趙京霞， 底婷婷， 王 燕， 劉 欣， 梁代英， 李 萍△

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 北京 100029; 2北京市中醫(yī)研究所, 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院, 北京 100010)

IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用*

趙京霞1,2， 底婷婷2， 王 燕2， 劉 欣2， 梁代英2， 李 萍1,2△

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 北京 100029;2北京市中醫(yī)研究所, 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院, 北京 100010)

目的觀察IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損形成過(guò)程中的作用及變化規(guī)律。方法雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和咪喹莫特組，采用PASI評(píng)分觀察銀屑病樣小鼠模型皮損動(dòng)態(tài)變化；光鏡觀察皮損組織形態(tài)學(xué)變化；細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)對(duì)比檢測(cè)兩組小鼠血清及皮損組織中細(xì)胞因子譜的變化；采用流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡分析技術(shù)對(duì)小鼠血清及皮膚組織中細(xì)胞因子含量、mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；流式細(xì)胞術(shù)分析外周血及脾細(xì)胞成分。結(jié)果咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生紅斑、鱗屑、增厚等典型的銀屑病樣皮損，并隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)一個(gè)拋物線型的動(dòng)態(tài)變化；經(jīng)咪喹莫特外用刺激后，小鼠皮膚及血清中IL-23/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子、Th1、Th2和Treg類細(xì)胞因子含量及表達(dá)水平均顯著升高。IL-23/IL-17軸細(xì)胞因子表達(dá)也呈現(xiàn)一個(gè)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。咪喹莫特組小鼠外周血及脾細(xì)胞中樹(shù)突狀細(xì)胞比例顯著升高，脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例升高，約為正常對(duì)照組的3～4倍，Treg細(xì)胞比例約為正常對(duì)照組的2倍。結(jié)論咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的皮損癥狀、病理學(xué)特征及細(xì)胞因子改變都與銀屑病相似，是進(jìn)行銀屑病研究可行的動(dòng)物模型，該模型制備后第1～8天可模擬疾病的發(fā)展階段。Th17細(xì)胞活化及IL-23/IL-17軸參與了該模型皮損的形成，并呈現(xiàn)一個(gè)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也參與了該模型皮損的形成，并且伴隨Treg 和Th2類細(xì)胞因子的反饋性升高。

銀屑病； 咪喹莫特； 白細(xì)胞介素23/白細(xì)胞介素17軸； Th17

銀屑病是一種常見(jiàn)的以鱗屑性紅斑為特點(diǎn)的慢性炎性皮膚病，目前已被定義為器官特異性的自身免疫性疾病[1]，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-23/IL-17炎癥軸在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用[2]。樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的IL-23 分子與受體結(jié)合后可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞增殖、活化并分泌IL-17、IL-22等多種細(xì)胞因子[3]，這些細(xì)胞因子募集中性粒細(xì)胞[4]，誘發(fā)銀屑病等多種炎性損傷，這被稱為IL-23/IL-17炎性軸。

咪喹莫特(imiquimod，IMQ)是Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)7/8的激動(dòng)劑，主要用于外陰及肛周疣和光化性角化病的局部治療。臨床應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，該藥物可加重銀屑病患者的癥狀或誘導(dǎo)銀屑病的復(fù)發(fā)[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)將咪喹莫特外涂于小鼠皮膚，可誘導(dǎo)小鼠皮膚出現(xiàn)銀屑病樣皮損及組織學(xué)改變，與人類銀屑病病理變化有很多相似之處[6]。我們的前期研究也證實(shí)了這個(gè)結(jié)果[7]。van der Fits等[8]報(bào)道，咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損改變伴隨著IL-23/IL-17軸的變化，但其具體的變化規(guī)律未見(jiàn)報(bào)道，是否其它T細(xì)胞(Th1、Th2和Treg)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答也參了此模型皮損的形成過(guò)程，目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬在此基礎(chǔ)上，觀察IL-23/IL-17炎癥軸在該模型中的變化規(guī)律，對(duì)其作為銀屑病藥物篩選及機(jī)制研究的動(dòng)物模型前景進(jìn)行探索。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

雌性BALB/c小鼠[由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)20090007]，體重18～20 g，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室。

2試劑和藥物

咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司)；凡士林(河北蘭煉飛天石化有限公司)；CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC和CD11c-PE單克隆抗體(Biole-gend)；佛波醇-12-肉豆蒄酯-13-乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和ionomycin(Sigma)； IL-17-PE抗體、IFN-γ-APC抗體、IL-4-APC抗體、Foxp3-PE抗體、CD4-FITC抗體和CD25-APC抗體(eBioscience)；小鼠細(xì)胞因子抗體芯片試劑盒(RayBio)；小鼠Th17/Th2/Th1 流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)(cytometric bead array,CBA)定量檢測(cè)試劑盒(BD)；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒和UltraSYBR Mixture(CWbio)；IL-23兔多克隆抗體和IL-17兔多克隆抗體(Abcam)。

