許正宏，吳 燕，李 會，李 恒，史勁松

(江南大學 醫(yī)藥學院，無錫 214122)

甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，具有很強的抗過敏、抗感染、抗病毒等藥理活性，已被廣泛應用于治療內(nèi)分泌失調、心血管、膠原性病癥、淋巴白血病、人體器官移植、抗腫瘤、細菌性腦炎、皮膚病、風濕病、老年性疾病等［1－2］。甾體生物轉化即利用微生物酶對甾體底物的某一部位進行特定的化學反應來獲得一定的產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的化學合成法相比，甾體生物轉化具有反應條件溫和、環(huán)境友好、高效性和高選擇性等優(yōu)勢，還能合成化學合成法所不能合成的一些甾體中間體。近些年來，微生物轉化工藝在甾體藥物合成路線中的比例迅速增加，形成了一條生物 化學法耦聯(lián)的甾體藥物合成新工藝。最為成功的案例是利用黑根霉Rhizopus nigricans在孕甾酮的C11α引入羥基，解決了皮質激素合成中的關鍵問題，產(chǎn)品收率大幅度提高，專一性增強，效果遠超化學合成法的合成效果，開創(chuàng)了微生物轉化甾體化合物的先例［3］。

目前，甾體藥物的合成主要集中在以具有甾體母核結構的天然產(chǎn)物為原料、采用化學法和微生物轉化法相結合的方式來合成甾體類藥物。綜合國內(nèi)外研究，生物轉化技術在甾體藥物生產(chǎn)中的應用主要分為兩大類:①將天然原料轉化為生產(chǎn)甾體化合物的普通中間體，如利用生物轉化降解植物甾醇(豆甾醇、谷甾醇、麥角固醇)邊鏈生成有用的甾體醫(yī)藥中間體，主要為雄甾-4 -烯，3，17-二酮(AD)及雄甾 -1，4 -二烯，3，17 -二酮(ADD);②對甾體藥物的特定位點進行修飾，生成具有生物活性但化學合成法難以合成的化合物，如 9α、11α、11β、7α、15α等位點的羥化，Δ1脫氫及A環(huán)的芳香化等［4］。甾體生物轉化反應的多樣性，不僅解決了化學合成法步驟多、效率低、成本高和污染大的缺點，而且為甾體藥物的合成提供了更多的途徑。因此，生物轉化技術作為甾體藥物合成工藝中的補充替代途徑，將成為甾體醫(yī)藥工業(yè)的關鍵生產(chǎn)技術。

然而，在甾體類化合物的生物轉化過程中，由于甾體底物溶解性差、培養(yǎng)基傳質效率低、底物產(chǎn)物的反饋抑制和全細胞生物催化副產(chǎn)物多等原因，菌株的轉化能力和甾體的轉化效率仍然偏低，是甾體生物轉化技術實現(xiàn)工業(yè)化的主要瓶頸。筆者精選了近些年生物轉化法在合成甾體藥物領域的突出成果，從半合成原料、菌種選育及改良、生物轉化新工藝及新技術等方面進行綜述。

1 半合成原料

中國是甾體激素要素原料及其制劑的主要生產(chǎn)國，原料藥年產(chǎn)值近100億元，其中70%出口，且皮質激素類原料的生產(chǎn)規(guī)模已居世界之首。但我國并非甾體激素藥物產(chǎn)業(yè)的強國，目前主要依賴于單一植源性薯蕷皂素、劍麻皂素及西南山地高原野生的蕃麻皂素為半合成原料，生產(chǎn)以皮質激素為代表的低檔次初級產(chǎn)品。國際市場一方面大量吸收我國的低端產(chǎn)品，如氫化可的松、潑尼松等;一方面又利用其技術優(yōu)勢將其高端產(chǎn)品傾銷給我國。薯蕷皂素的日漸枯竭造成原料成本價格上升，同時合成的低端產(chǎn)品又缺乏國際競爭力，這給我國甾體藥物產(chǎn)業(yè)帶來了嚴重的危機。因此，需要積極努力開發(fā)新型甾體原料資源，研究收率高、成本低、環(huán)境污染小的綠色工藝，迎頭趕上世界先進水平，成為甾體激素藥物產(chǎn)業(yè)的強國。

