章 瑜， 俞 康

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科，浙江 溫州 325000)

DKK1基因沉默的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞成骨分化的影響*

章 瑜， 俞 康△

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科，浙江 溫州 325000)

目的初步探討一種與胚胎發(fā)生及腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的糖蛋白Dickkopf-1(DKK1)在骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)發(fā)病中的作用。方法前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的質(zhì)粒pLenti6/V5-GW/DKK-1-miR，與慢病毒包裝質(zhì)粒一起包裝成慢病毒，感染人骨髓瘤U266細(xì)胞，建立DKK1沉默的U266細(xì)胞。小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1體外成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、誘導(dǎo)分化組、30% U266上清干預(yù)組、30%DKK1 RNAi U266上清干預(yù)組和30%無(wú)關(guān)序列RNAi U266上清干預(yù)組；誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d后，通過茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)數(shù)目；real-time PCR檢測(cè)骨鈣素(osteocalcin，OC)mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果成骨誘導(dǎo)體系中，與空白組比較，誘導(dǎo)組OC mRNA有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與誘導(dǎo)組比較，30% U266上清干預(yù)組OC mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)。與30% U266上清干預(yù)組比較，30%DKK1 RNAi U266上清干預(yù)組OC mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.05)，30%無(wú)關(guān)序列RNAi U266上清干預(yù)組OC mRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與誘導(dǎo)組比較，30% U266上清干預(yù)組鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)明顯減少(P<0.01)。與30% U266上清干預(yù)組比較，30%DKK1 RNAi U266上清干預(yù)組鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)明顯增多(P<0.05),30%無(wú)關(guān)序列RNAi U266上清干預(yù)組鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論U266細(xì)胞中DKK1基因沉默后，其培養(yǎng)上清抑制小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化的能力減弱。

Dickkopf-1蛋白; 骨髓瘤骨病; 骨鈣素

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性漿細(xì)胞疾病。而80%左右的患者伴有嚴(yán)重骨痛及病理性骨折的表現(xiàn)，即骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)[1]。發(fā)生MBD的MM患者因骨痛﹑病理性骨折和高鈣血癥等，生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[2]。更重要的是，與沒有病理性骨折的患者比較，病理性骨折的MM患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加20%以上[3-4]。因此，加強(qiáng)對(duì)MBD的研究和尋找有效的治療方法迫在眉睫。

既往研究中多專注于對(duì)破骨細(xì)胞的研究[5-6]，但同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)破骨細(xì)胞抑制來(lái)減少骨的重吸收，并不能改善骨質(zhì)損害的修復(fù)[7]。成骨細(xì)胞功能的受損在MM病人骨損害的發(fā)展中起亦著重要作用。 許多研究表明經(jīng)典的 Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)正常的骨發(fā)育和腫瘤相關(guān)骨病的發(fā)生是非常重要的[8]，Wnt途徑及它的抑制物Dickkopf-1 (DKK1)參與了骨轉(zhuǎn)移過程。Gunn等[9]發(fā)現(xiàn), 具有溶骨性病變的MM患者的骨髓瘤細(xì)胞能分泌高水平的DKK1, 通過抑制Wnt途徑，阻止間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。許多研究機(jī)構(gòu)把DKK1的中和抗體應(yīng)用于小鼠和人體的骨質(zhì)疏松研究中，都取得了預(yù)期的良好效果[10-11]。但是中和抗體不能從根本上解決問題，本實(shí)驗(yàn)就嘗試基因沉默的效果。

材 料 和 方 法

1材料

人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院腫瘤研究所(ATCC編號(hào)：TIB-196)，小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1為溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院醫(yī)科所保存。

2主要試劑

高糖DMEM液、RPMI-1640液、低糖DMEM液和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購(gòu)于Gibco；Trizol購(gòu)于Invitrogen; 茜素紅粉劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)購(gòu)于R&D；PCR 引物由上海賽百盛生物工程公司生產(chǎn)。

3主要方法

3.1DKK1沉默的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266的建立 本實(shí)驗(yàn)室前期研究已完成[12]。

