孟愛宏， 凌亦凌， 張霄鵬

(1河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院呼吸科， 2河北醫(yī)科大學 病理生理教研室， 3河北省人民醫(yī)院, 河北 石家莊 050000)

p38 MAPK 和STAT3參與CCK-8抑制LPS誘導的大鼠促炎癥細胞因子生成*

孟愛宏1△， 凌亦凌2， 張霄鵬3

(1河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院呼吸科，2河北醫(yī)科大學 病理生理教研室，3河北省人民醫(yī)院, 河北 石家莊 050000)

目的觀察八肽膽囊收縮素(CCK-8)是否改善脂多糖(LPS)引起的大鼠細胞因子的變化，并探討p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)的信號轉(zhuǎn)導作用，以及CCK受體(CCK-R)的作用。方法4組大鼠尾靜脈分別注入生理鹽水(對照)、LPS (8 mg/kg)、CCK-8(40 μg/kg)和CCK-8(40 μg/kg)+LPS (8 mg/kg)， 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清、肺臟及脾臟中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和IL-6的變化，Western blotting和免疫熒光雙標激光共聚焦顯微鏡檢測肺臟和脾臟磷酸化p38 MAPK和磷酸化STAT3的表達，RT-PCR檢測脾臟CCK-R亞型的mRNA表達。結果CCK-8可顯著抑制LPS誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6的增加。CCK-8可增加LPS誘導的大鼠肺臟和脾臟磷酸化p38 MAPK和磷酸化STAT3的表達。LPS有誘導CCK-AR及CCK-BR mRNA表達量增加的作用。結論CCK-8對LPS刺激的大鼠促炎癥細胞因子過量產(chǎn)生有抑制作用，p38 MAPK和STAT3可能參與了其信號轉(zhuǎn)導機制。LPS刺激時，CCK-R受體發(fā)生正向調(diào)節(jié)，CCK-8有可能用于治療全身性感染及其它的炎癥性疾病。

膽囊收縮素； 脂多糖類； 細胞因子； p38 MAPK； 信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄激活子3； 大鼠

八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)有抗內(nèi)毒素休克(endotoxic shock, ES)作用，即改善脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所致大鼠平均動脈壓下降，減輕肺臟和脾臟損傷，這種作用可能與其抑制促炎介質(zhì)的過量生成有關[1-2]。CCK-8抗炎效應的信號轉(zhuǎn)導機制可能與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和核因子(nuclear factor-κB, NF-κB)有關[3-4]。叢斌等[5]研究表明CCK-8可抑制LPS誘導的大鼠肺組織NF-κB活性。信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription, STATs)是一組胞漿轉(zhuǎn)錄因子，在介導胞漿到胞核的信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮關鍵作用[6]。STATs不僅被細胞因子受體家族激活，還被幾種受體包括G蛋白偶聯(lián)受體激活[7]。CCK受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體，CCK是否可激活STAT極少報道。叢斌等[8]用原位PCR方法檢測到SD大鼠肺組織有CCK受體基因表達。而正常及LPS刺激大鼠脾臟CCK受體是否表達尚未見報道。我們體外研究發(fā)現(xiàn)CCK-8可使大鼠肺泡巨噬細胞p38 MAPK 激活、STAT3激活和核轉(zhuǎn)移，這可能與其抑制LPS誘導的細胞因子過量產(chǎn)生有關[9]。CCK-8對LPS刺激的大鼠體內(nèi)p38 MAPK 和STAT3激活是否有影響尚未見報道。 本實驗旨在觀察CCK-8對LPS誘導的大鼠肺臟和脾臟細胞因子即腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6生成的影響，探討p38 MAPK和STAT3的信號轉(zhuǎn)導作用及CCK-A/B受體(CCK-AR和CCK-BR)的表達。

材 料 和 方 法

1材料

1.1材料與試劑 CCK-8(硫酸化)、LPS(E.coliLPS, serotype O111:B4)、亮抑肽酶、胃蛋白酶抑制劑、過硫酸胺、Triton X-100、鼠抗磷酸化p38 MAPK單克隆抗體、兔抗磷酸化STAT3(磷酸化727)抗體和Cy3標記羊抗小鼠IgG均購自Sigma，抑肽酶購自Boehringer。辣根酶標記山羊抗小鼠IgG和辣根酶標記山羊抗兔IgG購自北京中山生物技術有限公司。FITC標記羊抗兔熒光試劑盒購自博士德公司。逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機引物、核糖核酸酶抑制劑、Taq DNA 聚合酶、瓊脂糖均購自Promega。檢測TNF-α的ELISA試劑盒購自Medsystem。檢測IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒購自Endogen。其余試劑為分析純。

