胡 波， 陳忠城， 王東寧， 李 林△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2血液內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

原核表達(dá)和制備EB 病毒GST/BFRF3融合蛋白用于鼻咽癌的診斷篩查*

胡 波1， 陳忠城1， 王東寧2， 李 林1△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2血液內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

目的構(gòu)建表達(dá)EB病毒衣殼抗原BFRF3基因的原核細(xì)胞表達(dá)載體并探討其在鼻咽癌血清學(xué)診斷中的應(yīng)用。方法以EB病毒 DNA為模版，采用PCR法擴(kuò)增目的基因BFRF3，與原核表達(dá)載體PGEX-5X-1連接，構(gòu)建PGEX-5X- BFRF3重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST/BFRF3融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和免疫印跡法鑒定后，純化目的蛋白作為包被抗原，制備ELISA試劑檢測鼻咽癌患者和正常人群BFRF3-IgA抗體。結(jié)果在大腸桿菌中成功地表達(dá)了GST/BFRF3融合蛋白，相對分子質(zhì)量為44 kD，免疫印跡證實(shí)目的蛋白帶有免疫原性，目的蛋白經(jīng)純化后作為包被抗原檢測鼻咽癌患者的靈敏度和特異度分別為65%和87%。結(jié)論采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建并表達(dá)了GST/BFRF3融合蛋白，其在鼻咽癌血清篩選中具有診斷價(jià)值。

鼻咽腫瘤； EB病毒衣殼抗原； 原核表達(dá)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)為雙鏈DNA病毒，與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC) 關(guān)系密切。廣東省為NPC高發(fā)區(qū)，發(fā)病率居世界首位，NPC的早期診斷和治療是提高患者生存率、改善生存質(zhì)量的重要手段之一。NPC的早期癥狀不明顯，原發(fā)部位隱蔽不易發(fā)現(xiàn)，明顯癥狀直到疾病晚期才被認(rèn)識，確診往往因此而受到延誤，從而令病人錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。研究證明絕大多數(shù)NPC患者癌細(xì)胞中均存在著EBV基因組成分，NPC患者血清中具有針對多種EB病毒抗原的抗體譜，其中包括病毒衣殼抗原(viral capsid antigen,VCA)、早期抗原(early antigen,EA)和EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen1,EBNA1)等,且針對這些抗原的特異性抗體效價(jià)的升高常發(fā)生在臨床發(fā)現(xiàn)腫瘤之前。因此在NPC高發(fā)區(qū)人群進(jìn)行該類抗體普查對于NPC的早期診斷、抗腫瘤治療進(jìn)程的監(jiān)控以及流行病學(xué)調(diào)查有著重要的意義[1-3]。

EBV VCA是重要診斷抗原，其IgA抗體出現(xiàn)在大多數(shù)NPC病人和NPC易患者的血清內(nèi)，檢測血清中VCA-IgA抗體在NPC的早期診斷上意義重大。但VCA蛋白復(fù)合物成份復(fù)雜，至少由30種不同的蛋白組成，在體外很難對VCA家族的蛋白水平和抗原數(shù)量進(jìn)行完全定義，針對NPC病人VCA-IgA抗體的相關(guān)靶抗原分子仍無法充分定位[4]。為及時(shí)而準(zhǔn)確地對NPC患者進(jìn)行早期診斷和治療，利用DNA重組技術(shù)尋找理想的基因工程EBV VCA抗原用于制備診斷試劑，已成為亟待解決的問題。p18是VCA的主要抗原多肽之一，由EB病毒基因組中BFRF3基因編碼。本實(shí)驗(yàn)室曾在酵母中分泌表達(dá)了BFRF3重組蛋白[5]，當(dāng)用發(fā)酵罐進(jìn)行大批量發(fā)酵時(shí)，表達(dá)的BFRF3重組蛋白活性與產(chǎn)率卻均過低。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)，將VCA中的BFRF3基因與原核表達(dá)載體PGEX-5X-1連接，構(gòu)建PGEX-5X-BFRF3原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)GST/BFRF3重組融合蛋白，并將其作為包被抗原，制備ELISA試劑對NPC 病人和健康對照人群進(jìn)行檢測，分析其靈敏度和特異度，探討B(tài)FRF3重組融合蛋白在NPC免疫檢測中的應(yīng)用及意義，期望能夠得到有價(jià)值的大量表達(dá)BFRF3重組蛋白的PGEX-5X-BFRF3原核表達(dá)菌株。

