王 超， 杜 展， 馬繼偉， 張 勇， 閆雍容， 鐘雪云

(暨南大學醫(yī)學院病理學系，廣東 廣州 510632)

離子霉素對SW480和SWO-38細胞中E-cadherin裂解的影響*

王 超， 杜 展， 馬繼偉， 張 勇， 閆雍容， 鐘雪云△

(暨南大學醫(yī)學院病理學系，廣東 廣州 510632)

目的觀察可促進鈣離子內(nèi)流的工具藥離子霉素(ionomycin)，對不同腫瘤細胞株SW480及SWO-38其C末端片段2(E-cad/CTF2)的表達裂解的影響。方法應用MTT法確定ionomycin作用于 SW480及SWO-38細胞的最佳濃度；Western blotting檢測ionomycin 作用不同時間后E-cadherin全長及其C末端片段2(E-cad/CTF2)的表達水平；共聚焦顯微鏡動態(tài)檢測SWO-38細胞胞內(nèi)Ca2+濃度變化。結果Ionomycin對SW480及SWO-38細胞均有細胞毒性作用，半數(shù)抑制濃度均為12 μmol/L，ionomycin可促進 SW480細胞中Ca2+濃度增加，E-cadherin裂解，E-Cad/CTF2片段水平升高，ionomycin沒有引起SWO-38細胞中的大量鈣內(nèi)流，對E-cadherin裂解沒有明顯作用。結論Ionomycin可促進鈣離子內(nèi)流，引起SW480腫瘤細胞E-cadherin裂解，但對SWO-38細胞E-cadherin裂解無明顯影響。

離子霉素； 鈣黏著蛋白類； 鈣內(nèi)流

上皮型鈣黏著蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)作為經(jīng)典鈣黏著蛋白家族中的重要成員，在多種腫瘤組織中表達，并與疾病的進展相關。經(jīng)凋亡或Ca2+內(nèi)流刺激，可引起E-cadherin的裂解，生成E-cadherin胞內(nèi)域片段并釋放β-catenin 及α-catenin至可溶性胞質，從而促進E-cadherin為基礎的黏附連接的分解，影響細胞間黏附、信號轉導等[1]。其中長為33 kD的E-cadherin C末端片段2(E-cadherin C-terminal fragment 2，E-Cad/CTF2)，可作為細胞間黏附和Wnt信號轉導通路之間轉換的中間橋梁，進一步影響通路下游靶向基因，全面影響腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展[2]。

離子霉素(ionomycin)是研究Ca2+對細胞內(nèi)各種生物效應調控機制的重要工具藥。有研究表明，ionomycin作用于野生型E-cadherin人皮膚基底細胞癌A431細胞，可促進E-Cad/CTF2的生成和增加，易化細胞間黏附連接的分解以及抑制β-catenin與下游靶向分子的結合[1]。但是關于ionomycin能否促進其它腫瘤細胞中E-cadherin的裂解及其機制，目前尚不清楚。本研究采用ionomycin作用于高表達E-cadherin的SW480及SWO-38細胞，分析對比了 ionomycin在不同腫瘤細胞中裂解E-cadherin的能力及原因，以期對ionomycin 促進鈣離子內(nèi)流導致E-cadherin水解而裂解在腫瘤發(fā)展中的作用有更深入的了解。

材 料 和 方 法

1材料

人腦膠質瘤細胞SWO-38系由暨南大學醫(yī)學院病理教研室自行建立[3]。人結腸癌細胞SW480系由南方醫(yī)科大學病理系實驗室贈予。Ionomycin購自Sigma。細胞培養(yǎng)基RPMI-1640和滅活胎牛血清購自Gibco。MTT購自Sigma。細胞裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術公司。Western blotting檢測所用特異性針對E-cadherin胞內(nèi)域的鼠抗人E-cadherin(C36)抗體購自BD。兔抗人α-tubulin抗體購自CST。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠、羊抗兔IgG購自杭州聯(lián)科公司。增強型化學發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)購自Pierce。Fura-3/AM探針購自碧云天生物技術公司。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) SWO-38及SW480細胞均采用含有10%滅活胎牛血清及1×105IU/L雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。采用含 EDTA的0.25%蛋白胰酶消化傳代。培養(yǎng)24 h后，向細胞中加入ionomycin等處理因素。

