農(nóng)曉琳，陳 洪，李佳荃，陳石海，鄧 凌，唐黎黎，李菊裳

1廣西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔頜面外科;2廣西大學醫(yī)學科學實驗中心;3廣西大學第一臨床醫(yī)學院整形美容科;4廣西大學第一臨床醫(yī)學院皮膚性病科，南寧 530021

人皮膚瘢痕的形成主要是由于成纖維細胞的過度增殖。因此，抑制皮膚瘢痕成纖維細胞的生物學行為是防治瘢痕形成的關鍵，但目前對于皮膚瘢痕的藥物治療大多僅限于基礎研究，未能廣泛應用于臨床。水蛭素(Hirudin)是凝血酶的特異性抑制劑，有研究發(fā)現(xiàn)水蛭素可以抑制細胞的增殖［1］。本實驗通過對人皮膚成纖維細胞的體外培養(yǎng)和兔耳增生性瘢痕模型的建立，觀察水蛭素對人皮膚瘢痕成纖維細胞增殖的影響以及自制的水蛭素膏劑對兔耳瘢痕的抑制作用，為臨床應用水蛭素治療皮膚瘢痕提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜DMSO(美國Sigma公司);細胞凋亡原位檢測試劑盒(美國Roche Diagnostics);白凡士林、單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉、甘油均購自南寧拜爾公司;十八醇、對羥基苯甲酸乙酯(廣西西隴化工有限公司);天然水蛭素由廣西醫(yī)科大學藥學院提供;

1.2 儀器與設備

ELX-800型酶標儀(美國寶特公司);病理圖象分析儀(型號:DMR+Q550，德國)。

1.3 細胞來源

瘢痕組織標本供體均來自廣西醫(yī)科大學整形外科的患者，納入標準為近期未使用瘢痕抑制藥物，不伴有其他系統(tǒng)性疾病，取材前均經(jīng)患者知情同意。前后共培養(yǎng)6例瘢痕患者的皮膚成纖維細胞，其中男3例，女3例，瘢痕增生時間在1～3年左右。

1.4 方法

1.4.1 人皮膚瘢痕成纖維細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

在無菌條件下采集手術切除的皮膚瘢痕組織后立即放入含500 U/mL青霉素和500 mg/L鏈霉素的培養(yǎng)基中。無菌條件下用手術刀片和剪刀去除表皮和基底層，用D’hanks液將標本反復洗滌。將清洗干凈的皮膚瘢痕組織剪成3×3×2 mm大小的組織塊。將組織塊移入50 mL培養(yǎng)瓶中，均勻地貼在瓶壁上，間距約1 cm。瓶內加入含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1.5 mL，密閉瓶口。2 d以后再補加3～5 mL培養(yǎng)液，此后3～4 d更換一次培養(yǎng)液。待成纖維細胞長滿瓶底時以0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。通過傳代去除非成纖維細胞成分，獲得人皮膚瘢痕成纖維細胞。本實驗取第3～4代的成纖維細胞用于試驗。抗波形蛋白抗體免疫細胞化學SP法檢測培養(yǎng)獲得的細胞。

1.4.2 水蛭素對成纖維細胞的作用

1.4.2.1 MTT法測定水蛭素對人皮膚瘢痕成纖維細胞的增殖影響作用

取對數(shù)生長期的人皮膚瘢痕成纖維細胞3～4代，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，調為0.5×105/mL，分別接種于96孔塑料培養(yǎng)板，密度為0.5×104個/孔，每孔加入100 μL的細胞懸液和100 μL的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后吸棄原培養(yǎng)液，實驗分組:1、水蛭素組:加入已經(jīng)配置的含水蛭素濃度為 5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 U/mL的培養(yǎng)基200 μL;2、對照組:每孔只加200 μL 的培養(yǎng)基。每孔設3個復孔。于37℃，5%CO2飽合濕度繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入200 μL DMSO，振蕩，待結晶顆粒溶解后，采用酶標儀于490 nm波長下測定吸光度(A)值。記錄結果，采用概率單位法(Probit)計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。計算藥物對皮膚瘢痕成纖維細胞的抑制率。生長抑制率 =(1-A用藥組/A對照組)×100%。

1.4.2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡和凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)的計算