2方法

2.1動物模型復制及分組 健康雄性SD大鼠36只(河北省實驗動物中心提供)，體重150～200 g，尾靜脈給藥，分為：(1) 對照組：注入等量生理鹽水；(2) LPS組：注入LPS(8 mg/kg)；(3) CCK-8+LPS組：注入LPS前10 min注入CCK-8 (40 μg/kg)；(4) CCK-8組：注入等量CCK-8(40 μg/kg) 。

2.2ELISA檢測血清、肺臟和脾臟中細胞因子 注藥后2 h或6 h放血處死動物，迅速摘取肺臟和脾臟，用PBS洗去血，并將2 h和6 h血液以1 500 r/min離心收集血清，標本存于-80 ℃冰箱待分析。按文獻報道和本實驗室預實驗使用大鼠ELISA試劑盒分別檢測血清、肺臟和脾臟組織上清的細胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量。各組實驗動物均為6例。

2.3Western blotting檢測肺臟和脾臟磷酸化p38 MAPK和磷酸化STAT3的表達 注入LPS后30 min迅速摘取肺臟和脾臟，Western blotting方法檢測磷酸化p38 MAPK和磷酸化STAT3，具體方法參照我們已發(fā)表的文獻[2]，使用凝膠蛋白分析軟件分析Western blotting結果。使用成像分析系統(tǒng)進行磷酸化p38 MAPK和磷酸化STAT3表達的相對定量分析。

2.4免疫熒光雙標激光共聚焦顯微鏡觀察肺臟和脾臟磷酸化p38 MAPK和磷酸化STAT3的表達 注藥后30 min迅速摘取肺臟和脾臟，液氮凍存，貯存于-80 ℃。冰凍切片機制片，厚度8 μm。將冰凍切片與小鼠單克隆抗p38 MAPK抗體(1∶2 000)和兔抗磷酸化STAT3抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過夜。加Cy3標記抗小鼠IgG (1∶100)和抗兔IgG (1∶100)室溫孵育1 h，然后加SABC-FITC (1∶100) 室溫孵育1 h，每步加試劑前PBS洗3次，每次5 min。用激光共聚焦顯微鏡552 nm和488 nm波長觀察分析結果。p38陽性細胞為紅色熒光標記，STAT3陽性細胞為綠色熒光標記。結果用Lasersharp 2.1軟件進行處理，計數(shù)雙陽性細胞數(shù)。

2.5脾臟CCK-AR和CCK-BR mRNA的表達 15只大鼠隨機分為對照組和LPS 30 min、2 h、6 h、12 h組，模型復制方法同前。CCK受體引物序列參照Monstein等[10]的報道，由上海生物工程公司合成。提取脾組織總RNA，定量，合成cDNA第1鏈之后行CCK-AR及CCK-BR cDNA PCR擴增。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預變性 2 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s,循環(huán)5次；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。CCK-A/BR擴增目的片段長度分別為630 bp和320 bp。同時擴增鼠β-actin作為內(nèi)參照，擴增的目的片段長度為420 bp。RT-PCR產(chǎn)物分析：用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer 3.0)分析結果，取其積分吸光度值(IA)，以CCK-AR/β-actin和CCK-BR/β-actin的IA比值為各自的相對表達水平。

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS軟件進行分析，組間差異用單因素方差分析(One-way ANOVA)，有顯著差異者用SNK-q檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

我想勸她幾句。她卻立刻止住了哭，說，你走吧，各人有各人的命。不過，這一天我過得非常真誠，非常痛快，多少年也沒這樣了，真的。

結 果

1血清細胞因子水平

LPS組2 h時血清TNF-α水平較對照組顯著增加，CCK-8+LPS組TNF-α含量較LPS組顯著減少(P<0.05)。LPS組 6 h血清IL-1β和IL-6水平顯著增加，CCK-8顯著抑制LPS誘導的IL-1β和IL-6濃度的增加(P<0.05)，CCK-8組與對照組比較血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均無顯著差異，見表1。