2.2MTT法篩選ionomycin的最佳作用濃度 選擇對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的SWO-38及SW480細胞，取1.5×107/L 細胞接種于96 孔板，約24 h后，加入配制好的ionomycin液，濃度分別為3、6、12、24、46 μmol/L，并設置對照組及空白調零孔，每組5個復孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45 min后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器上振蕩10 min。選取570 nm波長，在酶標儀上測定吸光度(A)，按公式計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=(A對照組-A處理組)/A對照組×100%。IC50定義為細胞抑制率為50%時的作用濃度。

2.3Western blotting法檢測E-cadherin全長及E-Cad/CTF2蛋白表達 SWO-38 及SW480細胞，均加入12 μmol/L ionomycin，分別培養(yǎng)0、45、90 min。按BCA蛋白提取試劑盒說明書操作，提取細胞總蛋白并測定其濃度，每個泳道加入20 μg 蛋白進行SDS-PAGE電泳。之后濕轉將蛋白轉至NC膜，需60 min。5%脫脂牛奶室溫封閉60 min后剪下包含目的蛋白的NC膜，加入相應的Ⅰ抗，包括抗E-cadherin(1∶1 000)和α-tubulin(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。采用ECL發(fā)光系統(tǒng)顯色，掃描膠片，BI-2000 圖像分析系統(tǒng)測量分析各條帶的積分吸光度值。

2.4共聚焦顯微鏡檢測胞內(nèi)游離鈣離子濃度 SWO-38細胞稀釋至1×108/L，加入共聚焦皿；培養(yǎng)24 h后，將5 μmol/L Fura-3/AM加入皿中，避光室溫孵育30 min。PBS清洗2次后，加入溶有12 μmol/L ionomycin的培養(yǎng)液，于共聚焦顯微鏡下連續(xù)觀測48 min。激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為530 nm，掃描點數(shù)為512 × 512，掃描速度每30 s 1張。采用Zeiss LSM Image Browser軟件分析熒光強度，取單個細胞的熒光強度測定值的平均數(shù)代表細胞內(nèi)游離Ca2+濃度。

3統(tǒng)計學處理

SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用兩樣本t檢驗及單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1Ionomycin最佳作用濃度

不同濃度ionomycin(3、6、12、24和46 μmol/L)分別作用于SWO-38和SW480細胞45 min后，與對照組比較，隨著ionomycin作用濃度的升高，各實驗組細胞抑制率升高，細胞抑制率差異均有統(tǒng)計學意義，見圖1。SW480及SWO-38細胞的 IC50均為12 μmol/L。上述結果表明ionomycin在這2種腫瘤細胞中具有細胞毒性且呈濃度依賴性。

2Ionomycin可促進SW480細胞中E-cadherin裂解

Ionomycin采取IC50的濃度作用于SW480及SWO-38細胞,45及90 min后分別提取蛋白進行Western blotting檢測。結果顯示，SW480細胞E-cadherin 蛋白全長片段表達水平逐漸下降(P<0.05)，相反的，E-Cad/CTF2表達水平逐漸上升(P<0.05)，見圖2；SWO-38細胞E-cadherin蛋白全長片段表達水平?jīng)]有顯著變化(P>0.05)，E-Cad/CTF2則沒有出現(xiàn)，見圖3。上述結果表明，ionomycin只能促進部分腫瘤細胞E-cadherin的裂解。

Figure 1. The inhibitory rates of the cells after treatment with ionomycin for 45 min. A: SW480 cells; B: SWO-38 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖1MTT法檢測ionomycin對細胞的毒性

Figure 2. The levels of full-length E-cadherin and E-Cad/CTF2 in SW480 cells detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 min.

圖2Westernblotting檢測SW480細胞中E-cadherin全長及E-Cad/CTF2的水平

Figure 3. The levels of full-length E-cadherin and E-Cad/CTF2 in SWO-38 cells detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.

