王石松

CIP2A、β-catenin和C-myc在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達(dá)及意義

王石松

目的探討蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組織化學(xué)SP法同時測定CIP2A、β-catenin和C-myc在對照組和CML各期中的表達(dá),并分析CIP2A、β-catenin和C-myc表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果①CIP2A、β-catenin和C-myc在CML-AP/BP組的表達(dá)顯著高于CML-CP組和對照組(P<0.05), CML-CP組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),CIP2A、β-catenin和C-myc在CML的表達(dá)均成正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。②CIP2A在未緩解組的表達(dá)顯著高于緩解組(P<0.05)。結(jié)論CIP2A高表達(dá)可能是CML發(fā)生急變的機(jī)制之一，這個過程可能是通過上調(diào)C-myc實現(xiàn)的，而且CIP2A高表達(dá)與化療療效密切相關(guān)。

蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子;β-連環(huán)蛋白;C-myc;慢性粒細(xì)胞白血病;免疫組化

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,臨床上分慢性期(chronic phase,CP)、加速期(accelerated phase,AP)和急變期(blastic phase,BP),一旦發(fā)生急變,患者往往在數(shù)月之內(nèi)死亡,預(yù)后極差。Ph染色體的出現(xiàn)和BCR/ABL融合基因的形成是CML發(fā)生的重要機(jī)制。但是關(guān)于CML急變的機(jī)制目前仍不完全明確,探討CML急變的機(jī)制對于改善療效以及干預(yù)CML急變具有重要意義。蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子是最近被識別的一種癌蛋白[1],在多種實體瘤中高表達(dá)并與惡性腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移浸潤有關(guān),然而關(guān)于CIP2A在CML中的研究很少。本研究采用免疫組化方法同時檢測CIP2A、β-catenin和C-myc在CML各期中的表達(dá),初步探討CIP2A在CML發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 參照張之南主編的《血液學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)》[2],46例CML患者為我院2008年7月至2012年6月門診及住院患者：男27例,女19例,平均年齡44.7(18-75)歲。慢性期31例(CML-CP組),加速期2例和急變期13例(CML-AP/BP組), CML-AP/BP組15例化療后完全緩解11例(緩解組), 未緩解4例(未緩解組)。對照組為21例骨髓表現(xiàn)大致正常的非惡性血液病患者,其中男13例,女8例,平均年齡42.2(19-71)歲。

1.2檢測方法及試劑 免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測骨髓單個核細(xì)胞(BMMNC)中CIP2A、β-catenin和C-myc。CIP2A多克隆抗體為Santa Crus公司產(chǎn)品，β-catenin及C-myc單克隆抗體、S-P免疫標(biāo)記試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。髂后或髂前上嵴穿刺取骨髓,用淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077)分離BMMNC并涂片,干燥后用新鮮配制的丙酮溶液于室溫下固定30 min,用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH7.4)漂洗3次;0.1%Triton100通透10 min,再用PBS漂洗3次,然后根據(jù)試劑說明書進(jìn)行操作。每一批實驗均設(shè)陽性及陰性對照，陽性對照采用胃癌切片(由試劑公司提供),陰性對照以PBS代替一抗。

1.3結(jié)果判定 細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽性。綜合考慮顯色程度及陽性顆粒所占的面積:40倍顯微鏡下每張載玻片計數(shù)5個視野,每個視野計數(shù)100個細(xì)胞,取陽性細(xì)胞百分率的平均值作為該份標(biāo)本的陽性細(xì)胞百分率計分,分值按<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別計為0，1，2，3，4分;每個細(xì)胞按染色強(qiáng)度分不著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色4個級別分別計為0,1,2,3分，算出總分除以500作為該份標(biāo)本的平均顯色程度;最后將兩者分?jǐn)?shù)相加,<2分為陰性(-),≥2分為(+)。

1.4臨床治療方案 慢性期給予羥基脲控制白細(xì)胞,加速期和急變期聯(lián)合應(yīng)DA、HA(高三尖杉酯堿、阿糖胞苷)等方案化療,療效標(biāo)準(zhǔn)參照張之南主編的《血液學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)》[2]。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 所收集數(shù)據(jù)采用EXCEL2003建立數(shù)據(jù)表,導(dǎo)入SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,計數(shù)資料比較采用檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1cIP2A、β-catenin和C-myc在CML各期BMMNC的表達(dá) CIP2A陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀定位于細(xì)胞漿,C-myc陽性表達(dá)為棕黃色顆粒位于細(xì)胞核與細(xì)胞漿,CML-AP/BP組BMMNC中CIP2A和C-myc蛋白陽性表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05),CML-CP組和對照組無顯著性差異(P>0.05);β-catenin在CML-AP/BP組中呈強(qiáng)陽性表達(dá)于胞漿和胞核,在CML-CP組和對照組呈弱陽性表達(dá)于胞漿,β-catenin在CML-AP/BP組的表達(dá)顯著高于CML-CP組和對照組(P<0.05)。未緩解組CIP2A的表達(dá)顯著高于緩解組(P<0.05)。見表1。

