李彥芹，李春青，周潔芳，龐志多，王鳳華

(河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002)

植酸酶高產(chǎn)菌株的選育

李彥芹，李春青，周潔芳，龐志多，王鳳華

(河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002)

從土壤中分離到1株植酸酶高產(chǎn)菌株Pe0，初步鑒定為米曲霉.為了提高植酸酶活力，對Pe0菌株分別進行紫外線和亞硝基胍誘變處理，經(jīng)初篩、復篩、遺傳穩(wěn)定性能檢測，得到1株酶活相對較高、性狀相對穩(wěn)定的菌株Pe2#，酶活穩(wěn)定在10.66 U/mL，較原始菌株提高到3.34倍.另對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最適接種量為4%，最適pH為5.5，最適培養(yǎng)時間為6.5 d.在此基礎上進行培養(yǎng)基正交優(yōu)化，結(jié)果表明：葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為4 g/L，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為2 g/L，MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.1 g/L時所得菌株產(chǎn)酶活力最高.

植酸酶；誘變；選育；發(fā)酵優(yōu)化

植酸(肌醇六磷酸)及其鹽類是植物種子中磷普遍存在的形式，是植酸性飼料中普遍存在的一種抗營養(yǎng)因子，因其在吸收過程中易于和動物腸道內(nèi)的金屬離子，如Ca2+,Zn2+,Fe2+,Cu2+等，以及與蛋白質(zhì)形成不溶性絡合物[1]，所以在生物體內(nèi)的利用率很低.植酸酶(phytase)是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和六磷酸的一類酶的總稱，系統(tǒng)名稱為肌醇六磷酸酶，是一類特殊的酸性磷酸酶，可以抑制植酸對礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的親和，解除植酸的抗營養(yǎng)作用，增加磷的利用率，降低農(nóng)業(yè)生態(tài)負擔.目前在嬰兒食品、飼料的添加劑、廢棄物處理等領域發(fā)揮重要作用.本實驗對分離純化的菌株Pe0進行誘變選育，獲得產(chǎn)酶活力高的突變株，并對其進行性狀穩(wěn)定性研究及發(fā)酵條件優(yōu)化，旨在得到產(chǎn)酶活力較高、性狀相對穩(wěn)定的菌株，以期對生產(chǎn)實踐及科學研究提供一定的參考.

1 材料

1.1菌種

菌株Pe0,本實驗室分離純化菌種.

1.2試劑及培養(yǎng)基

甲酰胺，亞硝基胍，三重蒸餾水， pH 5.5的醋酸緩沖液，植酸鈉溶液，鉬酸銨試劑，釩酸銨試劑，釩鉬酸銨顯色/終止液，乳酸石炭酸棉藍染液；查氏培養(yǎng)基，初篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基[2]，液體發(fā)酵培養(yǎng)基[2].

1.3實驗儀器

ZHWY-2102型雙層大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器)；TDL-5型臺式低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；722E可見分光光度計(上海光譜儀器).

2 方法

2.1鑒定

將Pe0菌株根據(jù)《中國真菌志》[3]進行菌種鑒定，觀察其菌落、分生孢子穗、分生孢子等的特征.

2.2酶活測定

取4支10 mL離心管，其中1支作空白對照，分別加入3.0 mL植酸鈉溶液，置于37 ℃水浴鍋中預熱5 min，然后每隔1 min依次在反應管中加入1.0 mL植酸酶提取液，在37 ℃水浴鍋中溫育30 min，每隔1 min加入4.0 mL釩鉬酸銨顯色/終止液，然后在空白管中加入1.0 mL植酸酶提取液，混合搖勻，4 000 r/min離心10 min.于415 nm波長處測吸光度，參照磷標準曲線計算酶活[4].

植酸酶酶活定義：在溫度為37 ℃,pH 5.5 的條件下，每min從濃度為5.0 mmol/L 植酸鈉溶液中釋放1 μmol無機磷，即為1個植酸酶活性單位，以U 表示[5].磷濃度標準曲線見圖1.

酶活力單位定義：在37 ℃、pH 5.5條件下，在植酸鈉溶液中每min釋放1 nmol無機磷所需要的酶量為1個酶活力單位.