2組織細胞因子水平

注入LPS 2 h后脾臟TNF-α含量顯著高于對照動物(P<0.01)。而CCK-8顯著抑制LPS誘導的TNF-α的增加(P<0.01)。LPS 注入后2 h肺臟TNF-α可見相似的結果。CCK-8預處理減輕了LPS注入后6 h誘導的肺臟和脾臟IL-1β和IL-6含量的增加。注入CCK-8與注入生理鹽水組比較TNF-α和IL-6含量未見顯著差異，但IL-1β含量高于對照組，見表1。

表1ELISA檢測LPS刺激2或6h血清、肺臟和脾臟TNF-α、IL-1β和IL-6水平

Table 1. The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the serum, lung and spleen after stimulated by LPS for 2 h or 6 h detected by ELISA (ng/L.Mean±SD.n=6)

GroupTNF-α(2h)IL-1β(6h)IL-6(6h)Serum Control0.000.00128.49±22.06 LPS276.71±86.43**43.19±9.41** 3566.92±686.95** CCK-8+LPS12.29±12.29##0.00##1796.55±68.97**## CCK-80.000.0083.59±44.88Lung Control69.28±54.870.00±0.0096.58±20.06 LPS385.87±85.18**4049.91±613.79**1196.77±494.60** CCK-8+LPS179.77±15.51*##3292.68±68.95**#543.44±97.24# CCK-861.83±32.26698.34±77.01*112.88±6.67Spleen Control281.58±29.801047.40±21.37115.84±11.57 LPS940.83±149.40**5183.56±84.91**1203.12±49.29** CCK-8+LPS461.60±87.38##4636.08±277.48**#389.18±50.44**## CCK-8204.60±76.364369.09±342.50**##199.17±39.77

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS.

3Westernblotting檢測大鼠肺臟和脾臟磷酸化p38MAPK和STAT3

Western blotting檢測大鼠肺臟和脾臟磷酸化p38 MAPK，LPS組可見明顯的38 kD條帶，IA值分別為對照組的2.34倍和5.84倍(P<0.01)。CCK-8+LPS組亦可見更為顯著的磷酸化p38 MAPK表達，IA值分別為對照組的2.57倍和10.74倍，較LPS組顯著增加(P<0.01)。對照組與CCK-8組均可見較弱的38 kD條帶，CCK-8組分別為對照組的1.33倍和4.64倍(P<0.05)。上述結果提示LPS可引起大鼠肺臟和脾臟顯著的p38 MAPK磷酸化，CCK-8顯著增強LPS誘導的p38 MAPK磷酸化，見圖1、表2。

Figure 1. p38 MAPK and STAT3 were activated and phosphorylated by LPS and enhanced by CCK-8 in rat lung and spleen tissues.1: control; 2:LPS (8 mg/kg); 3: CCK-8 (40 μg/kg) +LPS (8 mg/kg); 4: CCK-8 (40 μg/kg).

圖1Westernblotting檢測大鼠p38MAPK和STAT3磷酸化水平

表2Westernblotting檢測p38MAPK和STAT3磷酸化水平

Table 2. Phosphorylation of p38 MAPK and STAT3 detected by Western blotting (IA.Mean±SD.n=3)

GroupLungSpleenp-p38MAPK Control6521.07±464.45984.28±214.45 LPS14645.00±907.38**5749.07±764.27** CCK-8+LPS16804.33±832.83**##10572.60±2875.98**## CCK-88348.33±531.79*4569.33±1200.76*p-STAT3 Control13.46±3.3931.31±11.39 LPS23.99±3.88**124.94±31.84** CCK-8+LPS31.20±2.60**##177.24±19.05**## CCK-820.57±2.00**80.01±23.47*#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS.

Western blotting檢測大鼠肺臟絲氨酸磷酸化STAT3，LPS組可見明顯的89 kD條帶，IA值為對照組的1.78倍，P<0.01。CCK-8+LPS組亦可見更為明顯的條帶，為對照組的2.32倍(P<0.01)。對照組與CCK-8組均可見較弱的條帶，CCK-8組為對照組的1.53倍(P<0.01)。檢測大鼠脾臟絲氨酸磷酸化STAT3，LPS組可見明顯條帶，IA值為對照組的4倍(P<0.01)。CCK-8+LPS組IA值為對照組的5.66倍(P<0.01)。對照組與CCK-8組均可見較弱的條帶，CCK-8組為對照組的2.56倍(P<0.05)，見圖1、表2。