植物甾醇，包括β -谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇等，主要來自于豆類植物或煉油下腳料，具有甾體化合物的母核結構，將其“變廢為寶”能有效解決水解黃姜所帶來的環(huán)境污染問題。其中，β-谷甾醇、油菜甾醇或其19-羥化的衍生物是目前比較常用的植物甾醇，經(jīng) Mycobacterium sp.、Rhodococcus sp.和Fusarium sp.等菌屬切除邊鏈后可一步生成 AD、ADD或9α-OH -AD這3類甾體藥物中間體［5-7］。AD和ADD是最具有市場價值的甾體藥物中間體，對其活性部位進行結構改造，可用于合成多種皮質類固醇，如鹽皮質甾醇、口服避孕藥等其他甾體藥物。2011年，全球AD/ADD的年銷售總額高達10億美元，而且呈逐年遞增的趨勢。植物甾醇是天然無毒的活性物質，原料來源廣泛，價格低廉，其側鏈用化學手段難以降解，長期以來被當做廢物處理，微生物選擇性降解邊鏈技術使得植物甾醇被有效利用，成為薯蕷皂素的替補資源。

膽固醇是近些年另外一種比較受關注的甾體藥物新資源，主要是從豬、牛、魚等動物的脂肪和油中提取所得。關于微生物降解甾醇邊鏈合成重要的甾體激素藥物已總結于圖1中。膽固醇的邊鏈降解與植物甾醇類似，在C17位斷裂氧化形成17 -甾酮［8］。該化合物是合成性激素、糖皮質激素、利尿劑等的關鍵中間體，年生產(chǎn)量超過1000 t，其中60%都是由生物轉化技術生產(chǎn)。在所有的天然甾醇中，β-谷甾醇和膽固醇是最適合生產(chǎn)17-甾酮產(chǎn)品的，但膽固醇比β-谷甾醇的生物利用程度低，因此由膽固醇生產(chǎn)17 -甾酮的成本較高。

其他甾醇原料，如存在于酵母及真菌中的麥角甾醇，又稱麥角固醇，是一種重要的醫(yī)藥化工原料，可用于氫化可的松、黃體酮等藥物的生產(chǎn)［9］。羊毛固醇及其衍生物經(jīng)分枝桿菌 Mycobacterium sp.NRRL B -3805降解邊鏈、脫氫作用后均能形成甾體藥物的前體化合物。甾體藥物原料雖然來源廣泛，但是基本上都在C17位上有一個側鏈，需要復雜的邊鏈降解反應才能形成藥物中間體，因此尋找新型、有效的甾體藥物前體原料仍是未來甾體生物轉化方向的熱點之一。

2 轉化菌種選育及改良

生物催化劑的種類不夠多、適用的反應類型有限是當前限制甾體生物催化發(fā)展的因素之一，因此需要大規(guī)模從自然界篩選特定功能的催化劑，或對原有的催化劑進行改造。目前在高產(chǎn)菌株的選育中，誘變育種仍然是普遍應用并十分有效的方法，但由于甾體類微生物的轉化菌株大多數(shù)為放線菌、霉菌等，相對細菌來講，這類菌株細胞結構的復雜性和特殊性導致采用菌絲體的誘變方法很難達到預定的誘變效果。因此，在了解菌株細胞結構特征的基礎上，采用單孢子或原生質體誘變并結合特定的篩選方法和適當?shù)膲毫l件進行多輪多次突變選擇效果較好。此外，隨著基因工程技術的日益完備，采用分子生物學手段對菌種的分子改造也成為比較有效且常用的方法之一。