圖3Westernblotting檢測SWO-38細胞中E-cadherin全長及E-Cad/CTF2的水平

3共聚焦顯微鏡監(jiān)測ionomycin作用后細胞內(nèi)Ca2+變化

為了進一步探究ionomycin對SWO-38細胞的作用，采用鈣離子熒光探針 Fura-3/AM檢測細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化。共聚焦顯微鏡下可觀察到，SWO-38細胞呈多角形，可探測到的綠色熒光較弱，均勻分布于胞內(nèi)，有少量可聚集，見圖4。經(jīng)連續(xù)觀測，12 μmol/L ionomycin作用后，SWO-38細胞胞內(nèi)的游離Ca2+濃度除了在60和210 s形成2個微弱的高峰(P>0.05)外，整體反而呈逐漸下降的趨勢，見圖5、表1。上述結果表明ionomycin不能促進SWO-38細胞的鈣內(nèi)流。

討 論

E-cadherin被形容為可介導細胞黏附的經(jīng)典黏附蛋白，在機體正常發(fā)育中起基本作用，在腫瘤形成和進展中其調控多已紊亂[4-5]。在機體正常發(fā)育或傷口愈合、鈣離子內(nèi)流、細胞凋亡的進程中，E-cadherin可通過水解而裂解，將幾乎整個胞內(nèi)域結構釋放，從而促進細胞遷移及改變所參與的信號通路的狀態(tài)[6]。其中，利用ionomycin促進鈣離子內(nèi)流，可引起E-cadherin裂解，E-Cad/CTF2出現(xiàn)并增加[1, 7]，但現(xiàn)有的研究大多局限于上皮細胞的生理性研究或少數(shù)上皮性質的癌細胞中，對于E-cadherin在其它腫瘤中因鈣內(nèi)流引起的水解變化及影響鮮有涉及。因此，論證此過程在其它腫瘤細胞中是否可行，變得尤為重要。

Figure 4. Changes of cytosolic Ca2+concentration in Fura-3/AM-loaded SWO-38 cells under confocal microscope. A: fluorescent image; B: phase-contrast image.

圖4共聚焦顯微鏡下Fura-3/AM探針探測SWO-38細胞胞內(nèi)Ca2+濃度的變化

Figure 5. The fluorescence intensity indicated a slight decrease in the cytosolic Ca2+concentration in Fura-3/AM-loaded SWO-38 cells after exposure to 12 μmol/L ionomycin. It reached the peak at 60 and 210 s (arrows).

圖5Ionomycin對SWO-38細胞胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

本研究選擇E-cadherin相對表達較高的人結腸癌SW480細胞及人腦膠質瘤SWO-38細胞，作為研究對象。經(jīng)MTT法檢測，ionomycin對2種腫瘤細胞均有細胞毒性作用，且呈濃度依賴性。經(jīng)篩選，采用IC50作為接下來實驗的作用濃度。Ionomycin作為最具代表性的促進鈣離子內(nèi)流藥物，被廣泛應用：ionomycin可誘導氨基末端激酶和p38的生成[8]；ionomycin對卵子激活和胚胎發(fā)育有負面影響[9]；采用ionomycin可增加SH-SY5Y細胞中N-cadherin的分裂片段N-Cad/CTF2的增加[10]。本實驗同樣證明，ionomycin可通過促進鈣離子內(nèi)流，引起SW480細胞中 E-cadherin的裂解，E-Cad/CTF2片段出現(xiàn)，并且E-cadherin全長片段表達逐漸降低，E-Cad/CTF2隨著ionomycin作用時間的延長而增多。然而，SWO-38細胞的結果與預期的并不相符，同樣條件的ionomycin作用于細胞株，并沒有減少E-cadherin全長片段的表達，也沒有通過全長片段的分解生成E-Cad/CTF2或其它任何長度的E-cadherin片段。為了進一步研究其中的原因，我們采用 Fura-3/AM鈣離子熒光探針動態(tài)監(jiān)測了ionomycin作用于SWO-38細胞，其胞內(nèi)游離鈣離子的變化。實驗結果表明，除了在60和210 s時點胞內(nèi)游離Ca2+濃度輕微升高以外，整體的鈣離子濃度隨著ionomycin作用時間的延長逐漸下降，換言之，ionomycin并沒有大量促進SWO-38細胞中鈣離子的內(nèi)流，這也同時印證了E-Cad/CTF2片段沒有出現(xiàn)的原因。有針對ionomycin作用機制進行研究的文獻表明，ionomycin促進鈣離子內(nèi)流可因其作用濃度不同而分為2種方式，即 Ca2+/H+交換和鈣池調控鈣離子通道，涉及到去極化、胞外鈣離子濃度所形成的推動力，是一項復雜的過程[11]。我們推測SWO-38細胞可能由于欠缺這些條件或本身細胞結構已發(fā)生變化，而不具備ionomycin能夠起效的環(huán)境。