3方法及分組

BALB/c小鼠戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，刮除其背部毛發(fā)，形成約2 cm×3 cm大小的暴露區(qū)域，單籠飼養(yǎng)。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control，CTRL)和IMQ組。IMQ組小鼠每天涂抹5%IMQ乳膏42 mg，正常對(duì)照組小鼠背部每日涂抹等量凡士林，連續(xù)14 d，分別于2、4、6、8、10、12和14 d取材。

4檢測(cè)指標(biāo)與方法

4.1小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分 采用數(shù)碼照相的方法每天記錄，并依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，給予小鼠皮損處紅斑(erythema)、鱗屑(scales)及浸潤(rùn)增厚程度(thickness) 0～4的積分，將三者積分相加得到總積分。PAIS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0，無(wú)；1，輕度；2，中度；3，重度；4，極重度。對(duì)各組小鼠積分取平均值后繪制趨勢(shì)線，觀察各組小鼠皮損的變化情況。

4.2小鼠皮損病理學(xué)檢測(cè) 采用HE染色觀察。每組4只小鼠脫頸處死后，按照九格法各組剪取相對(duì)應(yīng)皮損處組織,固定于10%甲醛中，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,每個(gè)標(biāo)本選4張染色切片進(jìn)行觀察并照相。

4.3小鼠皮損及血清細(xì)胞因子芯片檢測(cè) 小鼠血清及組織中細(xì)胞因子的定性檢測(cè)采用Raybiotech公司細(xì)胞因子抗體芯片進(jìn)行測(cè)定，該芯片可同時(shí)測(cè)定20余種細(xì)胞因子。具體操作嚴(yán)格按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，X射線膠片曝光后，將膠片上的圖像用掃描儀掃描并轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運(yùn)行ScanAlyze軟件，將灰度TIFF格式圖片的點(diǎn)陣轉(zhuǎn)化為數(shù)字型數(shù)據(jù)，將此原始數(shù)據(jù)儲(chǔ)存為Microsoft Excel文件。

4.4小鼠血清細(xì)胞因子定量檢測(cè) 采用CBA定量檢測(cè)小鼠血清細(xì)胞因子的濃度。測(cè)定方法如下：按試劑盒要求將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度，在待測(cè)管中加入不同細(xì)胞因子抗體的混合微珠，然后加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)血清樣本，再分別加入PE標(biāo)記的檢測(cè)抗體，充分搖勻后室溫避光孵育3 h后，上機(jī)檢測(cè)。

4.5小鼠外周血細(xì)胞CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD11c+細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 取小鼠抗凝血0.1 mL×2管，分別加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC單克隆抗體、混合液和CD11c-PE單克隆抗體，避光放置30 min。加入Lysis Buffer裂解紅細(xì)胞后離心洗滌，PBS重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

4.6小鼠脾臟變化觀察 小鼠稱重后處死，取脾臟稱重，計(jì)算脾指數(shù)(脾指數(shù)=脾重量/體重)，反映動(dòng)態(tài)小鼠全身反應(yīng)改變。

4.7小鼠脾臟免疫細(xì)胞成分檢測(cè) (1)常規(guī)分離各組小鼠脾細(xì)胞，獲得脾細(xì)胞懸液。分別加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC單克隆抗體混合液和CD11c-PE單克隆抗體，避光30 min后，離心洗滌重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和CD11c+細(xì)胞比例變化。(2)調(diào)整脾細(xì)胞懸液濃度，加入PMA及ionomycin培養(yǎng)1 h后，再加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Brefeldin A繼續(xù)培養(yǎng)4 h。分別加入anti-mouse CD4-FITC抗體或CD4-FITC抗體與CD25-PE抗體的混合液，室溫避光30 min，PBS洗滌重懸，細(xì)胞經(jīng)固定、破膜后，進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)。分別加入PE標(biāo)記的anti-mouse IL-17抗體、APC標(biāo)記的anti-mouse IFN-γ抗體、APC標(biāo)記的anti-mouse IL-4抗體和PE標(biāo)記的anti-mouse Foxp3抗體，避光30 min，PBS洗滌后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析Th17細(xì)胞(CD4+IL-17+)、Th1細(xì)胞(CD4+IFN-γ+)、Th2細(xì)胞(CD4+IL-4+)和Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細(xì)胞比例變化。