材 料 和 方 法

1材料

1.1標(biāo)本來源 300份病理確診為NPC患者的血清樣本來自中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院和江蘇省腫瘤醫(yī)院。男性221例，女性79例，平均年齡(45±25)歲，均為首次發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療。500份健康對照組標(biāo)本來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院健康體檢者，男性372例，女性128例，平均年齡(43±22)歲(采集時(shí)間2003～2005年)。372份EB病毒 PCR陽性或陰性的血清[陽性75份，陰性297份，平均年齡(42±20)歲，采集時(shí)間2005年]來自南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院及附屬珠江醫(yī)院，EB病毒 PCR定量檢測試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司, PCR儀為Roche LightCycler及BioRad MJ Option II型；單純皰疹病毒抗體檢測試劑盒檢出的IgM、IgG陽性標(biāo)本21份、巨細(xì)胞病毒IgM、IgG檢測試劑盒檢出的陽性標(biāo)本27份均來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院門診患者，試劑購自ZENS SCIENTIFIC INC。

1.2病毒DNA模板、質(zhì)粒與關(guān)鍵試劑 EB病毒轉(zhuǎn)化的淋巴瘤細(xì)胞株B95-8細(xì)胞購自中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大腸桿菌JM109用于所有質(zhì)粒擴(kuò)增，原核表達(dá)載體pGEX-5X-1、E.coliBL21(DE3)和GST·BindTMKits 購自Novagen。病毒DNA抽提試劑盒購自上海生物工程公司。DNA回收及純化試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購自Qiagen。所有內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶均購自New England Biolabs。EBV VCA-IgA抗體檢測試劑盒購自北京貝爾生物工程有限公司。

2方法

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 EBV DNA的提取參照文獻(xiàn)[5]，以EBV DNA為模板擴(kuò)增BFRF3基因(531 bp)，擴(kuò)增引物由上海博亞公司合成，引物序列如下：上游引物5’-GGAATTCATGGCACGCCGGCTGCC-3’，下游引物5’-CGGCGGCCGCTTACTGTTTCTTACGTGCCCCGCGT-3’。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，定向克隆到原核表達(dá)載體pGEX-5X-1中，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素的LB 平板上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，雙酶切電泳及DNA 序列分析鑒定重組質(zhì)粒pGEX-5X-BFRF3。

2.2BFRF3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑選構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pGEX-5X-BFRF3和空質(zhì)粒pGEX-5X-1轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜后，分別挑取重組載體和空載體的單克隆菌落接種于5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。各取上述過夜菌100 μL轉(zhuǎn)接入10 mL含氨芐青霉素的新鮮LB中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600為0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，35 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，離心去上清,收集培養(yǎng)物。菌體重懸于8倍于菌體總量的PBS緩沖液中，冰浴條件下超聲破菌，加入Triton X-100至1%，抑肽酶至1 mg/L，DNase I(終濃度為10 mg/L)，室溫放置30 min，作用至菌液不再黏稠，SDS-PAGE和薄層蛋白掃描定量分析目的蛋白表達(dá)。

2.3篩選IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的最佳濃度和時(shí)間 將陽性轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)物分裝于5支試管中，加入不同濃度(1.0 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、0.4 mmol/L和0.2 mmol/L) 的IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，在誘導(dǎo)表達(dá)4 h 時(shí)，分別收集樣本，超聲破菌后收集細(xì)胞裂解液，采用ELISA 法對目的蛋白進(jìn)行分析。選取IPTG 的最佳誘導(dǎo)濃度，分別于誘導(dǎo)后1 h、2 h、3 h、4 h和5 h收集樣本，超聲破菌后，再用ELISA 法測定目的蛋白的效價(jià),以確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.4重組BFRF3蛋白的鑒定 取步驟2.2項(xiàng)所得樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)染PVDF膜，加入兔抗GST多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)，進(jìn)行Western blotting檢測。

2.5重組BFRF3蛋白的純化 收集IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的pGEX-5X-BFRF3陽性轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)物，超聲破菌后，棄上清。沉淀用8 mol/L尿素變性，待沉淀充分溶解后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，梯度稀釋復(fù)性，使用GST·BindTMKits，過GST柱層析純化融合蛋白，收集樣品用SDS-PAGE和ELISA檢測蛋白活性和純度。