表1不同時點ionomycin對SWO-38細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

Table 1. Effects of ionomycin on cytosolic Ca2+concentration in SWO-38 cells at different time points(Mean±SD.n=10)

Time(s)Fluorescenceintensity017.33±7.126017.48±7.2621017.42±7.3151016.07±6.5281015.23±5.95111013.52±5.05141014.79±5.87171013.65±5.87201013.33±5.65231013.11±5.25261012.52±4.49

許多研究表明，E-Cad/CTF2的產(chǎn)生，可將E-cadherin為基礎的細胞間黏附與Wnt信號通路聯(lián)系起來。E-Cad/CTF2的氨基末端序列證實，E-cadherin 的裂解發(fā)生在跨膜和胞質域的接觸面，符合PS1/γ-酶介導的裂解[1]。E-Cad/CTF2的生成，導致與E-cadherin結合的β-catenin自細胞骨架釋放，易位入核；E-Cad/CTF2與β-catenin保持結合狀態(tài)，從而抑制β-catenin降解并有效地抑制其反式激活的能力[12]。β-catenin無法與核中淋巴細胞增強結合因子結合，使得下游的重要靶向基因cyclin D1等無法被激活，從而抑制細胞周期、細胞遷移等[13]。我們接下來的研究重點將集中于ionomycin作用引起SW480細胞中 E-Cad/CTF2出現(xiàn)后，會引發(fā)怎樣一系列改變，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展會有哪些影響。

本實驗結果顯示，ionomycin對腫瘤細胞普遍具有細胞毒性；可通過鈣內(nèi)流，引起一部分腫瘤細胞株中E-cadherin的裂解，生成代表胞內(nèi)域片段的E-Cad/CTF2；但并不是所有表達E-cadherin的腫瘤細胞株具備ionomycin作用的環(huán)境，能在其使用后進行E-cadherin的水解而分裂成不同片段。綜上所述，本實驗為ionomycin 促進鈣離子內(nèi)流在腫瘤細胞株中的作用有了全面的了解，對E-cadherin的水解作用機制進行了深入探索，為不同腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子進程提出了新的視角。

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EffectsofionomycinoncleavageofE-cadherininSW480cellsandSWO-38cells

WANG Chao, DU Zhan, MA Ji-wei, ZHANG Yong, YAN Yong-rong, ZHONG Xue-yun

(DepartmentofPathology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzxy@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effect of ionomycin on the cleavage of E-cadherin in SW480 cells and SWO-38 cells.METHODSMTT assay was used to determine the optimal concentration of ionomycin for SW480 cells and SWO-38 cells. The levels of full-length E-cadherin and E-cadherin C-terminal fragment 2 (E-Cad/CTF2) after ionomycin treatment at different time points were detected by Western blotting. The variation of cytosolic free calcium concentration in SWO-38 cells after treatment with ionomycin was monitored under confocal microscope.RESULTSIonomycin had cytotoxic effect on SW480 cells and SWO-38 cells. The IC50for both cell lines was 12 μmol/L. Treatment with ionomycin resulted in increased cytosolic free calcium concentration in SW480 cells, leading to cleavage of E-cadherin and increasing the level of E-Cad/CTF2. However, ionomycin did not induce significant calcium influx in SWO-38 cells. Consequently, the cleavage of E-cadherin was not detectable.CONCLUSIONIonomycin triggers calcium influx and induces cleavage of E-cadherin in SW480 cells.

Ionomycin; Cadherins; Calcium influx

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.027

1000- 4718(2013)06- 1119- 05

2013- 01- 21

2013- 04- 28

國家自然科學基金資助項目 (No. 81072059)；國家自然科學基金青年基金資助項目(No. 81101652)；廣東省高等學?？萍紕?chuàng)新重點項目(No. CXZD1110)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 10151063201000059)

△通訊作者 Tel： 020-85228363； E-mail： tzxy@jnu.edu.cn