林尤恩, 倪仰鵬, 王曉芬, 王春冰

(揭陽市人民醫(yī)院，廣東 揭陽 522000)

人食管鱗癌組織中RhoC和Ki-67的表達(dá)及意義

林尤恩△, 倪仰鵬, 王曉芬, 王春冰

(揭陽市人民醫(yī)院，廣東 揭陽 522000)

目的檢測人食管鱗癌組織中RhoC和Ki-67的表達(dá)，探討它們在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)方法(二步法)，檢測分析52例人食管鱗癌組織中RhoC和Ki-67蛋白的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果(1)食管鱗癌組織RhoC蛋白的陽性表達(dá)率為61.5%(32/52)，相應(yīng)癌旁組織RhoC陽性表達(dá)率為29.7%(11/37)，差異顯著(P<0.05)。(2)RhoC表達(dá)與食管鱗癌臨床TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，TNM Ⅲ期食管鱗癌組織中RhoC陽性表達(dá)率為78.3%(18/23)，顯著高于TNM Ⅰ～Ⅱ期的48.3%(14/29)(P<0.05)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中RhoC陽性表達(dá)率為81.8%(18/22)，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的46.7%(14/30)(P<0.05)。(3)食管鱗癌組織中，RhoC與Ki-67的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.322，P<0.05)，均呈升高趨勢。結(jié)論RhoC的高表達(dá)與食管鱗癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及細(xì)胞增殖密切相關(guān)。RhoC可成為食管鱗癌早期診斷和判斷預(yù)后的輔助指標(biāo)。

食管腫瘤； RhoC蛋白； Ki-67抗原

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤死亡率的前10位，但食管癌的發(fā)病機制尚不清楚[1]。廣東省東部的潮汕地區(qū)是我國唯一的食管癌沿海高發(fā)區(qū)，然而食管癌早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者就診時已處于中晚期，已失去手術(shù)的機會。因此，本研究旨在探索食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)早期診斷的生物指標(biāo)，分析其對ESCC個體化治療的指導(dǎo)意義和臨床價值。

Ras同源蛋白C(Ras homology C, RhoC)是小分子G蛋白超家族中Rho亞族的成員蛋白之一，近年研究表明RhoC在多種腫瘤中高表達(dá)，尤其是轉(zhuǎn)移方面的作用突出，已成為腫瘤靶向治療研究的熱點之一。Ki-67是一種核抗原，是評價惡性腫瘤細(xì)胞增殖活性的常用指標(biāo)。本研究通過免疫組化方法檢測ESCC組織中RhoC蛋白的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，并探討RhoC與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1材料

52例食管癌的標(biāo)本來自揭陽市人民醫(yī)院2007～2011年病理科存檔蠟塊，患者均為首診，未進(jìn)行放、化療及免疫治療。其中男38例，女14例，年齡41～73歲，平均年齡58歲。所有病例切片經(jīng)HE染色確診，病理類型均為鱗狀細(xì)胞癌，另外37例為部分腫瘤對應(yīng)的鄰近正常食管黏膜。根據(jù)WHO 1977年食管腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類，其中高/中分化鱗癌35例，低分化鱗癌17例，發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。腫瘤臨床分期參照2009年國際抗癌協(xié)會(UICC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

2試劑及方法

羊抗人RhoC多克隆抗體購自Santa Cruz(1∶100稀釋)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體(1∶100稀釋)、HRP標(biāo)記的Ⅱ抗工作液及DAB顯色劑均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

取組織蠟塊連續(xù)切片，切片厚度4 μm，常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)20 min(0.01 mol/L檸檬酸緩沖液)，5%正常羊血清封閉，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜；Ⅱ抗工作液室溫孵育1 h，DAB顯色5 min，沖洗以終止反應(yīng)。常規(guī)蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。同時用PBS代替Ⅰ抗作染色的陰性對照，用已知的染色陽性切片作陽性對照。

3結(jié)果判斷

RhoC蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，陽性細(xì)胞呈黃色或棕黃色顆粒，彌漫性或局灶性分布。每張片子隨機觀察5個高倍視野(×400)計數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞個數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率，分為4個等級：<25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。根據(jù)免疫組化染色強度分為3個等級：無著色為0分，淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，黃褐色計為3分。以陽性細(xì)胞率和染色強度的分值乘積作為每一例的積分，并將評分結(jié)果歸為陰性表達(dá)(積分<3分)和陽性表達(dá)(積分≥3分)2組。

Ki-67蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞為棕色顆粒。每張片子隨機觀察5個視野(×200)中Ki-67表達(dá)的腫瘤細(xì)胞占的百分比，其均值<30%的癌細(xì)胞表達(dá)為低表達(dá)，≥30%為高表達(dá)。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1RhoC在ESCC及癌旁組織中的表達(dá)情況

RhoC蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，ESCC組織中RhoC蛋白的陽性表達(dá)率為61.5%(32/52)，相應(yīng)癌旁組織RhoC陽性表達(dá)率為29.7%(11/37)，差異顯著(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Expression of RhoC and Ki-67 proteins in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) detected by immunohistochemical staining. A: high expression of RhoC in ESCC (SP,×400); B: negative expression of RhoC in adjacent histologically normal epithelium (SP,×200); C: negative expression of RhoC in adjacent histologically normal epithelium (SP,×400); D: high expression of Ki-67 in ESCC (SP,×400).

