伍蒙愛, 陳婕靈, 王 維, 陳惠惠, 劉園園, 楊?yuàn)檴? 胡良岡, 范小芳, 龔永生△

(1溫州醫(yī)學(xué)院低氧醫(yī)學(xué)研究所，浙江 溫州 325035; 2溫州醫(yī)學(xué)院附屬眼視光學(xué)院，浙江 溫州 325003)

Apelin及其受體和一氧化氮合酶在氧誘導(dǎo)的新生小鼠增生性視網(wǎng)膜病變中表達(dá)上調(diào)*

伍蒙愛1，2, 陳婕靈1，2, 王 維1, 陳惠惠2, 劉園園2, 楊?yuàn)檴?, 胡良岡1, 范小芳1, 龔永生1△

(1溫州醫(yī)學(xué)院低氧醫(yī)學(xué)研究所，浙江 溫州 325035;2溫州醫(yī)學(xué)院附屬眼視光學(xué)院，浙江 溫州 325003)

目的通過(guò)觀察apelin及其受體APJ和一氧化氮合酶(NOS)在氧誘導(dǎo)的新生小鼠增生性視網(wǎng)膜病變中的表達(dá)，探討apelin/APJ和一氧化氮(NO)是否參與了早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變新生血管的發(fā)生。方法36只7日齡C57BL/6J新生小鼠隨機(jī)均分為高氧組和對(duì)照組。高氧組暴露在75%±2%的氧濃度下5 d后，在正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)5 d；對(duì)照組小鼠在正常氧環(huán)境下飼養(yǎng)10 d。兩組均在17日齡處死，取左眼眼球做石蠟切片，HE染色計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)，以判斷造模是否成功。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)右眼視網(wǎng)膜組織apelin和APJ mRNA的表達(dá)，免疫熒光組織化學(xué)法檢測(cè)視網(wǎng)膜apelin、APJ、eNOS和iNOS蛋白的表達(dá)。結(jié)果高氧組視網(wǎng)膜平均每個(gè)切面突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)(35.13±10.13)明顯高于對(duì)照組(0.30±0.21，P<0.01)，說(shuō)明造模成功。高氧組apelin和APJ mRNA水平顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的32.2倍和17.6倍(均P<0.01)。組織免疫熒光結(jié)果顯示高氧組apelin和APJ蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，并且主要強(qiáng)表達(dá)于新生血管周圍；高氧組eNOS和iNOS蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，但主要強(qiáng)表達(dá)于新生血管下方視網(wǎng)膜組織，在突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核周圍未見表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論Apelin/APJ及NOS可能與氧誘導(dǎo)的新生小鼠增生性視網(wǎng)膜病變新生血管的發(fā)生有關(guān)。

Apelin； 視網(wǎng)膜； 新生血管形成； 氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變； 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是發(fā)生于早產(chǎn)兒的一種嚴(yán)重致盲性視網(wǎng)膜病變，其發(fā)病與出生后吸氧治療等密切相關(guān)，但ROP的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，已有的研究顯示視網(wǎng)膜新生血管的形成可能起主導(dǎo)作用。本研究在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)的新生小鼠模型上，探討血管生長(zhǎng)刺激因子apelin及其受體APJ、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是否參與了視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生，為預(yù)防和治療ROP提供新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 兔多克隆apelin和APJ抗體購(gòu)自Santa Cruz，兔多克隆eNOS和iNOS抗體購(gòu)自武漢博士德公司，Trizol和山羊抗兔IgG綠色DyLight 488熒光標(biāo)記Ⅱ抗購(gòu)自Invitrogen，Quantscript RT Kit和Real Master Mix(Probe)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2設(shè)備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常壓高氧氧艙，由我校低氧醫(yī)學(xué)研究所自制；CYES II型O2氣體測(cè)定儀；Beckman核酸蛋白測(cè)定儀；尼康倒置熒光顯微鏡;ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3動(dòng)物 7日齡的清潔級(jí)健康C57BL/6J乳鼠36只，母鼠7只，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2方法