將對數(shù)生長期的成纖維細胞3～5代用0.25%的胰酶消化后，接種在6孔板上，每孔5×104個細胞，常規(guī)培養(yǎng)1 d，待細胞貼壁生長后用水蛭素IC50的濃度作用于成纖維細胞。繼續(xù)培養(yǎng)1d后將培養(yǎng)基吸出后放入離心管，然后用0.25%胰酶將貼壁的細胞消化后放入同一離心管，1000 rpm離心，5 min收集細胞，0.1%多聚賴氨酸處理玻片后，細胞涂片，室溫下自然晾干。晾干后用PBS沖洗2次，40 g/L多聚甲醛室溫下固定10 min，PBS沖洗。加入用Tris緩沖鹽溶液(TBS)新鮮稀釋的蛋白酶K(比例為1∶100)，37℃下作用10 min。蒸餾水洗滌，加入含末端脫氧核苷酸轉移酶TdT和地高辛標記的脫氧尿苷5-三磷酸(dUTP)標記緩沖液20 μL，37℃下放置2 h。TBS洗滌，加入封閉液50 μL室溫放置30 min，甩干;加 Anti-DIG-Biotin。加 SABC后，采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色20 min，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，TBS洗滌、脫水、封固。將切片置于200倍光學顯微鏡下觀察，細胞核中有棕色顆粒者為凋亡細胞。用病理圖像分析儀在凋亡細胞密集區(qū)于400倍鏡下連續(xù)計數(shù)5個視野的凋亡細胞及細胞總數(shù)，計算平均陽性細胞率即凋亡指數(shù)AI。

1.4.3 水蛭素瘢痕膏劑對兔耳瘢痕的作用

1.4.3.1 兔耳瘢痕動物模型的建立

用3只大耳新西蘭白兔，在兔耳雙側腹側分別做相同的6個直徑為1 cm的圓形切口，共作創(chuàng)面36個，完整切除全層皮膚，直至軟骨膜。

1.4.3.2 膏劑的制備

基質對照組膏劑的制備:油液:取白凡士林2.4 g、十八醇1.6 g和單硬脂酸甘油酯0.4 g置于蒸發(fā)皿中，水浴加熱至70～80℃使其熔化，水液:將十二烷基硫酸鈉0.2 g、甘油1.4 g、對羥基苯甲酸乙酯0.04 g和計算量的蒸餾水置另一蒸發(fā)皿中加熱至70～80℃使其溶解，在同溫下將水液以細流加到油液中，邊加邊攪拌至冷凝，即得乳劑型基質，制備基質20 g為對照組膏劑;水蛭素組膏劑的制備:制備膏劑20 g，濃度為7.5%。

1.4.3.3 組別及處理

動物隨機平均分為3組，每組12個瘢痕，于術后28 d(創(chuàng)面均已上皮化)，開始對實驗組外涂膏劑，每日3次，A組為水蛭素組，B組為單純基質對照組，C組為不加處理的空白對照組。

1.4.3.4 標本取材及處理

術后56 d，處死動物后切取兔耳瘢痕標本，令標本周邊帶有少許正常組織。所有取材的標本經(jīng)瘢痕凸起最高點沿瘢痕最大徑方向，將瘢痕分切為2部分，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制取最大斷面切片，行HE染色及VG染色。

1.4.3.5 觀察指標

①大體觀察;②光鏡下觀察;③瘢痕增生指數(shù)(Hypertrophic Index，HI):HE染色切片于低倍鏡下用顯微測量標尺測量，按公式HI=A/B(見圖1)計算瘢痕增生指數(shù);④成纖維細胞數(shù)密度(Numerical density on area，NA):400倍光鏡下觀察瘢痕HE染色切片，在瘢痕中央淺部、中央深部、兩側部各隨機選取5個矩形視野(0.00505 mm2)，目測計數(shù)并計算切片內單位面積成纖維細胞數(shù)量，結果取均數(shù);⑤膠原纖維的面密度(Area density on area，AA):VG染色組織切片，在瘢痕中央淺部、中央深部、兩側部各隨機選取5視野，利用計算機輔助病理圖象分析系統(tǒng)計算紅染之膠原纖維的面密度，結果取均數(shù)。

圖1 瘢痕增生指數(shù)HI計算示意圖Fig.1 Illustration plot for the calculation of hypertrophic index

1.4.3.6 統(tǒng)計學處理

利用SPSS10.0軟件，計量資料采用單因素方差分析和t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗。

2 結果與討論

2.1 人皮膚瘢痕成纖維細胞的體外原代培養(yǎng)及鑒定

7～12 d可見組織塊周邊細小芽狀貼壁細胞爬出，放射狀生長，傳代后細胞生長旺盛。光鏡下細胞胞體狹長、透亮，胞膜清晰，呈典型的梭形和不規(guī)則三角形，圖2-a;HE染色見成纖維細胞胞漿豐富，色淡紫，胞核大，色藍，位于細胞中央，圖2-b。免疫組化染色抗波形蛋白抗體染色陽性，細胞漿棕色顆粒樣著色，提示所得細胞為間葉組織來源，符合成纖維細胞特性。