3.2體外前成骨細(xì)胞誘導(dǎo)體系實(shí)驗(yàn)分組 (1)空白對(duì)照組：予總體積3 mL 10%FBS-DMEM完全培養(yǎng)液；(2)誘導(dǎo)分化組：予總體積3 mL含50 μg/L BMP-2的完全培養(yǎng)液；(3) 30% U266上清干預(yù)組：予總體積3 mL 含30% U266細(xì)胞上清和50 μg/L BMP-2的完全培養(yǎng)液； (4)30%DKK1 RNAi U266上清干預(yù)組：予總體積3 mL含DKK1 RNAi的U266細(xì)胞培養(yǎng)上清液和50 μg/L BMP-2的完全培養(yǎng)液； (5)30%無(wú)關(guān)序列RNAi U266上清干預(yù)組：予總體積3 mL含無(wú)關(guān)序列RNAi的U266細(xì)胞培養(yǎng)上清液和50 μg/L BMP-2的完全培養(yǎng)液。取MC3T3-E1細(xì)胞2.0×104個(gè)于6孔培養(yǎng)板上，每組加入上述培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d換液1次，每孔加入相同的培養(yǎng)液，12 d后收獲細(xì)胞。

3.3茜素紅染色及鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù) 按實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，12 d后收獲細(xì)胞。去除各孔培養(yǎng)液，以PBS清洗，以95%乙醇室溫固定10 min，流水沖洗，晾干。將配置好的0.2%茜素紅染液加入到固定好的細(xì)胞上， 置37 ℃水浴箱中染色10 min。去除染液，流水沖洗，100倍倒置顯微鏡下雙盲法染色結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)。

3.4Real-time PCR測(cè)定 按照總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書的使用步驟對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行總RNA的抽提;按照逆轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明將樣本mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。小鼠骨鈣素(osteocalcin,OC)上游引物5’-AGGAGGGCAATAAGGTAGTGAA-3’，下游引物5’-TACCGTAGATGCGTCTGTAGGC-3’，目的長(zhǎng)度165 bp；小鼠GAPDH上游引物5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3’，目的長(zhǎng)度148 bp。Real-time PCR反應(yīng)體系為25 μL，含cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，2× PCR Mix 12.5 μL，無(wú)核酸酶水9.5 μL。在ABI 7500 PCR儀上進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)， 每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔， 擴(kuò)增條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。進(jìn)行3次組內(nèi)重復(fù)后, 以公式2-ΔΔCt[ΔCt(待測(cè)樣本)=待測(cè)基因Ct-內(nèi)參照基因Ct，ΔΔCt=ΔCt(待測(cè)樣本)-ΔCt(對(duì)照樣本)]計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量[13]。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因數(shù)方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用LSD法(方差齊性)或 Dunnet-T3 法(方差不齊)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1各實(shí)驗(yàn)組中鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)

空白對(duì)照組細(xì)胞基本無(wú)結(jié)節(jié)染色，誘導(dǎo)組可見細(xì)胞外沉積的鈣被染成紅色鈣結(jié)節(jié)，呈陽(yáng)性反應(yīng)；30% U266上清干預(yù)組和30%無(wú)關(guān)序列RNAi U266上清干預(yù)組與BMP-2誘導(dǎo)組比較，鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。30%DKK1 RNAi U266上清干預(yù)組與30% U266上清干預(yù)組比較，鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而30%無(wú)關(guān)序列RNAi U266上清干預(yù)組與30% U266上清干預(yù)組比較，鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1、表1。

Figure 1. Calcium nodules in different groups in aninvitropreosteoblast induction system (alizarin red staining,×100).A：blank control group;B：BMP-2 induction group;C：U266 supernatant group;D：DKK1 RNAi U266 supernatant group;E：negative RNAi U266 supernatant group.

圖1體外前成骨細(xì)胞誘導(dǎo)體系實(shí)驗(yàn)各組鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果

表1各組鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)結(jié)果

Table 1. Calcium nodule count results in different groups (Mean±SD.n=3)

GroupCalciumnodulecountBlankcontrol0.750±0.250BMP-2induction13.250±1.493▲▲U266supernatant4.500±1.041DKK1RNAiU266supernatant9.000±1.472*NegativeRNAiU266supernatant5.000±0.408

▲▲P<0.01vsblank control group;*P<0.05vsU266 supernatant group.