2.1OIR模型的建立 高氧環(huán)境通過(guò)常壓高氧氧艙實(shí)現(xiàn)，具體是在自制的氧艙里充入濃度接近100%的醫(yī)用氧氣，使艙內(nèi)氧濃度維持在75%±2%。每24 h更換墊料、食物和鈉石灰。將36只7日齡乳鼠隨機(jī)均分成高氧組和對(duì)照組。將高氧組乳鼠分成2窩，每窩由2只母鼠間隔6 h交替進(jìn)入氧艙喂養(yǎng)，乳鼠持續(xù)在氧艙生長(zhǎng)5 d，再返回正常氧氣環(huán)境飼養(yǎng)5 d。對(duì)照組乳鼠在空氣中飼養(yǎng)10 d。

2.2組織取材 用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后處死乳鼠，取右眼放入0.1% DEPC水中，在解剖顯微鏡下用角膜剪沿眼球角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體和玻璃體。將視網(wǎng)膜與鞏膜及視網(wǎng)膜色素上皮層分離后，待測(cè)apelin和APJ。取左眼眼球置入4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于病理組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)熒光檢測(cè)。

2.3病理組織學(xué)檢查 于左眼眼球平行角膜至視神經(jīng)的矢狀位連續(xù)6 μm切片，間隔30 μm取1張切片，每只眼球取10張切片。切片經(jīng)HE染色行常規(guī)病理學(xué)檢查，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。統(tǒng)計(jì)平均每只眼球每張切片突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)僅計(jì)數(shù)與內(nèi)界膜有緊密聯(lián)系的血管內(nèi)皮細(xì)胞核，不包括與內(nèi)界膜無(wú)聯(lián)系的玻璃體腔內(nèi)的其它血管內(nèi)皮細(xì)胞核。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按Trizol說(shuō)明書提取實(shí)驗(yàn)各組小鼠視網(wǎng)膜的總RNA，測(cè)定A260/A280的比值(1.8～2.0)及總RNA含量。Quant Reverse Transcriptase一步法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，TaqMan探針?lè)ㄐ袑?shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。TaqMan探針由ABI公司提供，小鼠內(nèi)參照β-actin探針號(hào)為Mm00607939，apelin探針號(hào)為Mm00443562，APJ探針號(hào)為Mm00442191。以10倍稀釋模板梯度樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，目標(biāo)基因與內(nèi)參照基因擴(kuò)增效率接近100%情況下，以內(nèi)參照基因作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量，采用2-ΔΔCT計(jì)算apelin和APJ相對(duì)水平。ΔCT= CT目標(biāo)基因- CT內(nèi)參照基因；ΔΔCT=ΔCT高氧組-ΔCT對(duì)照組。

2.5免疫熒光組織化學(xué)法 取視網(wǎng)膜石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，PBS洗滌3次，正常山羊血清室溫封閉1 h，分別加入apelin、APJ、eNOS和iNOS Ⅰ抗(1∶100)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，羊抗兔488標(biāo)記的熒光Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min，PBS洗滌3次，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察，488標(biāo)記的羊抗兔IgG染apelin、APJ、eNOS和iNOS蛋白呈綠色熒光，DAPI染細(xì)胞核的顏色為藍(lán)色熒光。設(shè)陰性對(duì)照，以PBS替代Ⅰ抗。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成模率

對(duì)照組18只眼180張切片中，共計(jì)5張切片可見極少數(shù)突破內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜新生血管芽，其細(xì)胞核數(shù)為1～2個(gè)，余175張切片均未見視網(wǎng)膜新生血管芽，見圖1A；高氧組12眼120張切片均可見突破內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜新生血管芽，血管腔切面呈不規(guī)則擴(kuò)張，成模率100%，見圖1B。對(duì)照組18眼180張切片中視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)，平均每張切片為(0.30±0.21)，少于1個(gè)，而高氧組12眼120張切片中視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)，平均每張切片為(35.13±10.13)個(gè)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Figure 1. HE staining of retinal paraffin sections (×200). A: control group, the retina showing good and complete structure, without neovascular endothelial cell nuclei extending from retinal area into vitreous area; B: high-oxygen group, the retina showing slightly disordered structure, with many neovascular endothelial cell nuclei extending from retinal area into vitreous area (white arrows), and dilated blood vessels close to retinal surface (blue arrow).