4.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7300)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下：IL-23 上游引物5’-GACTCAGCCAACTCCTCCAGCCAG-3’，下游引物5’-TTGGCACTAAGGGCTCAGTCAGA-3’；IL-17A 上游引物5’-CAGACTACCTCAACCGTTCCA-3’，下游引物5’-ACAATCGAGGCCACGCAGGTGCAGC-3’；IL-17F 上游引物5’-TGCTACTGTTGATGTTGGGAC-3’，下游引物5’-AATGCCCTGGTTTTGGTTGAA-3’；IL-22 上游引物5’-CGTCAACCGCACCTTTAT-3’，下游引物5’-AGGGCTGGAACCTGTCTG-3’；TNF-α 上游引物5’-GAGAAGTTCCCAAATGGC-3’，下游引物5’-ACTTGGTGGTTTGCTACG-3’；IFN-γ 上游引物5’-TAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG-3’，下游引物5’-GACGCTTATGTTGTTGCTGATGG-3’；IL-10 上游引物5’-CTGGACAACATACTGCTAACCGACTC-3’，下游引物5’-AACTGGATCATTTCCGATAAGGC-3’；IL-4上游引物5’-TCGTCTGTAGGGCTTCCAAGGTGCT-3’，下游引物5’-GTGGACTTGGACTCATTCATGGTGC-3’；用熒光染料UltraSYBR Mixture嵌合熒光法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)×50個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

4.9蛋白質(zhì)提取及Western blotting分析 常規(guī)提取皮損組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行蛋白定量。各組取20 μg樣品蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h。加入特異性識(shí)別抗體，4 ℃封閉過(guò)夜。TBS振蕩洗膜后，加入熒光Ⅱ抗(1∶10 000)，避光孵育1 h，Odssey雙色紅外成像儀掃描分析。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。使用SPSS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣動(dòng)物模型皮損的形態(tài)學(xué)變化

圖1可見(jiàn)，正常對(duì)照組小鼠皮膚較薄，無(wú)鱗屑，無(wú)增厚改變。IMQ組小鼠在IMQ涂抹1 d后皮膚即出現(xiàn)點(diǎn)狀紅斑，2～3 d后出現(xiàn)細(xì)小鱗屑，皮膚褶皺。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，IMQ組小鼠皮損日益嚴(yán)重：紅斑由少量淡粉色變?yōu)榇竺娣e深紅色；鱗屑增多增厚，由少量細(xì)屑過(guò)渡至布滿全暴露皮膚的層狀鱗屑，易脫落，脫落后可見(jiàn)點(diǎn)狀出血；皮膚增厚明顯，逐漸隆起、皺折，幾乎占暴露皮膚的2/3以上。皮損在涂藥后7和8 d癥狀最為嚴(yán)重，此后紅斑緩緩消退，鱗屑快速脫落，僅殘留部分細(xì)小碎屑，但顏色依然偏紅，增厚情況減退緩慢。直到14 d后，紅斑及鱗屑都已消退，增厚緩解不明顯。依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)繪制趨勢(shì)線可觀察到，皮損變化過(guò)程與趨勢(shì)線相似：正常對(duì)照組小鼠紅斑、鱗屑及增厚程度趨勢(shì)線始終平穩(wěn)在0左右；IMQ組小鼠紅斑積分持續(xù)增加，至8 d左右可達(dá)高峰，此后積分較快降低，至13 d后可達(dá)平穩(wěn)，降低減緩，但仍高于正常值；IMQ組鱗屑積分前期增加迅速，5～6 d后達(dá)到平穩(wěn)，9 d后逐漸減低；IMQ組增厚趨勢(shì)前期呈現(xiàn)穩(wěn)步上升局勢(shì)，到8 d左右達(dá)頂峰，此后，較緩慢降低，但始終明顯高于正常,見(jiàn)圖2。

Figure 1. The gross observation of mouse lesional skin induced by IMQ. BALB/c mice were treated with IMQ or vehicle (control,CTRL) once a day for 14 d, and the morphology of skin was examined at different time points.

圖1IMQ誘導(dǎo)的小鼠背部皮損的大體觀察

Figure 2. The PASI scores of mouse lesional skin induced by IMQ.Erythema, scales, and thickness of the back skin were scored daily on a scale from 0 to 4，and the cumulative score (erythema+scales+thickness) was calculated. Mean±SD.n=6.

圖2IMQ誘導(dǎo)的小鼠背部皮損PASI積分的變化

2IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣動(dòng)物模型皮損的組織學(xué)變化

HE染色顯示，正常對(duì)照組小鼠皮膚表皮層菲薄，僅2～3層，細(xì)胞形態(tài)正常。與正常對(duì)照組比較，IMQ組小鼠皮膚表皮層2 d即有明顯增厚，出現(xiàn)角化不全，棘細(xì)胞數(shù)量增加。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表皮層逐漸增厚，伴隨Munro微膿腫的出現(xiàn)，內(nèi)有炎癥細(xì)胞及表皮細(xì)胞碎片，角化不全嚴(yán)重，角質(zhì)層內(nèi)殘留有固縮的細(xì)胞核，真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，血管增生、擴(kuò)張尤其在真皮淺層。炎癥反應(yīng)至8 d為頂峰，此后表皮厚度降低，角化不全減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生擴(kuò)張減輕，但14 d時(shí)仍高于正常，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The histological changes of mouse lesional skin induced by IMQ (HE staining).