圖1免疫組織化學(xué)檢測RhoC和Ki-67在ESCC組織中的表達(dá)

2RhoC在ESCC的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

RhoC表達(dá)與ESCC臨床TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，TNM Ⅲ期的ESCC組織中RhoC陽性表達(dá)率為78.3%(18/23)，顯著高于TNM Ⅰ～Ⅱ期的48.3%(14/29)(P<0.05)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗組織中RhoC陽性表達(dá)率為81.8%(18/22)，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的46.7%(14/30)(P<0.05)。RhoC表達(dá)與性別、年齡、部位、病變長度和分化程度無明顯相關(guān)，見表1。

3RhoC的表達(dá)與Ki-67之間的相關(guān)性

ESCC組織中RhoC與Ki-67的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.322，P<0.05)，見表2。

討 論

Rho家族是小分子G蛋白超家族的重要成員，已被證實的成員包括Rho、Rac、Cdc42、Rnd、RhoD和TTF等，這些成員蛋白在許多重要的細(xì)胞活動中起作用，如參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控，并與細(xì)胞凋亡、腫瘤侵襲等密切相關(guān)。其中RhoC基因定位于1p13～p21，RhoC蛋白含193個氨基酸，是相對分子質(zhì)量大約為21 kD的GTP結(jié)合蛋白。近年來的研究顯示，RhoC在多種腫瘤如乳腺癌[2]、肝細(xì)胞癌[3]、胃癌[4]、頭頸部鱗癌[5]、前列腺癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]等均呈高表達(dá)，并參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和浸潤轉(zhuǎn)移[8]。

表1RhoC在ESCC中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

Table 1. The relationships between RhoC expression and clinicopathological characteristics in ESCC

ParameternRhoCexpressionPPositiveNegativeTotal523220Age(year) ≤451174>0.05 >45412516Sex Male382612>0.05 Female1468Differentiation Well/moderate352015>0.05 Poor17125TNMstage Ⅰ～Ⅱ291415<0.05 Ⅲ23185Lymphnodemetastasis Yes221840.01 No301416

表2ESCC組織中RhoC表達(dá)與Ki-67的相關(guān)性

Table 2. The relationship between RhoC and Ki-67 expression in ESCC

Ki-67RhoCexpressionTotalPositiveNegativePositive271138Negative5914Total322052

r=0.322,P<0.05.

RhoC與ESCC發(fā)生及發(fā)展的研究仍較少，F(xiàn)aried等[9]應(yīng)用體外和體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，RhoA和RhoC蛋白均參與ESCC腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，其中RhoC促進(jìn)細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的能力更強。隨后應(yīng)用qPCR檢測發(fā)現(xiàn)ESCC細(xì)胞株和患者標(biāo)本中RhoC mRNA的水平較正常組織顯著升高，且與腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。Zhang等[11-12]首次應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測RhoC在ESCC中的表達(dá)情況并發(fā)現(xiàn)RhoC蛋白的高表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后有關(guān)。趙志華等[13-14]采用半定量RT-PCR和原位雜交方法檢測顯示，RhoC mRNA在ESCC組織中顯著增加，并與ESCC生物學(xué)行為密切相關(guān)。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，RhoC的高表達(dá)與ESCC分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與上述研究者的報道一致，進(jìn)一步提示RhoC蛋白有望成為ESCC早期診斷和判斷預(yù)后的一個有效指標(biāo)。

Ki-67是Gerdes等[15]在1983年報道的一種單克隆抗體，其抗原是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，表達(dá)于細(xì)胞周期中除G0及G1早期外的其它各期。研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67作為標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的抗原，與ESCC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是反映ESCC腫瘤細(xì)胞增殖活性的理想指標(biāo)[16-17]。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于RhoC蛋白和Ki-67抗原表達(dá)關(guān)系在ESCC中的研究報道，為了進(jìn)一步從蛋白水平研究RhoC與ESCC細(xì)胞增殖的關(guān)系，本研究通過免疫組化染色方法，首次聯(lián)合檢測RhoC和Ki-67在ESCC中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示ESCC組織中RhoC與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)，均呈升高趨勢，提示RhoC可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖參與ESCC的發(fā)生發(fā)展過程，然而相關(guān)機制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，RhoC的高表達(dá)與ESCC的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可能通過參與腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控，促進(jìn)ESCC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。因此，RhoC有望成為ESCC早期診斷和判斷預(yù)后的輔助指標(biāo)。

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ExpressionandclinicalsignificanceofRhoCandKi-67inhumanesophagealsquamouscellcarcinomatissues

LIN You-en, NI Yang-peng, WANG Xiao-fen,WANG Chun-bing

(JieyangPeople’sHospital,Jieyang522000,China.E-mail:un-lin@qq.com)

AIM: To investigate the expression and significance of RhoC and Ki-67 in human esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissues.METHODSThe expression of RhoC and Ki-67 was detected in 52 specimens of ESCC by the method of immunohistochemistry. The clinicopathological features were also analyzed.RESULTSThe expression of RhoC was detected in 32 of the total 52 (61.5%) cases of human ESCC tissues, significantly higher than that in the adjacent histologically normal epithelium, which was only in 11 of 37 cases (29.7%,P<0.05). RhoC expression was closely correlated with clinical tumor-node-metastasis (TNM) stage (P<0.05) and lymph node metastasis (P<0.05) in ESCC. The over-expression of RhoC was positively correlated with Ki-67 in ESCC (r=0.322,P<0.05).CONCLUSIONThe over-expression of RhoC protein significantly correlates with advanced TNM stage, lymph node metastasis and cell proliferation ability of ESCC. Therefore, RhoC may be a new auxiliary parameter for early diagnosis and prognostic evaluation of ESCC.

Esophageal neoplasms; RhoC protein; Ki-67 antigen

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.030

1000- 4718(2013)06- 1133- 04

2013- 01- 07

2013- 03- 32

△通訊作者 Tel: 0663-8660233; E-mail: un-lin@qq.com