圖1 磷標準曲線

2.3誘變處理

將菌株Pe0轉(zhuǎn)接到查氏培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d進行活化.制備1～5×106mL-1的孢子懸液，分別進行紫外線(15 W紫外燈30 cm處充分照射3，5，7，9 min)和亞硝基胍(300，400，500，600 μg / mL)的單因子誘變.經(jīng)過中間培養(yǎng)，初篩、復篩并采用釩-鉬酸銨法測酶活力，篩選酶活更高的菌株.

2.4菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性測定

將復篩得到的酶活高的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)5代，每代測定其酶活，判斷其遺傳穩(wěn)定性.

2.5發(fā)酵條件優(yōu)化

對獲得的遺傳性能穩(wěn)定的菌株分別進行接種量、pH、發(fā)酵時間[6]及培養(yǎng)基成分的優(yōu)化.

3 結(jié)果及討論

3.1菌種鑒定

將菌株Pe0接種于查氏固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 d后，菌落直徑平均為2.0 cm.最初菌落質(zhì)地疏松，為白色，后轉(zhuǎn)為黃色、黃褐色.分生孢子頭呈放射狀，其分生孢子梗有橫隔，分生孢子為球形或橢圓形(圖2).根據(jù)《真菌鑒定手冊》初步鑒定為米曲霉(Aspergillusoryzae).

圖2 菌絲及孢子形態(tài)

3.2菌株的誘變

誘變得到200個菌株，對其中透明圈與菌落直徑比值較大的9株進行復篩，其酶活測定結(jié)果見表1.

表1 菌株選育結(jié)果

誘變前后對比，菌落形態(tài)發(fā)生了一些變化：經(jīng)紫外線誘變后的平板菌落比原始菌平板菌落大且厚實.這說明菌體經(jīng)紫外線誘變作用，菌體基因確實受到影響，內(nèi)在基因的變化導致菌體表觀的改變，誘變效果較明顯.經(jīng)亞硝基胍處理的菌落形態(tài)無明顯變化.

紫外線誘變使植酸酶酶活由原來的3.19 U/mL最大增加到18.00 U/mL，為原始菌株的5.61倍；經(jīng)亞硝基胍誘變后，植酸酶酶活由原來的3.19 U/mL最大增加到22.81 U/mL，為原始菌株的7.15倍.由此可見，透明圈與菌落直徑比與酶活有一定的關系，但不完全是正相關.綜合比較舍棄Pe1#，Pe1，Pe3.

3.3遺傳穩(wěn)定性

將篩選出的Pe2#，Pe3#，Pe4#，Pe2，Pe4，Pe5菌株進行遺傳穩(wěn)定性檢測，其結(jié)果如表2所示.

表2 遺傳穩(wěn)定性檢測結(jié)果

比較表2各菌株傳代的平均酶活，并進行方差分析，其穩(wěn)定性最好的菌株為Pe2#,結(jié)果如表3，表4.

表3 誘變菌株Pe2#的穩(wěn)定性

表4 Pe2#菌株傳代次數(shù)的方差分析

由表4的均方值看出，Pe2#菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性.通過方差分析，其組間差異的P值遠遠大于0.05，說明傳代次數(shù)對酶活性變化影響不顯著，即傳代次數(shù)未對其產(chǎn)酶活性產(chǎn)生影響，表明其具有穩(wěn)定的遺傳性，因此對該株菌進行下一步的研究.

3.4發(fā)酵條件優(yōu)化

3.4.1 最適接種量、pH、發(fā)酵時間的確定

由圖3可知，隨接種量增加，酶活也不斷地增加，接種量為4%時，酶活達到最高，接種量接近7%時，酶活很低，可能由于接種量過大引起菌種內(nèi)部競爭，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，產(chǎn)酶能力降低.

由圖4可以看出，最適pH為5.5.當pH低于5.5時，酶活在pH 4.5時高于pH 5，可能是由于粗酶液中含有植酸酶多種同功酶所致.當處于堿性環(huán)境中，基本不產(chǎn)酶，但在pH 6.5時出現(xiàn)1個小峰值，可能是在此條件下酶活部分恢復所致[7].