2.6VCA-IgA抗體的檢測 稀釋純化的BFRF3重組蛋白，每孔100 ng∶100 μL包被聚丙乙烯反應(yīng)板，PBS封閉。HRP標(biāo)記的羊抗人IgA Fab段作為探針，用間接ELISA法檢測NPC患者和健康體檢標(biāo)本的血清BFRF3-IgA水平，四甲基聯(lián)苯胺為底物，450 nm波長處測定吸光度(A)。固相抗原及酶標(biāo)記物的最佳工作濃度用方陣滴定確定。通過ROC曲線確定臨界值(cut-off值)。靈敏度為NPC患者標(biāo)本中的陽性檢出率，特異度為健康對照組中的陰性檢出率。相同標(biāo)本同時(shí)用北京貝爾生物工程有限公司 EBV VCA-IgA抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

2.7特異度評價(jià) EB病毒PCR檢測陽性或陰性血清、單純皰疹病毒I型、II型IgM、IgG抗體陽性血清、巨細(xì)胞病毒IgM、IgG抗體陽性血清分別用上述BFRF3重組蛋白制備的EBV VCA-IgA抗體檢測試劑進(jìn)行檢測。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 12.0軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各組間計(jì)數(shù)資料的比較采用2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PCR擴(kuò)增BFRF3基因

以質(zhì)粒EBV DNA為模板擴(kuò)增BFRF3基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，在531 bp處可見到清晰條帶，與理論上BFRF3基因的大小完全符合，見圖1。

Figure 1. PCR amplication ofBFRF3 gene. 1: PCR product ofBFRF3 gene (531 bp)； M： DGL2000 DNA marker.

圖1PCR擴(kuò)增BFRF3基因

2pGEX-5X-BFRF3載體構(gòu)建和蛋白表達(dá)

BFRF3經(jīng)PCR擴(kuò)增后，插入載體pGEX-5X-1的相應(yīng)位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pGEX-5X- BFRF3，經(jīng)序列分析及雙酶切鑒定表明，BFRF3基因序列正確，基因插入方向無誤,見圖2。

Figure 2. Double digestion of recombinant plasmid PGEX-5X-BFRF3 byEcoR I andNotI. M：DGL2000 DNA marker；1：double digestion of PGEX-5X-1 plasmid byEcoR I+NotI； 2：double digestion of recombinant plasmid PGEX-5X-BFRF3 byEcoR I+NotI.

圖2重組質(zhì)粒PGEX-5X-BFRF3的雙酶切分析

含空質(zhì)粒pGEX-5X-1與含重組質(zhì)粒PGEX-5X-BFRF3的工程菌株BL21(DE3)，在對數(shù)生長期，即A600約為0.5時(shí)，0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后，進(jìn)行SDA-PAGE分析結(jié)果表明，含PGEX-5X-BFRF3重組質(zhì)粒的菌株誘導(dǎo)后在分子量約44 kD處有明顯的蛋白表達(dá)帶，與預(yù)測的GST/BFRF3融合蛋白的相對分子質(zhì)量相符，表達(dá)水平約占總蛋白的30%， 見圖3。而含空質(zhì)粒菌株誘導(dǎo)后在分子量約26 kD處有明顯的蛋白表達(dá)帶，與理論上的GST相對分子質(zhì)量相符。誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑 IPTG 最佳濃度為0.6 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，ELISA檢測效價(jià)為1∶25 600。

Figure 3. SDS-PAGE analysis of recombinant protein. M: low molecular weight protein marker; 1: the total protein of induced PGEX-5X-1/BL21(DE3)；2: the total protein of induced PGEX-5X-BFRF3/BL21(DE3).

圖3重組蛋白的SDS-PAGE分析

3重組GST/BFRF3融合蛋白的鑒定

將誘導(dǎo)表達(dá)的菌株總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行Western blotting分析，以抗GST的多克隆抗體為Ⅰ抗，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒PGEX-5X-BFRF3轉(zhuǎn)化菌在44 kD處出現(xiàn)一特異性的反應(yīng)條帶，與預(yù)測的GST/BFRF3融合重組蛋白的相對分子質(zhì)量相符，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌則在26 kD處出現(xiàn)一特異性的反應(yīng)條帶，見圖4。

4重組GST/BFRF3融合蛋白的純化

SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色可見經(jīng)包涵體洗滌、復(fù)性，GST親和層析柱純化后的PGEX-5X-BFRF3重組蛋白帶，相對分子質(zhì)量為44 kD，純度達(dá)90%，見圖5。將純化后的抗原倍比稀釋后包被聚丙乙烯板條，以EBV陽性和陰性血清為標(biāo)準(zhǔn)，檢測GST/BFRF3重組融合蛋白的效價(jià)，發(fā)現(xiàn)GST/BFRF3重組融合蛋白的效價(jià)為1∶51 200。

Figure 4. Western blotting analysis of recombinant protein identified by GST polyclonal antibody.1. the total protein of induced PGEX-5X-BFRF3/BL21(DE3)；2. The total protein of induced PGEX-5X-1/BL21(DE3).

