-hydroxyyunnandaphnine D對3種瘤株均有明顯的抑制作用，且具有明顯的時效量效關系，其48 h的IC50值分別為(1.30±0.09)，(7.32±0.10)和(8.41±0.11)mg/L.FDA/PI雙染色熒光顯微鏡觀察顯示2-hydroxyyunnandaphnine D組中死亡細胞數(shù)較正常對照組細胞死亡數(shù)量增加，且隨著劑量的加大細胞死亡數(shù)量增加.MTT法顯示凋亡抑制劑Z-VAD-FMK不能阻斷2個濃度的2-hydroxyyunnandaphnine D對HepG-2細胞的增殖抑制作用.Caspase-3酶活性測定顯示l0,30 mg/L 2-hydroxyyunnandaphnine D作用后腫瘤細胞的Caspase-3酶活力單位與正常對照組比較無統(tǒng)計學意義.結(jié)果表明：牛耳楓生物堿2-hydroxyyunnandaphnine D 在體外具有明顯的抑制腫瘤細胞增殖的作用, 其作用機制并非通過激活Caspase-3途徑.

牛耳楓；2-hydroxyyunnandaphnine D; MTT； Z-VAD-FMK；Caspase-3

牛耳楓(DaphniphyllumcalycinumBenth)為虎皮楠科(Daphniphyllaceae)虎皮楠屬(Daphniphyllum)植物, 原產(chǎn)于我國華南地區(qū),以根、葉入藥，清熱解毒，活血舒筋.該科植物的主要特征是含有次生代謝物質(zhì)生物堿類，其多變的骨架和復雜的多環(huán)結(jié)構(gòu)吸引了許多學者對其深入的研究[1-2].生物堿大多數(shù)存在于植物當中，又稱植物堿.大量研究表明，天然植物中的生物堿具有明顯的抗腫瘤功效，如長春堿是從夾竹桃科植物長春花中提取出的生物堿，具有抑制微管蛋白組裝的活性，并且毒性低，目前已成為一類作用于M期的特異性腫瘤化療藥物[3]；瑞香狼毒總生物堿對肝癌BEL-7402細胞和胃癌SGC-7901細胞表現(xiàn)出較強的殺傷作用[4].前期研究發(fā)現(xiàn)虎皮楠生物堿對某些腫瘤細胞有抑制作用[5].本課題組采用色譜方法從牛耳楓莖葉中提取分離到了10種生物堿[6]，其中2-hydroxyyunnandaphnine D是從該植物中首次分離到的一種新的生物堿[7]，有關其抗腫瘤活性的研究還未見報道.本文采用MTT法觀察了2-hydroxyyunnandaphnine D 在體外對人肝癌細胞株(HepG-2)、人宮頸癌細胞(Hela)、人乳腺癌細胞株(MCF-7) 的抑制增殖作用，并選擇最敏感的HepG-2作為研究對象，通過FDA/PI雙染色熒光顯微鏡觀察法、凋亡抑制劑阻斷實驗、Caspase-3酶活性檢測等手段初步探討了2-hydroxyyunnandaphnine D抗腫瘤作用機制，從而為該化合物的合理開發(fā)及利用提供了實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1細胞系、主要試劑及儀器

HepG-2， MCF-7，Hela細胞系(中國科學院藥物研究所)；二甲基亞砜DMSO(Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)；2-hydroxyyunnandaphnine D(河北大學生命科學學院)；凋亡抑制劑Z-VAD-FMK 、PKC抑制劑Staurosporine、 Caspase-3活性檢測試劑盒、 Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所).

熒光顯微鏡(OlymPus公司)；CO2培養(yǎng)箱HF90(上海力申科學儀器有限公司)；潔凈工作臺SW-CJ-2FD(蘇州安泰空氣技術有限公司)； ELX-800全自動酶標儀(ELISA Reader 美國寶特有限公司).

1.2細胞培養(yǎng)

常規(guī)復蘇細胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含體積分數(shù)為10%的胎牛血清、100萬U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)腫瘤細胞，置于含體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞調(diào)整所需密度，進行實驗.

1.3樣品的配制

用DMSO溶解2-hydroxyyunnandaphnine D，使其質(zhì)量濃度為10 mg/mL，然后用無血清的培養(yǎng)液進行稀釋,使其成為1 mg/mL 的儲備液，過濾除菌，分裝后在-80 ℃儲存，使用時再稀釋成所需質(zhì)量濃度.

