李巧云 聞立紅 顏秋梅

KLK14在宮頸癌組織中的表達(dá)及其意義

李巧云 聞立紅 顏秋梅

目的探討KLK14蛋白宮頸癌中的表達(dá)及與臨床病理關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)法SP檢測(cè)10例正常宮頸14例慢性宮頸炎48宮頸癌組織中KLK14蛋白的表達(dá)。應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法RT-PCR檢測(cè)25例宮頸鱗癌及10例正常宮頸組織中KLK14 mRNA的表達(dá)。結(jié)果KLK14蛋白在48例宮頸癌中陽(yáng)性率72.9%，正常宮頸20%，慢性宮頸炎14.3%,三者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，KLK14蛋白陽(yáng)性率與腫瘤臨床分期，病理學(xué)相關(guān)(P<0.05),與年齡組織學(xué)分級(jí)淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。KLK14 mRNA在宮頸癌相對(duì)表達(dá)量高于正常宮頸組織。結(jié)論KLK14表達(dá)參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

宮頸鱗癌；人激肽釋放酶14；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，療效總體生存率不高，經(jīng)常地進(jìn)行評(píng)估是必須的，激肽釋放酶(kallikrein，KLK)家族是目前被研究與惡性腫瘤表達(dá)相關(guān)的基因家族， 參與體內(nèi)多種生理病理過程。KLK14是KLK家族中一員，擬采用SP及RT-PCR研究宮頸癌細(xì)胞內(nèi)KLK14蛋白及mRNA的表達(dá)，探討其在宮頸癌中發(fā)生發(fā)展意義及與臨床病理的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 48例宮頸癌取自2007年1月至2010年1月我院手術(shù)切除標(biāo)本，正常宮頸10例，慢性宮頸炎14例來源于同期子宮切除術(shù)標(biāo)本，所有標(biāo)本部分存于-80℃冰箱中用RNA提取，另一部分用福爾馬林固定石蠟包埋進(jìn)行SP檢測(cè)?；颊吣挲g29～71歲，中位年齡43.5歲。宮頸癌病理：鱗狀細(xì)胞癌43例，腺癌5例，分期：I 期21例,Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，IV期5例。分級(jí)：G112例，G220例，G316例。淋巴轉(zhuǎn)移者17例，無淋巴轉(zhuǎn)移者31例。所有患者均為初發(fā)者，術(shù)前均未接受過放化療治療。同期取正常宮頸組織10例和25例宮頸鱗癌行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑山羊抗人KLK14多克隆抗體(Santn Cruz公司)和SP-9003三步法試劑盒(兔抗羊，北京中杉公司).Trizol試劑購(gòu)自invitrogen公司，AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AMV3500)購(gòu)自promega公司。Ex-Taq酶試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。KLK14及β-actin引物由上海生工生物有限公司合成。RT-PCR儀器為bio-rid公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1SP法 所有組織標(biāo)本固定石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，每批染色均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液(PBS) 代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照取已知KLK蛋白表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌組織的石蠟切片。

1.3.2RT-PCR法 采用Trizol一步法提取組織總RNA，取1 μg總RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照試劑盒說明進(jìn)行)，取2 μg cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，KLK14上游引物序列為5’-CCGCAGACTTCACCACTCG TAT-3’，下游引物序列為5’-AGGTGTGAGGCAGGCGIAAF-3’，用β-actin作為內(nèi)參照，上游引物為5’-TGGCAGGACTTCA GA-3’，下游引物5’-AGTGGCTAGAAGTTCACC-3,[1]。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min, 95℃變性30 sec,56℃退火30 sec,72℃延伸30 sec，35個(gè)循環(huán)后最后72℃延伸5 min,所有的反應(yīng)體系均做2管，作為平行對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)過程中，每次結(jié)束均將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及濃度。

1.4陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué) 參照文獻(xiàn)[2]制訂。KLK14蛋白定位細(xì)胞漿，顯示胞漿為淡黃色或棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，凡顯色強(qiáng)度與背景無明顯差異者為陰性，而顯色強(qiáng)度高于背景為陽(yáng)性表達(dá)，將陽(yáng)性細(xì)胞按其數(shù)量及顯色強(qiáng)度分為3級(jí)，表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于10%，染色強(qiáng)度為弱陽(yáng)性或僅個(gè)別細(xì)胞呈中至強(qiáng)陽(yáng)性染色，即為表達(dá)弱陽(yáng)性(+)；陽(yáng)性細(xì)胞為60%以上，多數(shù)細(xì)胞呈黃色或棕黃色染色，即表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性+++；表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及強(qiáng)度介于上述二者之間為陽(yáng)性(++)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。各計(jì)量資料比較應(yīng)用t檢驗(yàn)(經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn))，KLK14表達(dá)與臨床參數(shù)關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1sP染色顯示KLK14蛋白定位于宮頸上皮細(xì)胞漿，陽(yáng)性表達(dá)率簡(jiǎn)表1，三者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2KLK14蛋白表達(dá)與宮頸癌病理的關(guān)系(見表2)KLK14蛋白的表達(dá)與臨床分期、病理學(xué)有關(guān)，與年齡、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無。