圖3IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮損的組織學(xué)改變

3IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損動(dòng)物模型血清細(xì)胞因子譜的變化

細(xì)胞因子抗體芯片掃描結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，IMQ組小鼠第6天的血清中升高的細(xì)胞因子主要有：粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、IL-9、IL-10和IL-17。其中升高大于2倍的因子有GM-CSF、IFN-γ和IL-17，其中IL-17的升高尤為顯著，見(jiàn)圖4和表1。CBA定量檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常小鼠對(duì)比，IMQ組小鼠血清中IL-17、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IFN-γ、IL-4和IL-10濃度均顯著升高(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)表2。

Figure 4. The cytokine scanning of the serum from IMQ-treated mice determined by cytokine protein array.

圖4IMQ誘導(dǎo)的小鼠血清中細(xì)胞因子的掃描結(jié)果

表1IMQ組小鼠血清與正常對(duì)照組相比上調(diào)≥1.3倍的細(xì)胞因子列表

Table 1. The serum cytokines whose indexes were more than or equal to 1.3 times of IMQ/CTRL

RowCoulumnNameIMQ/CTRL5,6JMIG1.30124353,4IIL-91.33345443,4JIL-101.45528401,2IEotaxin-21.36246055,6CI-TAC1.97677883,4BIFN-γ2.51877803,4AGM-CSF3.64661445,6BIL-178.0360088

表2IMQ誘導(dǎo)的小鼠血清中細(xì)胞因子濃度的變化

Table 2. The serum concentrations of the cytokines in IMQ-treated mice (ng/L.Mean±SD.n=6)

GroupIL-17TNF-αIFN-γIL-4IL-10CTRL2.62±0.396.67±1.593.90±0.923.12±0.514.71±0.52IMQ5.85±0.41**30.74±5.18**30.54±11.20*6.08±0.60**46.97±3.92**

*P<0.05，**P<0.01vsCTRL.

4IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損動(dòng)物模型皮損細(xì)胞因子譜的變化

與正常小鼠對(duì)比，IMQ組小鼠第6天的皮膚組織中升高的細(xì)胞因子主要有：角質(zhì)形成細(xì)胞源性趨化因子(keratinocyte-derived chemokine,KC;又稱CXCL1)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、GM-CSF、IL-10、IL-12 p40/p70和IL-17,見(jiàn)圖5和表3。Western blotting結(jié)果顯示，IMQ組小鼠皮損組織中IL-17和IL-23表達(dá)較正常對(duì)照小鼠顯著升高，見(jiàn)圖6和表4。

Figure 5. The cytokine scanning of the lesional skin from IMQ-treated mice determined by cytokine protein array.

圖5IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮損組織中細(xì)胞因子的掃描結(jié)果

5IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損動(dòng)物模型皮損細(xì)胞因子mRNA的異常表達(dá)

與正常小鼠對(duì)比，IMQ組小鼠第4天的皮損組織中除了Th1類細(xì)胞因子(IFN-γ)、IL-23及Th17類細(xì)胞因子(IL-17A、IL-17F、IL-22)mRNA水平顯著升高外，Th2類細(xì)胞因子IL-4及Treg細(xì)胞因子IL-10 mRNA水平也顯著升高，見(jiàn)圖7。

表3IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮損組織上調(diào)≥1.3倍的細(xì)胞因子列表

Table 3. The lesional skin cytokines whose indexes were more than or equal to 1.3 times of IMQ/CTRL

RowCoulumn NameIMQ/CTRL3,4JIL-101.45028861,2LG-CSF1.57976745,6BIL-171.71369513,4AGM-CSF1.71494573,4KIL-12p40/p701.74273467,8ARANTES1.97397951,2HEotaxin1.97764027,8DTECK2.09608645,6DKC3.3651635

Figure 6. IL-17 and IL-23 protein expression in lesional skin of mice induced by IMQ.