圖4重組蛋白的Westernblotting分析

Figure 5. The purified recombinant protein detected by 12% SDS-PAGE. M: low molecular weight protein mar-ker; 1：the purified PGEX-5X-BFRF3/BL21(DE3) recombinant protein.

圖5純化重組蛋白的SDS-PAGE分析

5BFRF3-IgA的檢測

用純化后的GST/BFRF3蛋白作為包被抗原分別對鼻咽癌患者及健康體檢標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1(通過ROC曲線確定其cut-off值)，在NPC患者和健康對照中，陽性率分別為65%和13%。北京貝爾生物工程有限公司 EBV VCA-IgA抗體檢測試劑盒檢測相同組別的NPC患者和健康對照，陽性率分別為64%和10%，與GST/BFRF3-IgA的檢測差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 GST/BFRF3-IgA和EBV VCA-IgA 試劑盒檢測NPC患者和健康人群結(jié)果的比較

6特異度評價(jià)

用BFRF3重組蛋白制備的IgA抗體試劑檢測297份EBV PCR陰性標(biāo)本未出現(xiàn)陽性結(jié)果；在75份EBV PCR陽性標(biāo)本中，有20份BFRF3-IgA檢測陽性。陽性結(jié)果均出現(xiàn)在EBV PCR 陽性的標(biāo)本中，抗體檢測相對于核酸檢測的特異度為100%。單純皰疹病毒I型、II型IgM、IgG抗體陽性血清21份中，BFRF3-IgA檢測未出現(xiàn)陽性；巨細(xì)胞病毒IgM、IgG抗體陽性血清27份中，BFRF3-IgA檢測也未見陽性。

討 論

NPC在我國是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，EBV感染與NPC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NPC的顯著特征是病人血清中的EBV VCA抗體(尤其是IgAs亞型)水平普遍升高，借此可區(qū)分NPC和健康攜帶者。這種血清學(xué)變化在NPC發(fā)病前期將先于癥狀出現(xiàn)，因此，EBV VCA-IgA抗體的檢測可用于NPC的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。目前國內(nèi)外EBV的血清學(xué)檢測采用免疫熒光法、免疫酶法和酶聯(lián)免疫吸附分析法等[6-8]。免疫熒光法因操作繁瑣、特異性差且需特殊儀器，已被逐漸淘汰；免疫酶法涂片細(xì)胞表達(dá)抗原因載量不穩(wěn)定、陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)受主觀因素影響等缺點(diǎn)，使得試劑的批間差異大，不同檢驗(yàn)人員得出的結(jié)果也存在較大差異。因此人們試圖以ELISA方法取代免疫熒光法和免疫酶法用于大規(guī)模血清流行病學(xué)調(diào)查，但受抗原來源和純化方法的限制，無法獲得足夠的抗原用以大規(guī)模篩查，因此有必要利用DNA重組技術(shù)在不同表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)EBV相關(guān)抗原制備診斷試劑[9]。

VCA是NPC的重要診斷抗原，由病毒核衣殼和完整病毒顆粒包膜的多肽組成。p18是VCA的主要抗原多肽之一，由EBV基因組中BFRF3基因編碼，有極強(qiáng)的免疫原性,是檢測EBV VCA 相關(guān)抗體的主要抗原。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)BFRF3基因并對其在NPC免疫檢測中的意義進(jìn)行分析，希望能得到一個(gè)針對NPC患者VCA 特異性抗體的良好抗原。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)已成為外源基因的首選表達(dá)系統(tǒng)[10-11]，它具有遺傳背景清楚、成本低廉、高生產(chǎn)率、操作簡單、容易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來出現(xiàn)的重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵技術(shù)，不僅可以提高菌體的發(fā)酵密度，減少培養(yǎng)體積還可以縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本，從而極大地提高了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品市場上的競爭力。本研究采用原核表達(dá)載體PGEX-5X-1對目的蛋白進(jìn)行表達(dá)，由于PGEX-5X-1帶有GST純化標(biāo)簽，所表達(dá)的融合蛋白產(chǎn)物可通過GST層析柱快速、簡便地純化，也可以通過凝血酶、x因子等切割后快速釋放，為生產(chǎn)高純度高活性的基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造了有利條件。