圖2 人皮膚瘢痕成纖維細胞的培養(yǎng)與鑒定Fig.2 Cultivation and identification of skin scar derive fibroblasts

2.2 水蛭素對成纖維細胞的影響

2.2.1 MTT法檢測的結果

水蛭素濃度為0.078～5 U/mL時與空白對照組比較對細胞有明顯抑制作用(P＜0.01)(表1)，且呈濃度依賴性，水蛭素的濃度越高，對成纖維細胞的抑制率越高，圖3。水蛭素對成纖維細胞生長抑制的IC50=0.9 U/mL。

表1 水蛭素對成纖維細胞增殖的影響(±s)Table 1 Effect of hirudin on fibroblast proliferation(±s)

表1 水蛭素對成纖維細胞增殖的影響(±s)Table 1 Effect of hirudin on fibroblast proliferation(±s)

注:水蛭素各組與空白對照組A值相比較，＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜ 0.01.

組別(濃度)Grouping and concentration吸光度值Absorbance抑制率(%)Inhibition rate(%)空白對照組Contral group 0.173±0.0012 -水蛭素組1 Hirudin group 1(0.078U/mL) 0.135±0.0040＊＊ 22.1±2.4水蛭素組2 Hirudin group 2(0.156U/mL) 0.134±0.0072＊＊ 22.7±4水蛭素組3 Hirudin group 3(0.313U/mL) 0.117±0.0053＊＊ 32.5±3.3水蛭素組4 Hirudin group 4(0.625U/mL) 0.101±0.0062＊＊ 41.3±3.6水蛭素組5 Hirudin group 5(1.25U/mL) 0.077±0.0046＊＊ 55.6±2.9水蛭素組6 Hirudin group 6(2.5U/mL) 0.066±0.0036＊＊ 61.9±2.3水蛭素組7 Hirudin group 7(5U/mL) 0.041±0.0026＊＊76.3±1.4

圖3 水蛭素對瘢痕成纖維細胞增殖的影響Fig.3 Effect of hirudin on the proliferation of scar derive fibroblasts

2.2 TUNEL法檢測水蛭素誘導成纖維細胞凋亡的結果

水蛭素實驗組，IC50=0.9 U/mL培養(yǎng)的成纖維細胞體積縮小、胞質少、密度變小，凋亡細胞多、呈棕黃色。而空白對照組的成纖維細胞體積大、胞質豐富、密度大，圖4。水蛭素實驗組培養(yǎng)的細胞AI值高于空白對照組(P＜0.01)，見表2。

Fig.4 Detection of fibroblasts apoptosis induced by hirudin with TUNEL assay(400×)圖4 TUNEL法檢測水蛭素誘導成纖維細胞凋亡(400×)

表2 TUNEL法檢測水蛭素對成纖維細胞的凋亡誘導作用Table 2 Apoptosis of fibroblasts after hirudin treatment(TUNEL assay)

2.3 水蛭素瘢痕膏對兔耳瘢痕作用的結果

2.3.1 大體觀察

單純基質對照組、空白對照組的瘢痕凸出皮緣，色紅，水蛭素組較單純基質對照組和空白對照組的瘢痕平坦、柔軟，如圖5-1。

2.3.2 光鏡下觀察

HE和VG染色切片:3組瘢痕均厚于周邊正常皮膚，水蛭素組的瘢痕小于對照組。對照組的瘢痕較凸，水蛭素組的瘢痕較對照組的平坦、成纖維細胞較少，胞體減小，膠原纖維較稀疏，排列整齊。對照組的瘢痕膠原纖維紅染，排列紊亂(圖5)。

2.3.3 增生指數(shù)HI

水蛭素組分別與單純基質對照組及空白對照組相比較有差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而單純基質對照組與空白對照組相比較，P＞0.05，提示這兩組差別無統(tǒng)計學意義，見表3。

圖5 水蛭素對兔耳瘢痕模型影響的形態(tài)學觀察Fig.5 Morphology observation on hirudin oniment treated rabbit ear skin scar model

表3 水蛭素對兔耳模型瘢痕增生指數(shù)的影響(±s)Table 3 Hypertrophic index of rabbit ear skin scar model(±s)

2.3.4 瘢痕成纖維細胞數(shù)密度NA(靶目標數(shù)量/統(tǒng)計場總面積)

水蛭素組分別與單純基質對照組和空白對照組相比較有顯著差異(P＜0.01)，具有統(tǒng)計學意義，見表4。

表4 水蛭素對瘢痕成纖維細胞數(shù)密度的影響(±s)Table 4 Numerical density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

表4 水蛭素對瘢痕成纖維細胞數(shù)密度的影響(±s)Table 4 Numerical density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

注:水蛭素組分別與空白對照組、基質對照組相比較，P=0.000，＊＊P＜0.01。Note:Hirudin group compare with control and matrix group，＊＊ P ＜0.01.