圖6IMQ誘導(dǎo)小鼠皮損組織中IL-17和IL-23蛋白的表達(dá)

表4IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮損組織IL-17和IL-23蛋白的相對(duì)表達(dá)量

Table 4. The relative protein expression of IL-17 and IL-23 in mice lesional skin induced by IMQ(Mean±SD.n=6)

GroupIL-23/GAPDHIL-17/GAPDHCTRL0.21±0.030.28±0.03IMQ0.59±0.08**0.55±0.07**

**P<0.01vsCTRL.

6IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損中IL-23/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的變化規(guī)律

收集IMQ組小鼠0、2、4、6和8 d的皮損組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)皮損組織中IL-23/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，IL-23和IL-17A mRNA水平在IMQ給藥后5～6 d達(dá)到高峰，隨后開(kāi)始下降，IL-17A mRNA水平下降幅度明顯。TNF-α和IL-17F mRNA水平在第3～4 d達(dá)到高峰后開(kāi)始下降。IMQ誘導(dǎo)后，小鼠皮損中IL-23/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,見(jiàn)圖8。

Figure 7. The mRNA expression of the cytokines in lesional skin from IMQ-treated mice determined by real-time PCR.Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsCTRL.

圖7IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮損組織中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

7IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損小鼠外周血細(xì)胞成分的變化

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組小鼠相比，IMQ作用于小鼠皮膚8 d后，小鼠外周血中CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞比例顯著增高(P<0.01)，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比例相對(duì)下降，見(jiàn)表5。

8IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損小鼠脾重及細(xì)胞成分的變化

IMQ作用于刺激小鼠皮膚8 d后，IMQ組小鼠脾重約為正常對(duì)照組2倍，脾指數(shù)也明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表6。對(duì)脾細(xì)胞成分進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組小鼠相比，IMQ組小鼠脾細(xì)胞中CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞比例顯著增高(P<0.01)，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比例相對(duì)下降，見(jiàn)表7。為進(jìn)一步檢測(cè)CD4+T細(xì)胞中Th1(CD4+IFN-γ+)細(xì)胞、Th17(CD4+IL-17+)細(xì)胞及Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細(xì)胞的比例，各組脾細(xì)胞經(jīng)PMA 和 ionomycin刺激5 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示IMQ組小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，約為正常對(duì)照小鼠的3～4倍；Th1和Th2細(xì)胞比例與正常對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的變化。IMQ組脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例也顯著升高(P<0.01)，約為正常對(duì)照小鼠的2倍，見(jiàn)表8。

Figure 8. The cytokine mRNA dynamic expression in lesional skin from IMQ-treated mice determined by real-time PCR.Mean±SD.n=4.

圖8IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮損組織中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

表5IMQ誘導(dǎo)的小鼠外周血中CD4+T、CD8+T和CD11c+細(xì)胞比例的變化

Table 5. The proportion of CD4+T, CD8+T and CD11c+cells in peripheral blood of mice induced by IMQ (%.Mean±SD.n=5)

GroupCD11c+CD3+CD4+CD3+CD8+CTRL1.27±0.4225.94±4.817.58±1.92IMQ6.76±1.23**20.71±3.62*5.44±1.04

*P<0.05,**P<0.01vsCTRL.

表6IMQ誘導(dǎo)的小鼠脾重及脾指數(shù)的變化

Table 6. The spleen mass and index changes of mice induced by IMQ(Mean±SD.n=6)

GroupSpleenmass(g)Spleenindex(mg/g)CTRL0.080±0.0104.51±0.37IMQ1.721±0.033**10.20±2.03**

*P<0.05,**P<0.01vsCTRL.

表7IMQ誘導(dǎo)的小鼠脾臟中CD4+T、CD8+T和CD11c+細(xì)胞比例的變化

Table 7. The proportion of CD4+T,CD8+T and CD11c+cells in spleen of mice induced by IMQ(%.Mean±SD.n=5)

GroupCD11c+CD3+CD4+CD3+CD8+CTRL9.89±3.0018.15±4.0811.06±2.28IMQ24.44±4.94**8.24±1.92**4.17±1.19**

*P<0.05，**P<0.01vsCTRL.

表8IMQ誘導(dǎo)的小鼠脾臟中CD4+IL-17+、CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例的變化

Table 8. The proprtion of CD4+IL-17+, CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+and CD4+CD25+Foxp3+cells in spleen of mice induced by IMQ (%. Mean±SD.n=5)

GroupCD4+IL-17+CD4+IFN-γ+CD4+IL-4+CD4+CD25+Foxp3+CTRL0.52±0.154.50±1.390.67±0.3811.51±0.51IMQ2.12±0.63**3.65±1.040.63±0.2621.68±0.79**