1.4MTT法檢測2-hydroxyyunnandaphnineD對腫瘤細胞增殖的影響

分別取對數(shù)生長期的HepG-2細胞、Hela細胞和MCF-7細胞，調(diào)整細胞密度為2×107L-1， 接種于96孔板中，90 μL/孔，培養(yǎng)24 h貼壁后，每孔加入不同質(zhì)量濃度的2-hydroxyyunnandaphnine D 10 μL，使其終質(zhì)量濃度分別為100，50，25，12.5和6.25 mg/L，陽性對照組每孔加10 μL的順鉑(DDP)，終質(zhì)量濃度分別為100，50，25，12.5和6.25 mg/L，陰性對照組每孔加10 μL含相應濃度DMSO(體積分數(shù)分別為1%，0.5%，0.25%，0.125%和0.062 5%)的培養(yǎng)液；每組設3個復孔，空白對照孔只加培養(yǎng)液不加細胞.于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱分別繼續(xù)培養(yǎng)20，44，68 h后取出，每孔加MTT(10 g/L)10 μL，4 h后棄去上清液，加入100 μL DMSO振蕩器振蕩5 min，在490 nm波長下檢測其吸光度值(A)，并計算腫瘤細胞增殖抑制率(IR)，IR=(1-藥物A/陰性對照A)×100%.并根據(jù)改良寇氏法計算半數(shù)抑制濃度[8]lgIC50=Xm-I×(P-(3-Pm-Pn)/4)[Xm:1g最大劑量；I:1g(最大劑量/相臨劑量)；P:陽性反應率之和；Pm:最大抑制率；Pn:最小抑制率].

1.5FDA/PI雙染色熒光顯微鏡觀察

取對數(shù)期的HepG-2細胞，使細胞密度為1×107L-1，置于37 ℃恒溫恒濕、含體積分數(shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；按照分組分別加入含2-hydroxyyunnandaphnine D的RPMI 1640培養(yǎng)液(終質(zhì)量濃度分別為10和30 mg/L)，對照組只加入RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞、并用PBS緩沖液洗滌，各組分別加入2 μL FDA染液(200 mg/L)及70 μL PI染液(100 mg/L)，室溫閉光10 min，于熒光顯微鏡觀察并拍照.

1.6凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對2-hydroxyyunnandaphnineD抑瘤活性的影響

將HepG-2細胞按每孔8×103個接種于96孔板，37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,細胞貼壁后進行以下實驗.實驗設正常對照組、Staurosporine(STS)50 mol/L組、STS 50 mol/L+Z-VAD-FMK 20 μmol/L組、2-hydroxyyunnandaphnine D 10 mg/L組、2-hydroxyyunnandaphnine D 10 mg/L + Z-VAD-FMK 20 μmol/L組、2-hydroxyyunnandaphnine D 30 mg/L組及2-hydroxyyunnandaphnine D 30 mg/L + Z-VAD-FMK 20 μmol/L組，每組設3個復孔，分別作用12 h后，采用MTT法測定細胞存活,同時計算各組細胞的增殖抑制率，實驗重復3次.

1.72-hydroxyyunnandaphnineD對HepG-2細胞Caspase-3酶活性的影響

取對數(shù)生長期的HepG-2細胞，接種于4個100 mL培養(yǎng)瓶(每瓶1×106個細胞 )，37 ℃恒溫恒濕、含體積分數(shù)為5% 的CO2條件孵育24 h；實驗設10和30 mg/L 2-hydroxyyunnandaphnine D組、正常對照組及STS組；收集細胞后分別按試劑盒進行蛋白的提取并按試劑盒進行Caspase-3酶活性的檢測.

1.8統(tǒng)計學分析

采用單因素方差分析和t檢驗，所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計均在計算機SPSS16.0軟件包內(nèi)進行.檢驗水準α=0.05，P<0.05表示有顯著性差異.

2 結(jié)果

2.12-hydroxyyunnandaphnineD對幾種腫瘤細胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，2-hydroxyyunnandaphnine D對人肝癌細胞株(HepG-2)、人宮頸癌細胞(Hela)、人乳腺癌細胞株(MCF-7)3種瘤株均有明顯的抑制作用，其48 h的IC50值分別為(1.30±0.09)，(7.32±0.10)和(8.41±0.11)mg/L，且其抑制作用具有較好的時效和量效關系，順鉑對照組48 h的IC50值分別為(3.23±0.12)，(1.28±0.11)，(0.38±0.08)mg/L(圖1～3).