圖1視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色

2視網(wǎng)膜組織apelin和APJmRNA表達(dá)結(jié)果

高氧組apelin mRNA表達(dá)水平比對(duì)照組高32.2倍(P<0.01)；高氧組APJ mRNA表達(dá)水平比對(duì)照組高17.6倍(P<0.01)，見表1。

3視網(wǎng)膜apelin、APJ、eNOS和iNOS蛋白的表達(dá)

3.1Apelin蛋白表達(dá)的分布特點(diǎn) 細(xì)胞核熒光染料DAPI染色顯示為藍(lán)色熒光，apelin蛋白表達(dá)陽(yáng)性染色顯示為綠色熒光。對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜完整，未見內(nèi)皮細(xì)胞核突破，整個(gè)視網(wǎng)膜未見apelin表達(dá)，見圖2A。高氧組可見許多藍(lán)色細(xì)胞核突破內(nèi)界膜，在這些細(xì)胞核周圍可見有大量apelin蛋白表達(dá)，此外，在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層血管及深層擴(kuò)張的血管周圍也可見綠色熒光apelin蛋白表達(dá)，見圖2B。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜組織apelin和APJmRNA的表達(dá)水平

Table 1. The expression levels of apelin and APJ mRNA in retinal tissues detected by real-time fluorescence quantitative PCR (ΔCT. Mean±SD.n=9)

GroupApelinAPJControl7.391±1.9079.37±1.23High-oxygen2.383±0.353**5.24±1.29**

**P<0.01vscontrol group.

Figure 2. The expression of apelin protein in retinal tissues (immunofluorescence staining, ×200). A: control group; B: high-oxygen group.

圖2視網(wǎng)膜組織apelin蛋白的免疫熒光染色

3.2APJ蛋白表達(dá)的分布特點(diǎn) 細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光，APJ蛋白表達(dá)陽(yáng)性染色為綠色熒光。APJ蛋白的表達(dá)特點(diǎn)與apelin相似。對(duì)照組視網(wǎng)膜未見明顯綠色熒光的APJ蛋白，見圖3A；高氧組可見綠色熒光APJ蛋白在突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核周圍，深層擴(kuò)張的血管周圍強(qiáng)表達(dá)，見圖3B。

Figure 3. The expression of APJ protein in retinal tissues (immunofluorescence staining, ×200). A: control group; B: high-oxygen group; C: negative control group.

圖3視網(wǎng)膜組織APJ蛋白的免疫熒光染色

3.3eNOS蛋白表達(dá)的分布特點(diǎn) 細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光，eNOS蛋白表達(dá)陽(yáng)性染色為綠色熒光。正常小鼠綠色熒光eNOS蛋白分布于整個(gè)視網(wǎng)膜，在內(nèi)核層細(xì)胞的胞漿和外叢狀層表達(dá)顯著，此外在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿、內(nèi)叢狀層、光感受器細(xì)胞層、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層均可見其表達(dá)，見圖4A。高氧組可見eNOS蛋白表達(dá)在各層均不同程度增強(qiáng)，在突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核周圍亦可見eNOS蛋白表達(dá)，但與周圍組織相比表達(dá)并未明顯增強(qiáng)，見圖4B。

3.4iNOS蛋白表達(dá)的分布特點(diǎn) 細(xì)胞核顯示為藍(lán)色熒光，iNOS蛋白表達(dá)陽(yáng)性染色為綠色熒光。正常小鼠綠色熒光iNOS蛋白表達(dá)主要分布于內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層也可見少量分布，見圖5A。高氧組綠色熒光的iNOS蛋白表達(dá)特點(diǎn)與eNOS蛋白基本一致，在新生血管下端的內(nèi)叢狀層表達(dá)明顯增強(qiáng)，在突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核周圍可見iNOS蛋白表達(dá)，但與周圍組織相比表達(dá)并未明顯增強(qiáng)，見圖5B。

Figure 4. The expression of eNOS protein in retinal tissues (immunofluorescence staining, ×400). A: control group; B: high-oxygen group.

圖4視網(wǎng)膜組織eNOS蛋白的免疫熒光染色

Figure 5. The expression of iNOS protein in retinal tissues (immunofluorescence staining, ×400). A: control group；B: high-oxygen group.