**P<0.01vsCTRL.

討 論

目前針對(duì)IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損的研究多集中在給藥后第5～8天的觀察[9-10]。我們的研究對(duì)此模型進(jìn)行了0～14 d的觀察，發(fā)現(xiàn)IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)一個(gè)拋物線型的動(dòng)態(tài)變化：在IMQ涂抹1～3 d后小鼠皮膚即出現(xiàn)紅斑、細(xì)小鱗屑和褶皺。第7～8 d銀屑病樣癥狀最為嚴(yán)重，此后隨著IMQ給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，紅斑不再繼續(xù)加重且有消退的趨勢(shì)，鱗屑脫落，但皮膚增厚依然嚴(yán)重。從小鼠銀屑病樣皮損PASI評(píng)分趨勢(shì)圖上可以明顯看出這一動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。IMQ作用后小鼠皮損組織病理學(xué)動(dòng)態(tài)改變也與皮損形態(tài)變化一致，典型的銀屑病樣病理學(xué)改變均在第8天表現(xiàn)最為明顯，然后逐漸改善。同時(shí)，我們觀察了第8天IMQ停止給藥后小鼠皮損的變化，PASI評(píng)分及病理學(xué)表現(xiàn)也出現(xiàn)了上述同樣的下降規(guī)律[11]，但下降幅度明顯大于IMQ連續(xù)給藥組。

根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，IMQ外用誘導(dǎo)的是一個(gè)暫時(shí)的炎癥爆發(fā)，該模型在IMQ持續(xù)作用下可能發(fā)生藥物適應(yīng)、耐受情況，致使皮損出現(xiàn)自限性傾向，類似銀屑病臨床急性期的自愈現(xiàn)象。因此，IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣動(dòng)物模型有時(shí)間窗的限制，可以認(rèn)為前8 d為疾病的發(fā)生、發(fā)展階段，可應(yīng)用于銀屑病發(fā)病機(jī)制探索、藥物篩選及干預(yù)作用機(jī)制研究。

在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)隨著IMQ給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲降低、體重下降等全身反應(yīng)癥狀，并且脾臟顯著增大，第8天時(shí)，脾重約為正常對(duì)照組2倍，脾指數(shù)也明顯高于正常對(duì)照組，提示IMQ局部外用刺激可引起小鼠免疫系統(tǒng)的亢進(jìn)、紊亂等全身反應(yīng)。這也解釋了為何臨床應(yīng)用IMQ局部治療會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)流感樣癥狀及誘發(fā)銀屑病等副作用。

為深入了解參與IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損形成的細(xì)胞免疫應(yīng)答類型，我們采用細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)該模型小鼠血清及皮損組織中24種細(xì)胞因子進(jìn)行了篩選和分析。經(jīng)IMQ刺激后，小鼠皮膚及血清中Th1類細(xì)胞因子如IFN-γ、Th17類細(xì)胞因子如IL-17和粒細(xì)胞類的集落刺激因子(GM-CSF)等及Treg類細(xì)胞因子(IL-10)均顯著升高，提示Th1、Th17和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與了該模型皮損的形成。

由于細(xì)胞因子抗體芯片是一種定性的分析工具，只能反映樣本之間相關(guān)細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)豐度的高低，為進(jìn)一步明確各組小鼠皮膚及血清中細(xì)胞因子譜的變化，我們分別采用CBA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡等定量及半定量分析技術(shù)對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的含量及皮膚組織中細(xì)胞因子mRNA、蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。與細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)結(jié)果一致，無(wú)論在IMQ誘導(dǎo)的小鼠模型血清還是皮損組織中，Th17類細(xì)胞因子(IL-17、IL-22)、Th1類細(xì)胞因子(IFN-γ)和Treg類細(xì)胞因子(IL-10)的表達(dá)均顯著高于正常小鼠。此外，Th2類細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)在此模型中也顯著升高，這與細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)結(jié)果是不同的，可能與不同檢測(cè)方法間的差異及靈敏度有關(guān)。以上結(jié)果明確了Th17類細(xì)胞因子在此模型中的作用，這與van der Fits等[8]的報(bào)道一致。并且我們發(fā)現(xiàn)另外一類具有促炎作用的Th1類細(xì)胞因子在此模型中也存在異常高表達(dá)，與臨床銀屑病患者的細(xì)胞因子表達(dá)譜相符合[12]，Shibata等[13]也有類似的研究結(jié)果。

值得注意的是，與Quaglino等[14]的臨床研究結(jié)果不同，具有抑炎效應(yīng)的Th2細(xì)胞因子和具有免疫調(diào)節(jié)作用的Treg細(xì)胞因子在該銀屑病樣模型中也顯著升高，并且脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+)比例升高，約為正常對(duì)照小鼠的2倍，這與Zhang等[15]的研究結(jié)果一致。Treg細(xì)胞、Th2細(xì)胞與Th1、Th17細(xì)胞之間的相互作用對(duì)維持免疫反應(yīng)與病理?yè)p傷之間的平衡是很重要的。我們推測(cè)在銀屑病發(fā)病過(guò)程中由于Th17或Th1細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，打破了這個(gè)免疫平衡，Treg細(xì)胞或Th2細(xì)胞代償性地募集至皮損區(qū)域，作為一種反饋機(jī)制抑制IL-17或IFN-γ所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，盡管如此，Th17和Th1細(xì)胞因子仍處于優(yōu)勢(shì)地位，使銀屑病呈現(xiàn)出炎癥爆發(fā)的表現(xiàn)。因此在皮損組織及血清中存在IL-4及IL-10等細(xì)胞因子水平的升高，這只是Th1和Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答爆發(fā)的反饋效應(yīng)，而不是IMQ的直接誘導(dǎo)作用所致。綜合以上資料，Th17 及Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣模型中起著主導(dǎo)作用。