圖1 甾醇邊鏈的降解Fig.1 Microbial degradation of sterol side-chains

2.1 原生質體抗藥性篩選方法

由于化學或物理誘變方法所產(chǎn)生的突變是隨機的，突變無方向性，導致目標菌株篩選工作量大，直接影響了誘變育種的工作效率。細胞色素P450為甾體的微生物羥化反應中起催化作用的酶。而酮康唑等唑類化合物可以通過未共享電子對與P450的血紅素鐵形成p π -dπ作用鍵，或將P450保守的半胱氨酸上的巰基(SH)電子密度推向血紅素鐵，成為血紅素優(yōu)良的配體，從而與P450競爭分子氧或底物，抑制P450活性［10］。因此，可以利用真菌對唑類藥物產(chǎn)生的抗藥性機制，對真菌類菌株進行抗藥性篩選。天津科技大學王敏課題組應用酮康挫抗性篩選法，采用紫外線誘變處理的甾體11β -羥基化菌株——新月彎孢霉的原生質體(有完整核型)，獲得了氫化可的松轉化率為出發(fā)菌株1.42倍的遺傳穩(wěn)定突變株［11］。借助絲狀真菌的原生質體，結合傳統(tǒng)的理化誘變/抗性篩選，再生具有完成核型的細胞克隆，分離選育具有甾體11β -羥基化能力的穩(wěn)定型菌株可行且有效，該菌種選育方法可對選育其他細胞色素P450催化的羥基化菌株提供借鑒。

2.2 多代壓力組合突變法

Donova等［12］報道了由谷甾醇產(chǎn)生9α-OHAD分枝桿菌突變菌株篩選的研究。應用谷甾醇的選擇壓力，結合傳統(tǒng)誘變作用，獲得能夠轉化谷甾醇為9α-OH -AD的菌株，而野生分枝桿菌只能將谷甾醇轉化為AD。采用多代壓力組合突變法的具體流程:①菌種的馴化誘變，在選擇性底物谷甾醇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)10次，獲取得到能輕微產(chǎn)生9α-OH -AD的菌株，采用紫外(UV)輻射方法篩選突變菌株，得到既能夠切除谷甾醇邊鏈、又能向9α位引入羥基的菌株。繼而與底物谷甾醇保溫培養(yǎng)。經(jīng)多批馴化，轉化效率由首批的2.7%提高到59.6%的產(chǎn)物積累濃度;②繼續(xù)采用谷甾醇選擇壓力，并結合傳統(tǒng)的化學誘變劑-甲基磺酸乙酯(EMS)和絲裂霉素C進行UV輻照處理。經(jīng)由多代的谷甾醇壓力組合突變選擇，是獲得9α-OH -AD菌株的一種有效方法。

2.3 菌株的分子改造

針對在甾體生物轉化過程中，會產(chǎn)生產(chǎn)物進一步降解及其他副產(chǎn)物的問題，可采用將引起副產(chǎn)物的關鍵酶基因敲除的方法。例如Brzostek等［13］在研究Mycobacterium降解植物甾醇時，敲除羥化酶基因后能部分抑制母核的降解，這可能是因為9α -羥化酶具有同工酶，或者編碼9α -羥化酶的是一個基因簇，9α羥化是酶共同作用的結果。

為了提高甾體羥基化反應的效率，研究者們將甾體P450酶在工程菌種中進行異源表達。例如，將能夠催化甾體17α -羥化和C17，20 -裂解酶反應的全功能人的P45017α(CYP17)在畢赤酵母GS115中表達，表達的酶能夠催化黃體酮生成17α -羥基孕酮和16 -羥基孕酮［14］。羥化反應的效率也可以通過輔酶與P450氧化酶共表達來實現(xiàn)。Pertric等［15］將來源于米根霉Rhizopus oryzae的11α -羥化酶(CYP509C12)與依賴于NAD(P)H的P450還原酶在分泌型表達的酵母宿主中共表達，與僅表達11α -羥化酶(CYP509C12)相比，11α羥化反應的速率提高了7倍。