表1 CIP2A、β-catenin和C-myc陽性表達(dá)的相關(guān)性

2.2CIP2A、β-catenin和C-myc在CML中表達(dá)的相關(guān)情況 經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，CIP2A、β-catenin和C-myc陽性表達(dá)率呈正相關(guān)。見表2。

表2 CIP2A、β-catenin和C-myc陽性表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

bcr-abl基因的產(chǎn)生是慢性粒細(xì)胞白血病的重要發(fā)生機(jī)制,基于此機(jī)制的靶向治療藥物酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)用使CML治療大為改觀,但是遠(yuǎn)期療效仍不容樂觀,一旦發(fā)生急性變,患者往往在數(shù)月之內(nèi)死亡,因此探討CML急性變的機(jī)制,可為尋求新的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

CIP2A(cancerous inhibitor of PP2A)是近年來識別的能夠抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性的蛋白,基因定位于人第3號染色體3q13,DNA長度約為38.8 kb,mRNA長為4284 bp,含有21個外顯子,蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為90 kDa[3]目前發(fā)現(xiàn)在人頭頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌(HNSCC)、結(jié)腸癌、胃癌和乳腺癌組織中高表達(dá),但在正常組織不表達(dá)或低表達(dá)[4,5],提示CIP2A可能是一種普遍存在的致癌因子。王涓冬等[6]在超過70%的初治/復(fù)發(fā)的急性髓系白血病(AML)患者骨髓單個核細(xì)胞中檢測到CIP2A的表達(dá)，健康志愿者和化療后完全緩解AML患者骨髓單個核細(xì)胞中弱表達(dá),而且在人類白血病細(xì)胞系HL60、THP-l、Jurkat T和K562中CIP2A也呈現(xiàn)高表達(dá),提示CIP2A是一種急性白血病相關(guān)的癌基因,參與了AML的發(fā)病過程。但是CIP2A在CML患者中的表達(dá)及意義,尚不明確,我們通過免疫組織化學(xué)法檢測CML患者骨髓單個核細(xì)胞中CIP2A,發(fā)現(xiàn)CIP2A在CML-AP/BP中高表達(dá),顯著高于CML-CP組和非惡性血液病組(P<0.05),CML-CP組和非惡性血液病組無顯著差別(P>0.05),提示CIP2A可能在CML急性變中發(fā)揮了重要作用。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種多功能蛋白質(zhì),一方面參與細(xì)胞間的黏附[7],另一方面作為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵的信號分子,參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo),在細(xì)胞增生、組織修復(fù)、胚胎發(fā)育及癌癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[8]。李增軍[9]等進(jìn)一步從mRNA水平證實β-catenin在CML急變期轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而且與表達(dá)升高的bcr-abl成正相關(guān)。C-myc是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的一個靶癌基,Giles[10]等證實C-myc在多種腫瘤中過表達(dá),在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用,β-catenin可通過Tel-4連接C-myc啟動子位點(diǎn)來激活其表達(dá),Sawyers CL發(fā)現(xiàn)C-myc在慢粒中存在高表達(dá)[11],Weissman等[12]進(jìn)一步證實Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在慢性粒細(xì)胞自血病(CML)急變和加速期以及對Imatinib耐藥的CML患者中激活。其異常激活后,導(dǎo)致CML祖細(xì)胞的持續(xù)擴(kuò)增,在CML由慢性期進(jìn)入加速及急變期的過程中起重要作用。本研究顯示β-catenin和C-myc在CML-AP/BP組高表達(dá)而且成正相關(guān)(P<0.05),進(jìn)一步證實Wnt途徑在CML急變期被激活。Junttila[13]等發(fā)現(xiàn)CIP2A能夠抑制PP2A對癌蛋白C-myc第62位絲氨酸(S62)的脫磷酸化作用,抑制C-myc蛋白水解,使C-myc水平升高,從而促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的進(jìn)展;Perrotti D[14]等發(fā)現(xiàn)CML急變期的患者中PP2A的活性顯著受抑,本研究發(fā)現(xiàn)CML急變期高表達(dá)的CIP2A和C-myc成正相關(guān)(P<0.05)，這提示二者在CML急變中起協(xié)同作用，高表達(dá)的CIP2A可能通過抑制PP2A的活性,使C-myc去磷酸化受阻,進(jìn)而抑制C-myc降解而升高,導(dǎo)致CML的急變,CIP2A可能通過Wnt途徑參與CML的急變。

在一些實體腫瘤中,CIP2A蛋白的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)[4,5]。Khanna等[15]報道CIP2A在胃癌組織的過度表達(dá)與胃癌總體生存率降低相關(guān),提示CIP2A可能是一個的獨(dú)立預(yù)后因素。CML急變患者預(yù)后差,生存期短,本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin和C-myc在未緩解組的表達(dá)雖然高于緩解組，但無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能和病例較少有關(guān)。而CIP2A在未緩解組的表達(dá)則顯著高于緩解組(P<0.05),這提示CIP2A的高表達(dá)不但參與了CML的急變,而且使得CML急變細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降,因此CIP2A高表達(dá)可能提示CML預(yù)后不良,針對CIP2A的靶向治療可能為CML的治療提供新的途徑。

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473000 南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院血液科