通過(guò)對(duì)脾細(xì)胞成分進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組小鼠相比，IMQ組小鼠脾細(xì)胞中CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞比例顯著增高，外周血中細(xì)胞成分也發(fā)生了相似的變化，并且之前的研究我們已證實(shí)在IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮損組織中有樹(shù)突狀細(xì)胞的大量浸潤(rùn)[7]，由此可見(jiàn)IMQ外用可誘導(dǎo)小鼠外周及皮損區(qū)樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖及募集。樹(shù)突狀細(xì)胞是分泌IL-23的主要細(xì)胞[16]，IMQ組小鼠皮損區(qū)IL-23mRNA及IL-23蛋白的高表達(dá)可能是由于浸潤(rùn)的樹(shù)突狀細(xì)胞分泌所致。IL-23是Th17細(xì)胞增殖及活化的上游分子，該模型中Th17細(xì)胞因子的高表達(dá)可能是IL-23高表達(dá)的結(jié)果。在脾細(xì)胞中我們也發(fā)現(xiàn)Th17(CD4+IL-17+)細(xì)胞的比例的顯著升高，約為正常對(duì)照小鼠的3～4倍；而Th1細(xì)胞比例與正常對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的變化。由此提示，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在IMQ誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中可能發(fā)揮著更為重要的作用。

漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是表達(dá)TLR7/8的主體細(xì)胞，IMQ與TLR7/8結(jié)合后可啟動(dòng)IFN-α的大量分泌[17]，IFN-α誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟活化[18]并分泌IL-23，后者作用于Th17細(xì)胞，介導(dǎo)Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)。這可能是IMQ誘發(fā)小鼠皮損組織及血清中IL-23/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子大量表達(dá)的原因。

實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)，IMQ外涂于皮膚后，IL-23 mRNA和Th17類細(xì)胞因子mRNA表達(dá)均呈一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。在第4～6天，這些因子的mRNA表達(dá)水平達(dá)到高峰，隨后表達(dá)水平開(kāi)始下降。IMQ作用后IL-23/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子 mRNA先升后降的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律導(dǎo)致Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)不能持續(xù)存在，從而出現(xiàn)皮損的動(dòng)態(tài)變化。但是該模型皮損的表現(xiàn)在第7～8天最為嚴(yán)重，可能由于mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯表達(dá)等時(shí)間的延遲所致。目前尚不清楚究竟是何種耐受機(jī)制使IMQ不能引發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)，也未見(jiàn)IMQ在臨床使用出現(xiàn)藥物耐受的報(bào)道。

綜合以上結(jié)果，IMQ誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的皮損癥狀、病理學(xué)特征及細(xì)胞因子改變都與銀屑病相似，是進(jìn)行銀屑病研究可行的動(dòng)物模型。該模型操作簡(jiǎn)單，消耗較少，易于推廣。此模型的前8 d可模擬疾病的發(fā)展階段，第6～8天為變化高峰。Th17細(xì)胞活化及IL-23/IL-17軸參與了IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損的形成，并呈現(xiàn)一個(gè)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也參與了該模型皮損的形成，并且伴隨Treg 和Th2類細(xì)胞因子的反饋性升高。

[1] Gaspari AA. Innate and adaptive immunity and the pathophysiology of psoriasis[J]. J Am Acad Dermatol，2006，54(3 Suppl 2):S67-S80.

[2] Blauvelt A. T-helper 17 cells in psoriatic plaques and additional genetic links between IL-23 and psoriasis[J]. J Invest Dermatol，2008,128(5):1064-1067.

[3] Di Cesare A，Di Meglio P，Nestle FO.The IL-23/Th17 axis in the immunopathogenesis of psoriasis[J]. J Invest Dermatol，2009，129(6)：1339-1350.

[4] 周宏斌，陳志華，李 雯.Th17細(xì)胞及白細(xì)胞介素17A在慢性氣道炎癥性疾病中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2012，28(3): 560-564

[5] Rajan N, Langtry JA. Generalized exacerbation of psoriasis associated with imiquimod cream treatment of superficial basal cell carcinomas[J]. Clin Exp Dermatol，2006，31(1): 140-141.

[6] Palamara F, Meindl S, Holcmann M, et al. Identification and characterization of pDC-like cells in normal mouse skin and melanomas treated with imiquimod[J]. J Immunol, 2004，173(5): 3051-3061.