4激光共聚焦顯微鏡結果

激光共聚焦顯微鏡分析磷酸化p38 MAPK和磷酸化STAT3免疫熒光雙標結果顯示，CCK-8+LPS組和CCK-8組可見磷酸化STAT3陽性信號強于對照組和LPS組。p-STAT3陽性細胞主要分布在氣道上皮。p-p38 MAPK陽性信號主要分布在肺間質(zhì)和脾竇內(nèi)皮，見圖2。

Figure 2. Laser scanning confocal microscopic observation of phosphorylated p38 MAPK and phosphorylated STAT3 in the lung and spleen of rats. A, B, C, D:×400; E, F, G, H:×800. A, E: control; B, F: CCK-8+LPS; C, G: LPS; D, H: CCK-8.

圖2激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠肺臟和脾臟磷酸化p38MAPK和磷酸化STAT3

5CCK-AR和CCK-BR表達

LPS使大鼠脾臟CCK-AR和CCK-BR表達上調(diào)。CCK-AR平均表達水平，對照組為(35.61±4.88)%，LPS組除30 min外，2 h、6 h和12 h組較對照組均顯著增加(P<0.01)；CCK-BR平均表達水平，對照組為(22.56±4.88)%，LPS組30 min為(31.24±3.59)%(P<0.05)，2 h、6 h和12 h較對照組均顯著增加(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. Alterations of relative expression quantity of CCK-AR and CCK-BR mRNA in the spleen of rats detected by RT-PCR. L30,L2,L6 and L12: 30 min, 2 h, 6 h and 12 h after LPS administration.M:marker.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3RT-PCR檢測大鼠脾臟CCK-AR和CCK-BRmRNA表達量

討 論

CCK-8可激活心肌組織的CCK受體,引起劑量依賴性的心功能增加和心率改變[11]。CCK-8的抗損傷和抑制促炎介質(zhì)過量生成的作用是否由CCK受體介導及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制尚不十分清楚。本實驗表明p38 MAPK和STAT3參與其信號轉(zhuǎn)導作用。對p38在免疫系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用進行了大量研究，許多刺激可激活p38，包括LPS、G蛋白偶聯(lián)受體、毒蕈堿激動劑、血管活性肽、CCK等。p38的活化不僅依賴刺激劑而且依賴細胞類型。亞致死量失血誘導大鼠對ES耐受時，大鼠肺組織p38 MAPK激活，用LPS“第二次打擊”，耐受細胞產(chǎn)生TNF-α減少而p38 MAPK活性保持正常，提示p38 MAPK途徑是誘導耐受必需的[12]。本實驗中CCK-8有可能通過激活p38 MAPK途徑從而誘導大鼠對ES的耐受，使細胞因子產(chǎn)生減少。p38的作用可能存在微妙的平衡，即LPS單獨處理引起輕微的細胞激活，刺激TNF-α合成，而CCK-8和LPS共同刺激，p38雖過度激活，但可能通過其它信號途徑進而抑制TNF-α產(chǎn)生。有報道一氧化碳有抗炎效應，抑制LPS誘導的TNF-α表達，而增強LPS誘導的p38 MAPK信號途徑[13]。CCK-8對LPS誘導TNF-α產(chǎn)生的這種調(diào)節(jié)，顯示TNF-α表達的分子調(diào)控的復雜性。LPS誘導的TNF-α生成主要但并不完全受p38 MAPK信號途徑調(diào)節(jié)。其它信號途徑可能也參與調(diào)節(jié)。幾種MAPK途徑相互作用調(diào)節(jié)細胞因子基因表達。CCK-8可使LPS誘導的血紅素氧合酶(heme oxygenase-1 , HO-1) mRNA陽性表達信號進一步增強，CCK-8單獨作用也可上調(diào)HO-1表達。c-Jun氨基末端激酶/c-Jun通路在CCK-8上調(diào)LPS誘導肺組織HO-1表達過程中發(fā)揮重要作用[14]。本實驗給予LPS后肺臟和脾臟IL-6的增加較血清低，相反，IL-1β含量的增加較血清高。CCK-8組與對照組比較血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均無顯著差異，但肺臟和脾臟IL-1β含量高于對照組，提示肺臟和脾臟細胞因子含量與循環(huán)細胞因子水平增加程度分離或相關性很小。Cunningham等[15]報道CCK-8刺激單核細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6，但相對LPS的反應弱。但以后的研究[16]提示CCK-8誘導的細胞因子增加可能是由于在培養(yǎng)基中檢測到的內(nèi)毒素或LPS所引起。本實驗未檢測肺臟或脾臟中的內(nèi)毒素或LPS含量，因此不能明確是否與此有關。另有研究證實CCK-8可能通過抑制LPS刺激的小鼠IL-1β、IL-6的表達和進一步增加IL-4、IL-10的表達參與抗炎反應過程，從而減輕LPS引起的肺組織炎癥反應[17]。CCK-8的抗炎作用是通過激活cAMP-蛋白激酶A信號通路進而抑制NF-κB活性來實現(xiàn)的[18]。本實驗表明CCK-8增強LPS誘導的p38激活，也表明p38 MAPK過度活化對細胞因子基因表達可能有負性調(diào)控作用。