另外，將合成生物學的概念應用于甾體生物轉化，將合成甾體化合物的整個代謝途徑打通，實現(xiàn)單一微生物的多步轉化。一個最為典型的例子是將13個不同來源的基因在釀酒酵母中異源表達，通過對兩條線粒體系統(tǒng)的調控和3個編碼的非目的反應基因的敲除，使得原本僅產(chǎn)生麥角甾醇的酵母菌能在利用糖和醇的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生氫化可的松［16］。該工作證明了由高級真核微生物的復雜代謝途徑轉移到低等微生物中的可行性。但重組菌種以20 g/L葡萄糖轉化時，最高獲得氫化可的松的質量濃度僅為(11.5±0.3)mg/L，轉化效率較低。

3 甾體生物轉化新工藝與新技術

近些年來，雖然在選育甾體有效生物催化劑上取得了一定成效，但甾體的低水溶性(10－6～10－5mol/L)仍是生物轉化過程的主要限制因素。由于甾體疏水性強，甾體轉化酶為胞內(nèi)酶，導致底物與全細胞催化劑接觸不充分，造成底物的利用率不高，轉化時間延長。因此，提高底物在轉化體系中的有效反應濃度、加速底物與產(chǎn)物進出胞內(nèi)外的過程是開發(fā)新型轉化工藝以提高甾體轉化率的核心。目前，針對上述問題，國內(nèi)外的研究主要集中于三大方向:提高底物溶解性、建立新型轉化體系、改善細胞通透性。

3.1 物理、化學助溶法

甾體化合物是脂溶性化合物，在水中溶解度低，故反應過程中以液態(tài)形式存在的底物有效濃度偏低，使得反應過程不能有效進行。因此，采用合適的手段改善底物在反應過程中的有效濃度，能提高底物的轉化率和縮短轉化周期。

3.1.1 底物微粉化

通過物理(如超聲波)或機械(如研磨)的方法處理底物使其成為納米或微米級的微粒，提高底物在水中的分散度和溶解速率，從而增加底物分子與酶的接觸機會，反應持續(xù)向產(chǎn)物方向移動。比較成功的例子是工業(yè)上用氣流粉碎的方法粉碎醋酸可的松，加入少量乙醇助溶后直接投料，在底物投料質量分數(shù)為7%的條件下可將底物轉化率提高到90%。

有機溶劑或表面活性劑預溶底物，即先將底物用乙醇、丙酮、N，N -二甲基甲酰胺等有機試劑或表面活性劑Tween -80、Tween -20預溶，然后再以液體的形式加入到發(fā)酵液中進行轉化，這是目前比較常用的提高底物溶解度的方法。徐詩偉等［17］研究地塞美松(dexamethasone)中間體的C1，4 -脫氫和11α -羥基化時，采用體積分數(shù)為2% ～4%的N，N -二甲基甲酰胺預溶解底物后進行投料，使產(chǎn)物轉化率提高約40%。添加有機溶劑在某些轉化反應中還能抑制副產(chǎn)物生成，Angelova等［18］在研究有機溶劑對紅球菌(Rhodococcus sp.)羥化AD的影響時，發(fā)現(xiàn)轉化體系中添加鄰苯二甲酸酯可以顯著抑制AD母核C1，2位的脫氫反應，同時將9α -羥化產(chǎn)物的產(chǎn)量提高到60%。有機試劑能在一定程度上改變底物的溶解度，但對菌體有一定的毒害作用，在特定的生物轉化反應過程中，要根據(jù)底物特性和菌體的有機溶劑耐受性，通過實驗摸索選擇合適的有機試劑和相應的濃度。

3.1.2 環(huán)糊精包合法

環(huán)糊精及其衍生物(如甲基-β -環(huán)糊精，羥丙基-β -環(huán)糊精)能形成疏水性空腔，通過氫鍵、分子間作用力、范德華力等可以與甾體類疏水性強的客體分子相互作用而形成包合物。Lu等［19］將環(huán)糊精用于Arthrobacter simplex TCCC 11037轉化醋酸可的松(CA)為醋酸強的松(PA)的脫氫反應，發(fā)現(xiàn)添加環(huán)糊精可將底物、產(chǎn)物的溶解度分別提高36.7倍和19.8倍，同時解決了底物溶解度差和產(chǎn)物的反饋抑制問題，從而提高甾體化合物的利用效率。Donova等［20］研究了甲基-β -環(huán)糊精(M-β -CD)對AD/ADD的產(chǎn)量、細胞的生長以及細胞膜組成和超微結構的影響，發(fā)現(xiàn)在轉化培養(yǎng)基中添加M-β -CD后能使AD/ADD的產(chǎn)量提高1.6倍。因此，根據(jù)甾體化合物的結構特性，合成新型的環(huán)糊精衍生物，同時全面分析甾體底物與環(huán)糊精的分子識別機制，將有利于進一步挖掘環(huán)糊精在微生物轉化甾體領域的潛能。