圖5視網(wǎng)膜組織iNOS蛋白的免疫熒光染色

討 論

近年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，早產(chǎn)兒的生存率明顯提高，ROP的發(fā)生率也呈顯著上升趨勢(shì)，然而ROP的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。以往學(xué)者認(rèn)為高濃度氧是導(dǎo)致ROP的主要原因，但現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)ROP的產(chǎn)生與“相對(duì)缺氧”有著密切關(guān)系。人類胚胎早期視網(wǎng)膜無(wú)血管，主要由玻璃體動(dòng)脈提供營(yíng)養(yǎng)。胎齡4個(gè)月時(shí)視網(wǎng)膜血管由視盤開始發(fā)生，逐漸向周邊延伸，胎齡8個(gè)月血管發(fā)育到達(dá)鼻側(cè)周邊部，直到足月時(shí)視網(wǎng)膜顳側(cè)血管才發(fā)育成熟。因此，早產(chǎn)嬰兒的周邊視網(wǎng)膜血管尚未發(fā)育完成。當(dāng)早產(chǎn)兒處于高濃度氧環(huán)境時(shí)，視網(wǎng)膜血管收縮、閉塞、停止發(fā)育，回至正常氧環(huán)境后，視網(wǎng)膜相對(duì)缺血缺氧引起大量血管生長(zhǎng)刺激因子的釋放，導(dǎo)致新生血管的發(fā)生。由于小鼠和大鼠在剛出生時(shí)視網(wǎng)膜血管尚未發(fā)育完全，因此是研究早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的良好動(dòng)物。大鼠模型通過(guò)改變氧艙氧濃度(50% 24 h，10% 24 h，再50% 24 h，如此循環(huán))的方法建立，雖然具有更接近臨床上早產(chǎn)兒吸氧狀態(tài)、眼球大而容易操作的優(yōu)點(diǎn)，但新生血管的發(fā)生率低，且與動(dòng)物品種、甚至同一品種不同實(shí)驗(yàn)室來(lái)源等有關(guān)[1]，在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)SD大鼠的成模率極低。目前經(jīng)典的模型是Smith等[2]建立的OIR小鼠模型，該模型視網(wǎng)膜血管新生的發(fā)生率可達(dá)100%且重復(fù)性好[3]，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Apelin是1998年發(fā)現(xiàn)的孤兒G蛋白受體APJ的天然配體[4]。1999年發(fā)現(xiàn)apelin/APJ在血管系統(tǒng)，特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)[5]。2002年Saint-Geniez等[6]發(fā)現(xiàn)apelin/APJ參與了生理性小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)生，并且具有獨(dú)特的表達(dá)方式。2004年Kasai等[7]發(fā)現(xiàn)apelin具有促進(jìn)猴視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，提示apelin可能是新的血管生長(zhǎng)刺激因子。為了進(jìn)一步研究apelin/APJ在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生中的作用，本實(shí)驗(yàn)在氧誘導(dǎo)的OIR小鼠模型上發(fā)現(xiàn)高氧組小鼠視網(wǎng)膜apelin及其受體APJ的基因表達(dá)明顯上調(diào)，這與Kasai等[7]的研究結(jié)果一致。2010年Kasai等[8]發(fā)現(xiàn)apelin和APJ mRNA在小鼠OIR模型中表達(dá)顯著增加，而apelin基因敲除小鼠在同樣的相對(duì)缺氧環(huán)境下幾乎不產(chǎn)生新生血管，提示apelin/APJ可能是缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生的先決條件。為了進(jìn)一步探討apelin/APJ在OIR中的作用特點(diǎn)，本研究利用免疫熒光染色檢測(cè)apelin和APJ蛋白在視網(wǎng)膜上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)apelin和APJ蛋白在高氧組，尤其是血管新生的部位(突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核即新生血管)表達(dá)顯著增強(qiáng)，表明apelin/APJ參與了視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生。此外在視網(wǎng)膜中間層血管(內(nèi)叢狀層)和深層血管(外叢狀層)可見血管管腔擴(kuò)大，apelin/APJ熒光亮度明顯增加，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道apelin具有擴(kuò)張血管的作用[9]，推測(cè)apelin在此可能起著擴(kuò)張血管增加血流的作用。