叢斌等[5]研究表明CCK-8抑制LPS誘導的大鼠肺臟NF-κB活性。水楊酸鈉抑制LPS刺激的巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α，激活p38 MAPK而抑制ERK1/ERK2和SAPK/JNK[19]。這與本實驗Western blotting結果一致，即CCK-8增強LPS誘導的p38 MAPK激活。MAPK家族各亞型可能存在相反作用，它們之間可能存在特異的相互作用[20]。CCK-8是否通過增強磷酸化p38 MAPK表達而反饋抑制其它MAPK亞型有待進一步探討。

STATs蛋白是一組胞漿轉(zhuǎn)錄因子，在介導胞漿到胞核的信號中發(fā)揮關鍵作用。STAT蛋白絲氨酸磷酸化是獲得最大程度的酪氨酸磷酸化、DNA結合和(或)轉(zhuǎn)錄活性所必需的。相反，也有研究表明STAT蛋白絲氨酸磷酸化可抑制酪氨酸磷酸化，還有其它研究提示絲氨酸磷酸化對酪氨酸磷酸化或DNA結合無影響。本實驗應用兔抗磷酸化STAT3(Ser 727)抗體，用Western blotting方法發(fā)現(xiàn)CCK-8可激活STAT3，使之發(fā)生Ser727磷酸化，但對STAT的轉(zhuǎn)錄活性有何影響有待進一步研究。受體或有關蛋白激活不同STATs與細胞特異性有關，即使2種配體激活同一STAT或同一系列STATs，它們激活的數(shù)量及時間也不同，數(shù)量、時間變化可產(chǎn)生截然不同的作用，因而產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄效果。有報道缺乏STAT3的突變小鼠對ES高度敏感，血清炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6濃度增加；STAT3缺乏的巨噬細胞顯示不正常的活化表型，如對內(nèi)毒素反應炎癥細胞因子產(chǎn)生增加。STAT3激活是小鼠防止慢性炎癥不可缺少的。我們的結果也提示CCK-8激活STAT3可能是其抗ES效應的信號轉(zhuǎn)導途徑之一。

本實驗用RT-PCR方法對LPS組及對照組大鼠脾組織CCK-AR及CCK-BR mRNA進行了分析，結果顯示，正常大鼠脾組織有CCK-R表達，CCK-AR表達強于CCK-BR，LPS有誘導CCK-AR及CCK-BR mRNA表達量增加的作用。RT-PCR可檢測很低量的mRNA。由于許多細胞中可觀察到低水平的非特異轉(zhuǎn)錄，陰性結果可確實排除某組織中特異性激素受體的表達。叢斌等[8]首次應用原位RT-PCR方法檢測CCK受體基因在SD大鼠肺組織中的表達，顯示SD大鼠肺組織中CCK-BR表達量多于CCK-AR。

脾臟中存在豐富的CCK-8，但對其免疫調(diào)節(jié)效應研究很少。本實驗表明大鼠脾臟存在CCK受體。CCK-R分布的廣泛性，代表了其生理功能的多樣性。CCK發(fā)揮作用首先需與靶細胞膜上的特異受體結合。CCK受體存在多種結構類型，并介導不同的生物學效應。CCK-AR活化后可激活磷酸肌醇代謝途徑產(chǎn)生消化酶分泌效應，還可激活腺苷酸環(huán)化酶途徑，但生理劑量的CCK通過此途徑不產(chǎn)生分泌效應。關于CCK受體在免疫系統(tǒng)細胞上的表達和功能意義所知甚少。CCK調(diào)節(jié)免疫細胞功能可能通過CCK-BR而不是CCK-AR影響淋巴細胞功能。CCK-BR與磷脂酶C激活、細胞內(nèi)鈣移動及MAPK激活偶聯(lián)，而這些都是參與淋巴細胞活化的信號。