單一使用某種有機試劑、表面活性劑或環(huán)糊精的效果有限，在實驗過程中，可以根據(jù)各自的優(yōu)缺點設計“復合配方”，在不影響菌體生長的前體下，到達高底物投料濃度、高轉化率、高產(chǎn)物得率的目的。

3.2 建立新型轉化體系

生物轉化過程可以分為底物分子向胞內(nèi)的運轉、酶促反應和產(chǎn)物分子向胞外分泌3個過程。其中，酶促反應速率主要是由生物酶固有的活性所決定，而底物和產(chǎn)物分子的傳遞速率是可以通過外界條件來控制的。目前，大部分的研究主要致力于尋找新型轉化體系，以提高甾體的轉化效率，筆者列舉了近年來一些新型的轉化體系，并比較各種轉化體系的優(yōu)缺點，總結歸納于表1。

表1 不同甾體微生物轉化體系的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and drawbacks of various biotransformation systems

雙液相轉化體系和雙水相轉化體系根據(jù)底物和產(chǎn)物在兩相中分配系數(shù)的不同，能較好解決底物、產(chǎn)物水溶性差的問題，而且能隨底物的特性改變兩相的組分，體系易制備且靈活性較大，故是目前工業(yè)上應用得比較多的轉化工藝。為解除有機試劑對細胞呼吸鏈的損害，保證細胞的活性，可以將固定化技術與兩相催化技術耦合，通過固定化對生物酶形成保護層，互補缺點，實現(xiàn)生物轉化“高速、高效”相統(tǒng)一的方法。

隨著人們對轉化體系研究的不斷深入，新興的濁點系統(tǒng)、離子液體開始受到廣泛的關注。底物在濁點系統(tǒng)的兩相中是不均勻分配的，因此能控制底物的擴散速率，保證轉化過程中底物始終處于最適濃度，既能解除底物的抑制效應又能提高傳質速率，還能原位萃取產(chǎn)物而避免產(chǎn)物的反饋抑制。Wang 等［21］建立了Triton X -100和Triton X -114形成的濁點系統(tǒng)，并將其應用于Mycobacterium sp.降解膽固醇的邊鏈，AD和ADD的產(chǎn)量得到大幅度提高。

另外一種新型轉化系統(tǒng)——離子液體，是完全由離子組成的液體，在低溫(＜100℃)下呈液態(tài)的鹽，也稱為低溫熔融鹽，它一般由有機陽離子和無機陰離子所組成。最初的離子液體主要用于電化學研究，近年來離子液體作為綠色溶劑在有機及高分子合成領域受到重視。Wu等［22］研究了離子液體對黑根霉(Rhizopus nigricans)11α -羥化 16α，17α-環(huán)氧黃體酮的影響，發(fā)現(xiàn)［BMIm］［PF6］-水組成的兩相體系能在底物濃度為18 g/L的條件下將底物轉化率提高到90%以上，且轉化體系連續(xù)利用3個批次后，總轉化率仍能達到87%。由于離子液體具有高效、無毒、無污染、回收方便和可重復使用等優(yōu)勢，為全細胞生物催化的大規(guī)模應用奠定了基礎。