[7] 底婷婷，趙京霞, 王 燕，等.涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損的干預(yù)作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2012，28(4)：718-722.

[8] van der Fits L, Mourits S,Voerman JS, et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin Inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis [J].J Immunol, 2009, 182(9):5836-5849.

[9] Pantelyushin S, Haak S, Ingold B, et al. Rorγt+innate lymphocytes and γδ T cells initiate psoriasiform plaque formation in mice[J]. J Clin Invest,2012,122(6):2252-2256.

[10] El Malki K, Karbach SH, Huppert J,et al. An alternative pathway of imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in the absence of interleukin-17 receptor A signaling[J]. J Invest Dermatol, 2013, 133(2):441-451.

[11] 底婷婷.涼血活血膠囊對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型的干預(yù)作用[D].北京:首都醫(yī)科大學(xué)，2012.

[12] Lowes MA, Kikuchi T, Fuentes-Duculan J, et al. Psoriasis vulgaris lesions contain discrete populations of Th1 and Th17 T cells[J]. J Invest Dermatol，2008，128(5):1207-1211.

[13] Shibata S, Tada Y, Asano Y,et al. IL-27 activates Th1-mediated responses in imiquimod-induced psoriasis-like skin lesions[J].J Invest Dermatol，2013，133(2):479-488.

[14] Quaglino P,Bergallo M,Ponti R,et al. Th1, Th2, Th17 and regulatory T cell pattern in psoriatic patients: modulation of cytokines and gene targets induced by etanercept treatment and correlation with clinical response[J]. Dermatology，2011，223(1):57-67.

[15] Zhang L, Yang XQ, Cheng J, et al. Increased Th17 cells are accompanied by FoxP3+Treg cell accumulation and correlated with psoriasis disease severity[J]. Clin Immunol，2010，135(1):108-117.

[16] 謝 華，何韶衡. IL-17, 18, 23, 25 在變態(tài)反應(yīng)性疾病中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2004, 20(10): 1942-1946.

[17] Ito T, Amakawa R, Inaba M, et al. Differential regulation of human blood dendritic cell subsets by IFNs[J]. J Immunol，2001，166(5)：2961-2969.

[18] H?cker H, Redecke V, Blagoev B, et a1. Specificity in Toll-like receptor signaling through distinct effector functions of TRAF3 and TRAF6[J]. Nature，2006，439 (7073)：204-207.

RoleofIL-23/IL-17inflammatoryaxisinthepathogenesisofpsoriasis-likelesionsinducedbyimiquimodinmice

ZHAO Jing-xia1,2, DI Ting-ting2, WANG Yan2, LIU Xin2，LIANG Dai-ying2，LI Ping1,2

(1SchoolofPreclinicalMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China.E-mail:liping411@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the dynamic changes of IL-23/IL-17 inflammatory axis in psoriasis-like lesions of mice induced by imiquimod (IMQ).METHODSBALB/c female mice were randomly divided into control group and IMQ group. The morphological changes of lesional skin in mice were evaluated according to the psoriasis area and severity index (PASI) and HE staining. cytokine antibody chips were used to determine the cytokine changes in serum and lesions. The mRNA and protein expression of cytokines were analyzed by cytometric bead array, real-time PCR and Western blotting. Moreover, the changes of cellular constituents in the peripheral blood and splenic cells of mice were detected by flow cytometry.RESULTSTypical psoriasis-like skin lesions, such as red scaly skin plaques, caused by topical IMQ showed a parabolic dynamic change. There was a dynamic increase in proinflammatory cytokines of the IL-23/IL-17 axis in IMQ-treated skin. IMQ application resulted in elevated expression of cytokines related with IL-23/IL-17 inflammatory axis，Th1-type cytokines，Th2-type cytokines and Treg-type cytokines at day 4. IMQ-treated BALB/c mice showed an increased pericentage of dentric cells in peripheral blood and spleen compared with control animals. Percentages of Th17 and Treg in IMQ-treated mice were increased by 3～4 times and twice as compared with control mice, respectively.CONCLUSIONThe skin lesions, histopathological features and cytokine changes in mice induced by IMQ are similar to human psoriasis, which are suitable for investigating the pathogenesis of psoriasis as a psoriasis-like model. IL-23/IL-17 axis is involved in the formation of psoriasis-like skin lesions in mice induced by IMQ and presents a dynamic change. Besides, Th1 cell-mediated inflammatory response is also activated in the formation of lesional skin, accompanied by the increase expression of Th2 and Treg cytokines in a feedback mechanism.

Psoriasis; Imiquimod; Interleukin-23/interleukin-17 axis; Th17

R392

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.023

1000- 4718(2013)06- 1086- 09

2013- 03- 15

2013- 04- 24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81072810)

△通訊作者 Tel： 010-52176679； E-mail： liping411@yahoo.com.cn