圖1 宮頸鱗狀細(xì)胞癌KLK14蛋白++陽(yáng)性表達(dá)(×200)

組織類型例數(shù)KLK14-+χ2值P值正常108(80)2(20)*炎癥1412(85.7)2(14.3)*惡性4813(27.1)35(72.9)20.4680.001

表2 KLK14蛋白與宮頸癌臨床病理因素間的關(guān)系(*表示校正卡方檢驗(yàn))

2.3KLK14 mRNA在不同宮頸組織中的表達(dá) RT-PCR產(chǎn)物KLK14及β-actin PCR產(chǎn)物片斷長(zhǎng)度為624 bp，455bp。10例正常宮頸組織KLKmRNA表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量為0.30～0.95之間，25宮頸鱗癌 的在為0.88～1.81之間，KLK14 mRNA在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.582,P<0.01)。

2.4KLK14蛋白與KLK14 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 宮頸鱗癌中KLK14 mRNA的基因表達(dá)率很高，與正常宮頸組織表達(dá)量之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這說明KLK14 mRNA水平和蛋白水平表達(dá)有一致性。

圖2 KLK14 mRNA在宮頸正常組織和宮頸癌組織中的表達(dá)

1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.2,3正常宮頸組織,3.4,5，6：宮頸鱗癌

3 討論

3.1KLK基因家族及KLK14的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及蛋白生物學(xué)功能 目前發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)展是一個(gè)多級(jí)式過程，腫瘤細(xì)胞是從基本位點(diǎn)脫落通過血液運(yùn)輸播散至遠(yuǎn)處器官產(chǎn)生腫瘤轉(zhuǎn)移。臨床試驗(yàn)表明惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生依賴惡性腫瘤細(xì)胞合成分泌的蛋白水解酶穿透細(xì)胞基底膜侵襲鄰近組織，現(xiàn)和腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)的胞外蛋白酶有基質(zhì)金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶[3]。人激肽釋放酶KLK(kallikrein)是一組大的絲氨酸蛋白酶家族，位于19q13.4染色體上，由15個(gè)成員組成， 通過激肽釋放，降解胰島素原LDL,血管緊張素，精原素等生物學(xué)功能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移等。

KLK14是KLK家族中一員，全長(zhǎng)6439bp，有三聯(lián)體殘基表明KLK14具有胰蛋白酶活性，翻譯分泌性蛋白[4]。 KLK14基因及蛋白與婦科腫瘤，消化道腫瘤，乳腺癌，肺癌等疾病發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系[4]。

3.2KLK14基因及蛋白在不同宮頸組織的表達(dá)意義 本實(shí)驗(yàn)研究了KLK14蛋白在宮頸細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)現(xiàn) KLK14在正常宮頸，宮頸炎性上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)率較低，在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，與KLK14蛋白在卵巢癌，KLK7、KLK8在宮頸癌中高表達(dá)一致[5]，通過對(duì)KLK14蛋白與宮頸癌臨床病理特征分析，發(fā)現(xiàn)KLK14蛋白的表達(dá)與宮頸癌的年齡及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)，與臨床分期，病理類型相關(guān)，Ⅲ/Ⅳ期患者陽(yáng)性率高于Ⅰ/Ⅱ期，表明KLK14蛋白的表達(dá)一定程度上與宮頸癌的臨床進(jìn)展相關(guān)，本組研究也發(fā)現(xiàn)KLK14 mRNA在宮頸癌中高表達(dá)，與正常宮頸組織表達(dá)量之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這說明KLK14 MRNA水平和蛋白水平表達(dá)有一致性。由此推測(cè)KLK14可能與宮頸癌潛在生物學(xué)行為密切相關(guān)，可能會(huì)是一個(gè)有價(jià)值的腫瘤標(biāo)記物。但因樣本量偏小，KLK14與宮頸癌的淋巴轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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ExpressionofKLK14proteinincervicalcance

LIQiao-yun,WENLi-hong,YANQiu-mei.

DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity450052

ObjectiveTo analyse the expression of klk14 in cervical cancer and the results were studied in correlation with clincopa thological characteristics of patients.MethodsThe expression of KLK14 protein was analysed by immunohistochemistry in paraffin embedded 48 cervical carcinomas, 14 chronic cervicitis and 10 normal cervical tissues. The expression of KLK14 mRNA was determined by RT-PCR in 25 cases of cervical squamous carcinomas and 10 cases of normal cervical tissues.ResultsThe expression of KLK14 protein was observed in cervix tissue, chronic cervicitis and cervical cancer, respectively 20%, 14.3% and 72.9%, there was a stastistical significance. The positive expession of the KLK14 protein was significantly related to clinical stage, pathological type (P<0.05), and not related to age,histological grade,lymph node metastasis. (P>0.05) The mRNA expression of KLK14 in squamous carcinomas are more higher in cervical normal tissues.ConclusionThe expression of KLK14 protein was related to the occurrence and development of cervical squamous carcinomas

Cervical squamous carcinomas； KLK14 protein； RT-PCR

河南省衛(wèi)生廳課題項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2008046)

450052 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院