圖1 2-hydroxyyunnandaphnine D對HepG-2細胞增殖的影響

圖2 2-hydroxyyunnandaphnine D對Hela細胞增殖的影響

圖3 2-hydroxyyunnandaphnine D對MCF-7細胞增殖的影響

2.2熒光顯微鏡觀察2-hydroxyyunnandaphnineD作用后細胞死亡情況

結(jié)果表明：正常對照組中細胞絕大部分發(fā)綠色熒光，細胞為活細胞，個別細胞發(fā)紅色熒光，可能為自然死亡細胞；10 mg/L組中發(fā)紅色熒光的細胞稍增加，細胞死亡數(shù)量增加；30 mg/L組紅色熒光數(shù)量較小劑量組增多，表明細胞死亡增多(圖4).

a.正常對照組；b.2-hydroxyyunnandaphnine D組(10 mg/L)；c.2-hydroxyyunnandaphnine D組(30 mg/L).

2.3Z-VAD-MFK對2-hydroxyyunnandaphnineD抑瘤活性的影響

表1結(jié)果顯示，經(jīng)STS作用12 h后，與正常對照組比較A值顯著降低(P<0.05)，細胞增殖抑制率為(60.13±0.01)%，表明STS成功誘導細胞凋亡； STS+Z-VAD-MFK組與STS組比較，A值增大明顯(P<0.05)，其抑制率為(4.05±0.01)%，而與正常對照組比較，A值則無明顯變化，表明Z-VAD-FMK成功抑制了STS誘導的細胞凋亡；10,30 mg/L 2-hydroxyyunnandaphnine D組的增殖抑制率分別為(16.20±0.09)%和(40.02±0.01)%，而10,30 mg/L 2-hydroxyyunnandaphnine D+Z-VAD-FMK組的細胞增殖抑制率分別為(18.07±0.00)%和(41.12±0.01)%, 2-hydroxyyunnandaphnine D組與2-hydroxyyunnandaphnine D+Z-VAD-FMK組之間均無顯著差異(P>0.05).這表明2-hydroxyyunnandaphnine D殺傷腫瘤細胞的作用沒有被Z-VAD-FMK抑制，即其殺傷腫瘤細胞的機制與胱天蛋白酶Caspase-3激活通路無關.

表1 凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對2-hydroxyyunnandaphnine D抑瘤活性的影響

2.4Caspase-3酶活性的測定

由表2可知，10,30 mg/L 2-hydroxyyunnandaphnine D組Caspase-3酶活力單位分別與正常對照組比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明2-hydroxyyunnandaphnine D未激活Caspase-3酶，即未通過激活Caspase-3途徑引起腫瘤細胞凋亡；而凋亡陽性對照組(STS組)中催化的酶活力單位量與正常對照組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，表明STS組成功激活Caspase-3酶發(fā)生細胞凋亡(表2).

表2 2-hydroxyyunnandaphnine D對HepG-2細胞Caspase-3酶活性的影響

3 討論

自第1個植物來源生物堿類的抗腫瘤藥物長春新堿應用于臨床以來, 生物堿類抗腫瘤藥物發(fā)展得十分迅速.其中天然生物堿成分是很有前途的一類活性物質(zhì)，并已成功開發(fā)了幾種藥物，如紫杉醇、喜樹堿等，成為具有劃時代意義的抗腫瘤藥.2-hydroxyyunnandaphnine D是本課題組采用現(xiàn)代的分離鑒定技術從牛耳楓中獲得的新生物堿，本研究結(jié)果表明，2-hydroxyyunnandaphnine D在體外對HepG-2細胞、MCF-7細胞和Hela細胞3種腫瘤細胞株均具有抑制細胞增殖的作用，尤其是對其中的HepG-2細胞抑制作用最強，且抑制作用具有較好的時效和量效關系.