組別Grouping成纖維細胞數(shù)密度(細胞數(shù)/mm2)Numerical density on area(cell/mm2)空白對照組Control group 4662.95±485.47基質對照組Matrix group 4771.53±355.93水蛭素組 Hirudin group 3724.846±442.73＊＊

2.3.5 膠原纖維的面密度AA

水蛭素組分別與單純基質對照組和空白對照組相比較有差異(P＜0.01)，具有統(tǒng)計學意義，見表5。

表5 水蛭素對兔耳瘢痕模型膠原纖維的面密度的影響(±s)Table 5 Area density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

表5 水蛭素對兔耳瘢痕模型膠原纖維的面密度的影響(±s)Table 5 Area density on area of rabbit ear skin scar model(±s)

注:水蛭素組分別與對照組、基質相比較，P=0.000，＊＊P＜0.01。Note:Hirudin group compare with control and matrix group，＊＊ P ＜0.01.

組別Grouping膠原纖維的面密度Area density on area(%)空白對照組52.58±4.69基質對照組 50.55±5.40水蛭素組 35.55±7.85＊＊

2.4 討論

瘢痕是在創(chuàng)傷愈合過程中形成的一種皮膚疾患，病理上表現(xiàn)為細胞外基質的過度沉積和成纖維細胞的過度生長［2］。成纖維細胞在瘢痕組織里起主要的作用，因此，抑制瘢痕成纖維細胞的生物學行為是防治瘢痕形成與發(fā)展的關鍵，皮膚瘢痕是一種難治的疾病，目前用于病理性瘢痕治療的藥物主要有激素、硅酮和抗腫瘤藥物等，但是這些藥物本身的毒副及療效不確定，使之具有局限性。作者致力于從中藥和天然藥提取物中篩選抗皮膚瘢痕的功效藥物，該方向有較大的研究發(fā)掘價值［3-5］。本實驗選用水蛭素對皮膚瘢痕成纖維細胞增殖抑制的研究以及對兔耳增生性瘢痕的作用檢測其抗皮膚瘢痕增生的療效并探索相關機理。

水蛭素分為天然水蛭素和人工水蛭素，本實驗采用的是天然水蛭素。天然水蛭素是水蛭(螞蝗)唾液腺的一種分泌物質，為作用較強的凝血酶特異性抑制劑。其由65個氨基酸殘基組成，化學結構為單鏈環(huán)肽化合物，與凝血酶結合可形成一種非共價復合物，這種復合物可以中和凝血酶，并且能抑制凝血酶結合的纖維蛋白原［1，6］，能特異性地抑制凝血酶的活性［7］，可調節(jié)堿性成纖維細胞因子、轉化生長因子β1的分泌［9］，具有多方面的用途。水蛭素可以通過抑制凝血酶誘導的血小板聚集和促進血小板與凝血酶解離，導致血小板不能釋放血小板源生長因子(PDGF)，從而抑制細胞增生。PDGF不僅是由血小板分泌的，還可由成纖維細胞等一些細胞產(chǎn)生。本項目組前期研究顯示水蛭素可通過抑制成纖維細胞的生長及膠原形成達到對瘢痕的抑制作用［8］，提示其具有進一步深入研究及應用的價值。

本研究采用濃度為0.078～5 U/mL水蛭素作用于皮膚瘢痕的成纖維細胞，MTT法檢驗發(fā)現(xiàn)該濃度范圍的水蛭素能抑制成纖維細胞的生長，效果呈劑量依賴性。TUNEL法檢測水蛭素的凋亡率，比對照組高。本研究體外實驗顯示:水蛭素可抑制人皮膚瘢痕成纖維細胞的體外增殖。本研究利用水蛭素配制外用膏劑對兔耳皮膚瘢痕模型作用的初步篩選結果顯示:水蛭素組的兔耳瘢痕質地柔軟且較平整，無明顯的充血情況。測量水蛭素組的瘢痕增高指數(shù)、瘢痕成纖維細胞數(shù)密度和膠原纖維的面密度，檢測顯示水蛭素組較對照組和空白對照組的低，差異具有統(tǒng)計學意義。HE染色發(fā)現(xiàn)水蛭素組成纖維細胞數(shù)量較對照組的少，提示水蛭素可以抑制皮膚瘢痕成纖維細胞的生長。VG染色后觀察見水蛭素組的膠原較對照組的稀疏，排列較整齊，水蛭素組的膠原纖維面密度AA較對照組的小，提示水蛭素可以抑制瘢痕組織內成纖維細胞生長和膠原形成，從而抑制瘢痕組織的增生。

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