BFRF3片段與其它單純皰疹病毒沒有同源性，其主要表位集中在BFRF3第119～176氨基酸區(qū)域內(nèi)，在NPC病人的診斷和監(jiān)控中具有一定價(jià)值。我們在大腸桿菌中表達(dá)了BFRF3全長片段，所獲得的GST/BFRF3融合蛋白主要以不溶性包涵體形式存在。通過洗滌包涵體、變性溶解、復(fù)性、GST親和層析等過程，得到了純度達(dá)90%以上的重組融合蛋白。GST/BFRF3融合蛋白的相對分子量為44 kD，Western blotting證實(shí)該蛋白有免疫原性，ELISA檢測的效價(jià)顯示了表達(dá)產(chǎn)物與NPC病人血清間具有良好的免疫反應(yīng)性。將經(jīng)GST親和層析柱純化后的GST/BFRF3重組蛋白，包被聚丙乙烯反應(yīng)板，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgA抗體配對，制備ELISA試劑，對NPC的病人和健康人群EBV IgA抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在NPC病人中，陽性率為65%，與van Grunsven等[12]對香港NPC人群的研究結(jié)果相似(61%)。同時(shí)與北京貝爾生物工程有限公司EBV VCA-IgA抗體檢測試劑盒相比，其對NPC檢測的相對靈敏度及特異度二者無顯著差異。本研究在大腸桿菌中成功表達(dá)了GST/BFRF3融合蛋白，與本實(shí)驗(yàn)室前期使用酵母系統(tǒng)表達(dá)的BFRF3重組蛋白在NPC人群中的陽性率(71%)無明顯差異，由于前期研究中酵母表達(dá)的BFRF3重組蛋白在轉(zhuǎn)為發(fā)酵罐進(jìn)行大量培養(yǎng)時(shí)，表達(dá)的BFRF3重組蛋白活性與產(chǎn)率卻均過低，所以我們期望使用重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵技術(shù)能夠大量制備有活性的GST/BFRF3重組蛋白。GST/BFRF3重組蛋白在NPC中的陽性檢出率為65%，仍無法滿足篩選所有NPC患者的需要，目前尚未發(fā)現(xiàn)任何單個(gè)血清學(xué)標(biāo)志物可以用來診斷所有的NPC患者。可能對于EBV基因重組抗原來說，需要將不同抗原進(jìn)行聯(lián)合檢測，才能提高NPC早期診斷的靈敏度和特異度。但具體需與哪種抗原片段進(jìn)行聯(lián)合檢測，還有待于進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)用EB病毒PCR陽性和陰性血清、同屬皰疹病毒科的單純皰疹病毒抗體陽性標(biāo)本及巨細(xì)胞病毒抗體陽性標(biāo)本對BFRF3作為檢測抗原的特異度進(jìn)行評價(jià)，陽性結(jié)果均出現(xiàn)在EB病毒PCR陽性血清中，在EBV PCR陰性標(biāo)本、單純皰疹病毒抗體陽性標(biāo)本和巨細(xì)胞病毒抗體陽性標(biāo)本中均未出現(xiàn)陽性，證明BFRF3用于EBV IgA抗體檢測時(shí)，具有較高的特異度。

總之，本研究采用原核系統(tǒng)成功構(gòu)建表達(dá)了GST/BFRF3重組融合蛋白，并對其在NPC血清學(xué)中的診斷價(jià)值進(jìn)行了初步評估，表明BFRF3重組蛋白可以有效地用于NPC患者相關(guān)抗體的檢測，為尋找理想的基因工程EBV抗原用于制備NPC診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

[1] Wong M, Lye M, Cheng H, et al. Epstein-Barr virus serology in the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Asian Pac J Allergy Immunol, 2005, 23(1): 65-67.

[2] Fachiroh J, Schouten T, Hariwiyanto B, et al. Molecular diversity of Epstein-Barr virus IgG and IgA antibody responses in nasopharyngeal carcinoma: a comparison of Indonesian, Chinese, and European subjects[J]. J Infect Dis, 2004, 190(1): 53-62.