3.3 細胞通透性改良法

甾體轉化酶屬于胞內(nèi)酶，甾體分子必須跨過壁膜與酶接觸才可參加反應，所以細胞的通透性直接影響甾體化合物的轉化。早在1982年，Jawofski等［23］在去氫可的松的 11β -羥化中添加適量的稀KOH溶液、蝸牛酶、乙二胺四乙酸(EDTA)處理真菌Anninghamella屬孢子，發(fā)現(xiàn)其外形變得膨大，膜上有微孔出現(xiàn)，羥化產(chǎn)量可以提高2～4倍。利用Mycobacterium sp.降解谷甾醇邊鏈時，在其培養(yǎng)基中加入微量青霉素、多粘菌素、桿菌肽和乙胺丁醇等抗生素，可以抑制細胞壁肽聚糖的合成，提高細胞通透性，在一定程度上提高轉化產(chǎn)物 AD的產(chǎn)量［24］。隨后，利用透射電鏡觀察了添加桿菌肽和不添加桿菌肽處理的細胞，發(fā)現(xiàn)添加桿菌肽后細胞結構出現(xiàn)畸形，推測這種畸形有利于改善細胞壁的通透性和減少底物的跨膜阻力，最終達到提高轉化效率的目的。

此外，在菌體培養(yǎng)的過程中加入卵磷脂、魚精蛋白、聚乙烯亞胺、m -氯苯丙氨酸等試劑也能在一定程度上影響細胞壁的合成或改變細胞壁組成成分，提高甾體的轉化率和產(chǎn)物得率。添加細胞壁干預劑來提高細胞膜的通透性，在提高單位菌體量的比酶活上有一定程度的優(yōu)勢，但是對菌體生物量會造成一定的負影響。

制備原生質體用于甾體轉化是另一種有效解除細胞壁阻礙作用的方法。王敏等［25］利用新月彎孢霉原生質體對氫化可的松進行11β -羥化，實驗結果表明:采用溶壁酶(2.5 mg/mL)和纖維素酶(5 mg/mL)的混合酶液溶解藍色犁頭霉可形成大量原生質體，且其11β-羥化酶活性明顯高于完整菌絲體，在底物濃度相等的情況下可將轉化周期由48 h縮短至36 h。原生質體轉化技術雖然有效改善了底物的傳質阻力，但存在穩(wěn)定性差、再生迅速等問題，嚴重限制了其在工業(yè)上的應用。

4 結語

近年來，生物轉化技術顯示出化學合成技術所無法取代的優(yōu)勢，吸引了大批國內(nèi)外研究者對甾體生物轉化技術進行研究和改進。雖然在菌種的選育及改良、提高底物溶解性、建立新型轉化體系等方面取得了顯著的成果，但是大多數(shù)菌株的生產(chǎn)力仍未達到工業(yè)化水平，造成基礎研究與產(chǎn)業(yè)化相脫節(jié)。甾體生物轉化的研究依然任重道遠，需要新思路、新思維、新方法進行更深入、更全面的研究，最終達到降低生產(chǎn)成本、提高轉化效率、減少有毒有害試劑使用的目的。

生物轉化技術在甾體藥物合成領域的趨勢主要集中在以下幾個方面:①菌株方面，利用高通量篩選技術尋找新型高效優(yōu)良的轉化菌株，其中海洋微生物具有很大的潛力;利用組合誘變技術對已有菌株進行改良，提高底物轉化率和底物廣譜性。②尋找新型甾體藥物原材料，如從種類繁多的海洋生物中獲得多種多樣結構獨特的新甾體化合物;采用不同菌株對多種甾體化合物進行轉化，以期獲得新的甾體衍生物，增加甾體藥物前體的品種，為甾體藥物的合成提供新途徑。③轉化新工藝的研究，將固定化技術、混合培養(yǎng)技術、兩相催化技術或幾種技術的耦合應用于甾體轉化過程，以提高轉化效率和降低生產(chǎn)成本，提高甾體轉化的水平和競爭力。④將基因工程成熟的技術手段應用甾體微生物轉化，如采用基因工程技術敲除某些旁路酶基因，切斷副產(chǎn)物的形成途徑;通過分子生物學手段，獲得某個或某些關鍵酶的基因并在合適的宿主中表達，得到大量的重組蛋白后對酶結構進行解析，再通過理性的定點突變技術或非理性定向進化技術從基因水平上改造酶的特異性、穩(wěn)定性、高效性。

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