本實驗觀察到在大鼠脾臟內(nèi)有CCK受體表達，且LPS刺激30 min和2 h CCK受體表達已增加，6 h達高峰，12 h開始下降。CCK受體在脾臟內(nèi)的表達可能具有以下保護性作用：調(diào)整脾臟中淋巴細胞和巨噬細胞在LPS引起的炎癥反應中的促炎作用，此作用可能是通過細胞內(nèi)信息傳遞過程來調(diào)整細胞因子的產(chǎn)生和分泌，而實現(xiàn)減輕炎癥反應和促進受損細胞的修復。

通過本實驗結果可以認為，內(nèi)毒素在對機體致?lián)p傷的同時也啟動了機體的保護機制，CCK-AR及CCK-BR mRNA表達增加，是該保護機制之一。CCK-8具有抗細胞損傷及促進細胞生長的作用。我們之前的實驗觀察到CCK-8可改善內(nèi)毒素引起的肺、脾組織形態(tài)變化，支持上述觀點。LPS刺激時，CCK受體發(fā)生正向調(diào)節(jié)，為揭示CCK-8抑制LPS所致促炎介質(zhì)過量生成、減輕臟器損傷的分子機制提供了實驗依據(jù)。CCK-8有增強LPS誘導的大鼠肺臟和脾臟p38 MAPK和STAT3磷酸化的作用，初步提示了CCK-8抑制LPS誘導細胞因子生成的信號轉(zhuǎn)導途徑。本實驗提示 CCK-8有可能用于治療全身性感染及其它的炎癥性疾病。

[1] Ling YL, Meng AH, Zhao XY, et al. Effect of cholecystokinin on cytokines during endotoxic shock in rats[J]. World J Gastroenterol, 2001,7(5): 667-671.

[2] Meng AH, Ling YL, Zhang XP, et al. CCK-8 inhibits expression of TNF-α in the spleen of endotoxic shock rats and signal transduction mechanism of p38 MAPK[J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(1): 139-143.

[3] Meng AH, Ling YL, Zhang XP, et al. Anti-inflammatory effect of cholecystokinin and its signal transduction mechanism in endotoxic shock rat[J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(4): 712-717.

[4] 魏春華, 李淑瑾 , 叢 斌,等. 八肽膽囊收縮素對脂多糖誘導小鼠分泌IL-12的影響及其機制研究[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(9): 1835-1838.

[5] 叢 斌，凌亦凌, 谷振勇，等. 八肽膽囊收縮素對脂多糖誘導大鼠肺組織NF-κB活性增高的抑制作用[J]. 中國病理生理雜志, 2002,18(1):24-27.

[6] Weber-Nordt RM， Mertelsmann R, Finke J. The JAK-STAT pathway: signal transduction involved in proliferation, differentiation and transformation[J]. Leuk Lymphoma, 1998, 28(5-6):459-467.

[7] Takeda K, Akira S. STAT family of transcription factors in cytokine-mediated biological responses[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2000, 11(3):199-207.

[8] 叢 斌，凌亦凌，谷振勇，等. 膽囊收縮素-A 及B 受體mRNA 在SD 大鼠肺組織中的表達[J]. 中國實驗動物學雜志，1999，15(2):73-77.

[9] 孟愛宏, 凌亦凌, 閻錫新. 膽囊收縮素對脂多糖刺激大鼠肺泡巨噬細胞的影響[J]. 中華結核和呼吸雜志, 2006, 29(5): 352-353.

[10] Monstein HJ, Nylander AG, Salehi A, et al. Cholecystokinin-A and cholecystokinin-B/gastrin receptor mRNA expression in the gastrointestinal tract and pancreas of the rat and man[J]. Scand J Gastroenterol, 1996, 31(4):383-390.

[11] 趙曉云, 凌亦凌, 孟愛宏, 等. 八肽膽囊收縮素對大鼠心功能的影響及受體機制[J]. 生理學報, 2002, 54(3): 239-243.