目前關(guān)于apelin/APJ促進(jìn)新生血管形成的分子機(jī)制尚不十分清楚。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在心血管系統(tǒng)，apelin通過(guò)激活eNOS引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，產(chǎn)生強(qiáng)有力的內(nèi)皮依賴的血管擴(kuò)張作用[10]，給予NOS抑制劑后，apelin的降壓作用被抑制，提示NO是apelin發(fā)揮作用的下游信號(hào)分子[11]。同時(shí)，許多研究表明NO在新生血管的形成中發(fā)揮重要的作用，NO是內(nèi)皮細(xì)胞的存活因子，可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，血管生長(zhǎng)刺激因子如VEGF、TGF-β、bFGF均可引起內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO[12]，并且低氧可以上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA水平，刺激其釋放NO[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高氧組eNOS和iNOS蛋白在光感受器細(xì)胞層和內(nèi)核層、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層表達(dá)明顯增強(qiáng)，在新生血管下端的內(nèi)叢狀層亦見強(qiáng)表達(dá)，但在突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核周圍未見明顯表達(dá)，提示eNOS和iNOS參與了視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生。eNOS和iNOS在新生血管下方組織的表達(dá)增強(qiáng)，釋放的NO可以通過(guò)旁分泌間接作用于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活、增殖和遷移，同時(shí)NO能起到擴(kuò)張血管、增加血流的作用從而間接輔助新生血管的發(fā)生，其具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。目前已有學(xué)者設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)了apelin受體的拮抗劑[14-15]，早期阻斷apelin受體表達(dá)可能有助于抑制血管新生，但其在視網(wǎng)膜血管新生疾病如ROP、增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用效果有待進(jìn)一步研究。

本研究在氧誘導(dǎo)的新生小鼠增生性視網(wǎng)膜病變模型上發(fā)現(xiàn)，apelin及其受體APJ和NOS參與了ROP視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生，但apelin與NOS之間的相互作用尚待進(jìn)一步研究。

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Up-regulationofapelinanditsreceptoraswellasnitricoxidesynthaseinneonatalmicewithproliferativeretinopathyinducedbyoxygen

WU Meng-ai1,2, CHEN Jie-ling1, 2, WANG Wei1, CHEN Hui-hui2, LIU Yuan-yuan2, YANG Shan-shan2, HU Liang-gang1, FAN Xiao-fang1, GONG Yong-sheng1

(1InstituteofHypoxiaMedicine,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,China;2CollegeofOptometryandOphthalmology,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325003,China.E-mail:fxbwzmc@126.com)

AIM: To explore whether apelin and its receptor (APJ) as well as nitric oxide synthase (NOS) were involved in the neovascularization of retinopathy of prematurity by observing their expression characteristics in the retina of a mouse model of oxygen-induced retinopathy.METHODSThirty-six 7-day-old C57BL/6J neonatal mice were randomly divided into high-oxygen group and control group. The mice in high-oxygen group were exposed to 75%±2% oxygen for 5 d, and then changed to normoxia for the next 5 d. The control ones were kept in a normoxic environment for 10 d. The mice in both groups were sacrificed on day 17 of life. The left eyes were isolated to make paraffin sections. The number of endothelial cell nuclei extending from the retinal area into the vitreous area was counted under microscope with HE staining to judge whether the model was successfully established, and immunofluorescence was performed to detect the protein expression of apelin, APJ, eNOS and iNOS. The retinas of the right eyes were dissected for applying real-time fluorescence quantitative PCR to detect the mRNA levels of apelin and APJ.RESULTSThe number of neovascular endothelial cell nuclei extending from the retinal area into the vitreous area in high-oxygen group was much higher than that in control group (35.13±10.13vs0.30±0.21,P<0.01).The mRNA levels of apelin and APJ were higher than those in control group (P<0.01), by 32.2 times and 17.6 times, respectively. The expression of apelin and APJ proteins was significantly increased in high-oxygen group, mainly around the neovessels. The expression of eNOS and iNOS proteins was also significantly increased in high-oxygen group, mainly in the retinal tissue under the neovessels, but not around the neovascular endothelial cell nuclei .CONCLUSIONApelin and its receptor as well as NOS may be involved in the neovascularization in oxygen-induced retinopathy.

Apelin; Retina; Neovascularization; Oxygen-induced retinopathy; Retinopathy of prematurity

R774.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.022

1000- 4718(2013)06- 1081- 05

2012- 09- 19

2013- 04- 23

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.Y2091033)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.2010R413012)；高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(第三軍醫(yī)大學(xué))資助項(xiàng)目(No.2009GK04;No.2011JSGY07)

△通訊作者 Tel： 0577-86699521； E-mail： fxbwzmc@126.com