國內(nèi)外研究表明生物堿可以通過多種機制作用于腫瘤細胞，例如可以誘導腫瘤細胞的凋亡；誘導腫瘤細胞的分化；抑制腫瘤細胞增殖；抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ活性；還可作用于腫瘤細胞的微管，抑制其聚合或解聚等[9].本實驗以最敏感的HepG-2 細胞作為研究對象，通過FDA/PI雙染色熒光顯微鏡觀察，結(jié)果表明2-hydroxyyunnandaphnine D可引起腫瘤細胞的死亡.目前研究表明細胞死亡的方式有多種，一般可分為程序性細胞死亡和非程序性細胞死亡，程序性細胞死亡一般是指細胞凋亡，非程序性細胞死亡是指細胞壞死[10]，如果按其發(fā)生機制的不同還可分為Caspase依賴型和Caspase非依賴型，典型的細胞凋亡是Caspase依賴型的，然而有些細胞死亡的形態(tài)用壞死或凋亡并不能解釋.最近有文獻報道還存在著一種非凋亡性程序性細胞死亡.它是一種新的細胞死亡方式, 命名為亞凋亡(Paraptosis)，而亞凋亡屬于Caspase非依賴型的程序性細胞死亡[11-14].星形孢菌素STS是一種廣譜的細胞凋亡誘導劑，可以通過抑制蛋白激酶C，誘導細胞凋亡[15].為了研究2-hydroxyyunnandaphnine D誘導腫瘤細胞死亡的機制，本文以凋亡誘導劑STS作為陽性對照，觀察了凋亡阻斷劑Z-VAD-FMK對2-hydroxyyunnandaphnine D抑瘤活性的影響，結(jié)果表明Z-VAD-FMK可成功阻斷STS誘導的腫瘤細胞凋亡但不能阻斷2-hydroxyyunnandaphnine D誘導的細胞死亡；Caspase-3酶活性檢測也表明2-hydroxyyunnandaphnine D作用后腫瘤細胞內(nèi)的Caspase-3酶活性沒有明顯變化；光學顯微鏡下觀察死亡細胞的形態(tài)既不同于壞死又不同于典型的凋亡，上述的實驗結(jié)果提示2-hydroxyyunnandaphnine D可能通過類似于Paraptosis的方式作用于HepG-2細胞來發(fā)揮抗腫瘤作用[16-18]，其確切作用機制尚待進一步研究.

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Anti-tumoractivityandthemechanismof2-hydroxyyunnandaphnineDfromDaphniphyllumcalycinuminvitro

WANGBei1,RONGRuixue1,ZHENGCongyi1,CAOZhiran1,LUODuqiang2

(1.College of Basic Medical Science, Hebei University, Baoding 071000, China;

2.College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China)

To study the anti-tumor activity and the mechanism of 2-hydroxyyunnandaphnine D fromDaphniphyllumcalycinum. The proliferation inhibition rate and IC50of HepG-2, MCF-7 and HeLa cells were measured by MTT assay in vitro treated by 2-hydroxyyunnandaphnine D(6.25--100 mg/L)after 24 , 48 and 72 h. The cell death was observed by fluorescence microscopy . The inhibition pathway of 2-hydroxyunnandaphnine D was analyzed by apoptosis inhibitor Z-VAD-FMK by MTT. The activity of Caspase-3 in tumor cells was detected by spectrophotography. The MTT assay results revealed that 2-hydroxyyunnandaphnine D could inhibit the proliferation of the three kinds of tumor cells obviously and the inhibitory rates significantly increased in a dose-dependent and time-dependent manner. The IC50were(1.30±0.09),(7.32±0.10)and(8.41±0.11)mg/L after 48 h treated with 2-hydroxyyunnandaphnine D respectively. There were more death cells in 2-hydroxyyunnandaphnine D groups than that of normal group. The killing effect on HepG-2 cells of 2-hydroxyyunnandaphnine D was not impacted by Z-VAD-FMK. The Caspase-3 enzyme activity of HepG-2 cells was no obvious change compared with the control group, which indicated that Caspase-3 had not been activated in the course of cell death induced by 2-hydroxyyunnandaphnine D. The results suggested that 2-hydroxyyunnandaphnine D could inhibit the proliferation of tumor cells and the mechanism were not by activating Caspase-3.

Daphniphyllumcalycinum; 2-hydroxyyunnandaphnine D； MTT； Z-VAD-FMK；Caspase-3

10.3969/j.issn.1000-1565.2013.04.012

2012-09-21

國家自然科學基金資助項目(30671385)

王蓓(1978-)，女，河北獻縣人，河北大學講師，碩士，主要從事腫瘤免疫及抗感染免疫研究.

E-mail:wp780203@163.com

曹志然(1963-)，女，河北景縣人，河北大學教授，主要從事中藥藥理抗腫瘤研究.E-mail:caozhiran@163.com

羅都強(1968-),男，陜西扶風人，河北大學教授，博士，主要從事天然藥物性成分分析.

E-mail:Duqiangluo@163.com

R96

A

1000-1565(2013)04-0401-07

(責任編輯趙藏賞)