由圖5可知，4～6 d，酶活逐漸增加，培養(yǎng)至6.5 d時，酶活顯著提高并達到最高，隨著培養(yǎng)時間的增長，酶活反而降低.所以其最適培養(yǎng)時間為6.5 d.

圖3 接種量對酶活的影響

圖4 pH對酶活的影響

圖5 發(fā)酵時間對酶活影響

3.4.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化的正交實驗結(jié)果及分析

采用L9(34)正交實驗(表5)測定培養(yǎng)基中葡萄糖(A),蛋白胨(B),(NH4)2SO4(C),MgSO4·7H2O(D),對Pe2#菌株產(chǎn)酶的影響.

表5 正交實驗因素水平

表6 L9(34)正交表及實驗分析

圖6 正交各因素水平效應

由表6的R值數(shù)據(jù)及圖6綜合分析，各因素對產(chǎn)酶影響的大小依次為蛋白胨(B)>(NH4)2SO4(C)>MgSO4·7H2O(D)>葡萄糖(A)，其最佳組合為A3B3C2D1，即葡萄糖的質(zhì)量濃度為25 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為4 g/L，(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度為2 g/L，MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度為0.1 g/L .

表7 正交實驗方差分析

經(jīng)計算，發(fā)現(xiàn)A(葡萄糖)的極差(R=9.63)、均方差值相對于因素B(蛋白胨)、C因素((NH4)2SO4)和D(MgSO4·7H2O)的極差、均方差很小，F(xiàn)值不顯著，故對A不做方差分析，將其作為誤差項.因素B(蛋白胨)、C((NH4)2SO4)和D(MgSO4·7H2O)的均方差相對較大(表7)，說明其對米曲霉的產(chǎn)酶影響很大.

4 結(jié)論

本實驗從土壤中分離到1株植酸酶高產(chǎn)菌株Pe0，初步鑒定為米曲霉，對Pe0菌株分別進行紫外線和亞硝基胍誘變處理，經(jīng)初篩、復篩、遺傳穩(wěn)定性檢測，得到1株酶活相對較高、性狀相對穩(wěn)定的菌株Pe2#，酶活穩(wěn)定在10.66 U/mL，較原始菌株提高到3.34倍，相較于張衛(wèi)兵[7]、王尊生等[8]實驗得到的植酸酶活力提高1～3倍，并較常見曲霉屬微生物內(nèi)植酸酶的酶活顯著提高了10倍.另對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最適接種量為4%，最適pH為5.5，最適培養(yǎng)時間為6.5 d.在此基礎上進行培養(yǎng)基正交優(yōu)化，結(jié)果表明,葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為4 g/L，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為2 g/L，MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.1 g/L時所得菌株產(chǎn)酶活力最高.本研究為該菌株更好地服務于飼料、食品等行業(yè)提供了一定的參考依據(jù).

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Screeningofphytase-producingstrain

LIYanqin,LIChunqing,ZHOUJiefang,PANGZhiduo,WANGFenghua

(College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China)

In order to get the mutant strain which was stable and high production of phytase, the originalAspergillusoryzaestrain Pe0 isolated in our laboratory was the staring strains, which were mutagenized separately by UV and nitrosoguanidine. By preliminary screening, rescreening and the detection of genetic stability, Pe2# was obtained which had a relatively high activity and stable characteristics. Its stable activity was 10.66 U/mL, which increased 3.34 times comparing with original strain. To determine the optimum conditions for its enzyme productions, the fermentation conditions were optimized. The composition of the optimum medium were 25 g/L glucose, 4 g/L peptone,2 g/L (NH4)2SO4and 0.1 g/L MgSO4·7H2O.

phytase；mutagenesis；screening；fermentation optimization

10.3969/j.issn.1000-1565.2013.04.011

2011-11-20

國家海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費資助項目(201305001)

李彥芹(1965-)，女，河北滿城人，河北大學副教授，主要從事微生物和免疫學研究.

E-mail:liyanqin88@yahoo.com.cn

Q935

A

1000-1565(2013)04-0394-07

(責任編輯趙藏賞)