2各實(shí)驗(yàn)組中OCmRNA的表達(dá)

SYBR real-time PCR結(jié)果顯示：與空白組比較，BMP-2誘導(dǎo)組OC mRNA有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與誘導(dǎo)組比較，30% U266上清干預(yù)組OC mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與30% U266上清干預(yù)組比較，30%DKK1 RNAi U266上清干預(yù)組OC mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而30%無(wú)關(guān)序列RNAi U266上清干預(yù)組OC mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2各組OCmRNA的相對(duì)表達(dá)量

Table 2. The expression of OC mRNA in different groups detected by real-time PCR (Mean±SD.n=3)

GroupΔCt 2-ΔΔCtBlankcontrol7.485±1.0211BMP-2induction4.368±0.988▲▲8.586U266supernatant6.662±0.473##1.760DKK1RNAiU266superna-tant5.103±0.249*5.195NegativeRNAiU266superna-tant7.271±1.140##1.156

▲▲P<0.01vsblank control group;##P<0.01vsBMP-2 induction group;*P<0.05vsU266 supernatant group.

討 論

骨髓瘤相關(guān)的骨病一直是MM治療的一個(gè)難題。其治療方法不外乎雙膦酸鹽藥物、放化療和手術(shù)治療，這些治療方法的目的在于預(yù)防骨相關(guān)事件的發(fā)生，延緩溶骨性病損的進(jìn)展和骨痛，只能控制癥狀。MBD的形成是破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)與成骨細(xì)胞抑制的結(jié)果。而且越來(lái)越多的研究表明單方面抑制破骨細(xì)胞的活性并不能有效改善骨質(zhì)破壞，成骨細(xì)胞的作用不容忽視。DKK1可以抑制成骨細(xì)胞，從而促成MBD的發(fā)生，而且有研究發(fā)現(xiàn)封閉DKK1可以直接影響腫瘤內(nèi)環(huán)境從而延緩腫瘤的生長(zhǎng)[10]，所以DKK1不論在MBD方面還是在腫瘤本身都是一個(gè)關(guān)鍵的因素。在本實(shí)驗(yàn)在體外成骨誘導(dǎo)體系中評(píng)估DKK1沉默后骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)前成骨細(xì)胞分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)代表成骨的相關(guān)基因表達(dá)水平明顯高于沉默前的水平，說(shuō)明成骨抑制情況明顯改善。無(wú)關(guān)序列RNAi與沉默前的成骨基因表達(dá)水平的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步說(shuō)明了DKK1 siRNA能較特異地與目的基因結(jié)合，具有特異性。

本實(shí)驗(yàn)為接下來(lái)更深入地探討多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的成骨抑制分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為臨床上靶向治療多發(fā)性骨髓瘤骨病提供了體外研究的理論依據(jù)。

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EffectofculturesupernatantofhumanmultiplemyelomacellswithDKK1genesilencingonosteogenicdifferentiationofmousepreosteoblasts

ZHANG Yu, YU Kang

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:yukang62@126.com)

AIM: To investigate the effect of Dickkopt-1 (DKK1) gene on myeloma bone disease.METHODSLentivirus was packed with pLenti6/V5-GW/DKK-1-miR plasmids and lentivirus packaging plasmids, and then transfected into human multiple myeloma cell line U266. Aninvitroosteogenic experiment was performed and the mouse MC3T3-E1 preosteoblasts were divided into blank control group, bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) induction group, U266 supernatant group,DKK1 RNAi U266 supernatant group and negative RNAi U266 supernatant group. All supernatants added to the cells were at the concentration of 30%. After culture for 12 d, the effects of different U266 cell supernatants on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells were investigated by alizarin red staining. The mRNA expression of osteocalcin (OC) was detected by real-time PCR.RESULTSCompared with blank control group, the mRNA expression of OC in BMP-2 induction group increased significantly. Compared with BMP-2 induction group, the mRNA expression of OC and the number of calcium nodule in U266 supernatant group were decreased. Compared with U266 supernatant group, the mRNA expression of OC and the number of calcium nodule inDKK1 RNAi supernatant group were significantly eleva-ted. In negative RNAi U266 supernatant group, OC mRNA and the calcium nodule did not change significantly.CONCLUSIONAfterDKK1 gene silencing in U266 cells by RNAi, the inhibition of osteogenic differentiation of mouse preosteoblasts significantly decreases.

Dickkopf-1 protein; Myeloma bone disease; Osteocalcin

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.029

1000- 4718(2013)06- 1129- 04

2013- 01- 17

2013- 05- 08

溫州醫(yī)學(xué)院 5010 重大項(xiàng)目子課題(No.XNK05005)

△通訊作者 Tel： 0577-55579489; E-mail: yukang62@126.com