[3] 尹志華，蔣衛(wèi)紅， 李 峰，等. 鼻咽癌組織中EB病毒潛伏相關(guān)基因的表達(dá)[J]. 中國病理生理雜志，2007, 23(12): 2374- 2378.

[4] Nystad T, Myrmel H. Prevalence of primary versus reactivated Epstein-Barr virus infection in patients with VCA IgG-, VCA IgM- and EBNA-1-antibodies and suspected infectious mononucleosis[J]. J Clin Virol, 2007, 38(4): 292-297.

[5] 胡 波，李朝霞，盛 平，等. EB病毒VCA基因片段在畢赤酵母中的表達(dá)及臨床應(yīng)用[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2010，30(4):365-370.

[6] Cheng W，Chan K， Chen H，et al. Assessing the risk of nasopharyngeal carcinoma on the basis of EBV antibody spectrum[J]. Int J Cancer, 2002，97(4): 489-492.

[7] Karray H, Ayadi W, Fki L, et al. Comparison of three different serological techniques for primary diagnosis and monitoring of nasopharyngeal carcinoma in two age groups from Tunisia[J]. J Med Virol, 2005, 75(4): 593-602.

[8] Hsu M, Hsu W, Sheen T, et al. Specific IgA antibodies to recombinant early and nuclear antigens of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma[J]. Clin Otolaryngol Allied Sci, 2001, 26(4): 334-338.

[9] Hu B, Hong G, Li Z, et al. Expression of VCA (viral capsid antigen) and EBNA1 (Epstein-Barr-virus-encoded nuclear antigen 1) genes of Epstein-Barr virus inPichiapastorisand application of the products in a screening test for patients with nasopharyngeal carcinoma[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2007, 47(Pt 1):59-69.

[10] 付涌水, 江朝富, 李樹濃, 等. 抗- D 抗體Fab 段基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].中國病理生理雜志，2006, 22(1)：152-155.

[11] 楊文理, 陳守春, 陳毅榮. 人自剪切TRAIL胞外段融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化[J].中國病理生理雜志,2010, 26(6): 1237-1239,1248.

[12] van Grunsven WM, Spaan WJ, Middeldorp JM. Localization and diagnostic application of immunodominant domains of the BFRF3-encoded Epstein-Barr virus capsid protein[J]. J Infect Dis, 1994,170(1): 13-19.

ProkaryoticexpressionandpreparationofGST/BFRF3fusionproteinofEpstein-Barrvirusforscreeningnasopharyngealcarcinomas

HU Bo1, CHEN Zhong-cheng1, WANG Dong-ning2, LI Lin1

(1DepartmentofLaboratoryMedicine,2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lilin5786@263.net)

AIM: To construct a prokaryotic expression plasmid containing Epstein-Barr viral (EBV) capsid antigenBFRF3 gene and to observe the application of recombinant BFRF3 protein in the serological diagnosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).METHODSDNA extracted from the B95-8 cells was used as the templates. Polymerase chain reaction (PCR) was used to generate a DNA fragment ofBFRF3 gene, and a 531-bp DNA fragment was inserted into a PGEX-5X-1 vector. The recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21 (DE3). The expression of GST/BFRF3 fusion protein was induced by IPTG, identified by both SDS-PAGE and Western blotting, and then purified by glutathione-sepharose beads. The purified recombinant protein was coated to microplate for ELISA detection of EBV-IgA antibody in NPC patients.RESULTSThe GST/BFRF3 fusion protein was successfully expressed inE.coli. The molecular weight of the product was approximately 44 kD. The recombinant fusion protein GST/BFRF3 showed good immunoreactivity. A novel ELISA was established using GST/BFRF3 protein. Serum samples collected from the NPC patients and healthy controls were tested by this ELISA. The sensitivity and specificity of GST/BFRF3 tests for NPC patients were 65% and 87%, respectively.CONCLUSIONThe recombinant protein GST/BFRF3 is expressed inE.coli, and it has diagnostic value for screening of NPC patients.

Nasopharyngeal neoplasms; Epstein-Barr viral capsid antigen; Prokaryotic expression

R365

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.033

1000- 4718(2013)06- 1147- 06

2013- 01- 24

2013- 05- 09

教育部第44批留學(xué)回國人員科研啟動基金[教外司留(2012)940]

△通訊作者 Tel： 020-85252885； E-mail： lilin5786@263.net