[12] Mendez C, Jaffray C, Wong V, et al. Involvement of p38 mitogen-activated protein kinase in the induction of tolerance to hemorrhagic and endotoxic shock[J]. J Surg Res, 2000, 91(2):165-170.

[13] Otterbein LE, Bach FH, Alam J, et al. Carbon monoxide has anti-inflammatory effects involving the mitogen-activated protein kinase pathway [J]. Nat Med, 2000，6(4): 422-428.

[14] 黃新莉, 周曉紅, 周君琳,等. CCK-8上調(diào)LPS誘導的大鼠肺組織HO-1表達的信號轉(zhuǎn)導機制[J]. 中國病理生理雜志，2009，25(12): 2390-2393.

[15] Cunningham ME, Shaw-Stiffel TA, Bernstein LH, et al. Cholecystokinin-stimulated monocytes produce inflammatory cytokines and eicosanoids[J]. Am J Gastroenterol, 1995,90(4):621-626.

[16] Lieb K, Fiebich BL, Busse-Grawitz M, et al. Effect of substance P and selected other neuropeptides on the synthesis of interleukin-1 beta and interleukin-6 in human monocytes: a re-examination[J]. J Neuroimmunol, 1996,67(2):77-81.

[17] 倪志宇, 叢 斌, 李淑瑾，等. CCK-8對LPS攻擊小鼠IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(2): 331-335.

[18] 高維娟, 許順江, 叢 斌，等. CCK-8抑制LPS作用下大鼠肺間質(zhì)巨噬細胞NF-κB活性的cAMP-PKA通路研究[J]. 中國病理生理雜志, 2006,22(10): 1891-1895.

[19] Vittimberga FJ, McDade TP, Perugini RA, et al. Sodium salicylate inhibits macrophage TNF-α production and alters MAPK activation[J]. J Surg Res, 1999,84(2): 143-149.

[20] Dabrowski A, Tribillo I, Dabrowska MI, et al. Activation of mitogen-activated protein kinases in different models of pancreatic acinar cell damage[J]. Z Gastroenterol, 2000,38(6):469-481.

Rolesofp38MAPKandSTAT3ininhibitoryeffectofcholecystokininoctapeptideonLPS-inducedcytokineproductioninrats

MENG Ai-hong1, LING Yi-ling2, ZHANG Xiao-peng1

(1RespiratoryDivision,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,2DepartmentofPathophysiology,HebeiMedicalUniversity,3HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050000,China.E-mail:mengaihong@sina.com)

AIM: To investigate the roles of p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and cholecystokinin (CCK) receptor (CCK-R) in the inhibitory effect of cholecystokinin octapeptide (CCK-8) on pro-inflammatory cytokine production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated rats.METHODSSD rats were randomly divided into LPS (8 mg/kg) group, CCK-8 (40 μg/kg)+LPS (8 mg/kg) group, CCK-8 (40 μg/kg) group and control (normal saline) group. The production of pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor α (TNF-α),interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 in the serum, the lung and the spleen were measured by ELISA. Phosphorylation levels of p38 MAPK and STAT3 in the lung and the spleen of the rats were detected by Western blotting and double label immunofluorescence laser confocal microscopy. The mRNA expression of CCK-A receptor (CCK-AR) and CCK-B receptor (CCK-BR) in the spleen was detected by RT-PCR.RESULTSCCK-8 significantly inhibited the increases in the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the lung and the spleen of LPS-stimulated rats, and also increased the levels of phosphorylated p38 MAPK and STAT3 in the lung and the spleen of the rats. CCK-R was up-regulated by LPS stimulation.CONCLUSIONCCK-8 inhibits LPS-stimulated pro-inflammatory cytokine production in the serum, the lung and the spleen through p38 MAPK and STAT3 pathways. CCK-8 may be useful for treating systemic infection and other inflammatory diseases.

Cholecystokinin; Lipopolysaccharides; Cytokines; p38 MAPK; Signal transducer and activator of transcription 3; Rats

Q954.6; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.024

1000- 4718(2013)06- 1095- 07

2012- 11- 19

2013- 04- 24

河北省教育廳博士基金資助項目(No. B2003215);河北省自然科學基金資助項目(No.302490)

△通訊作者 Tel: 0311-66002952; E-mail: mengaihong@sina.com