樊啟黃， 姜 楓， 胡水旺， 唐昭亮， 姜 勇

(南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

JNK信號(hào)通路對(duì)NaAsO2誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞中hnRNP K蛋白聚集體形成的影響*

樊啟黃▲， 姜 楓▲， 胡水旺， 唐昭亮， 姜 勇△

(南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

目的觀察核不均一核糖核蛋白(hnRNP)K的表達(dá)與定位以及亞砷酸鈉(NaAsO2)刺激NIH3T3細(xì)胞的反應(yīng)情況及氧化應(yīng)激變化，探討JNK信號(hào)通路在hnRNP K蛋白聚集體形成中的作用。方法構(gòu)建重組載體pcDNA3-hnRNP K-HA，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察內(nèi)源性hnRNP K在細(xì)胞中的表達(dá)與定位，以及在NaAsO2不同刺激時(shí)間該蛋白聚集體的形成情況，并利用活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒測(cè)定胞內(nèi)ROS水平；給予JNK、MEK、PI3K/Akt、NF-κB和核轉(zhuǎn)運(yùn)等5種信號(hào)通路的抑制劑預(yù)處理后，觀察聚集體的變化情況。結(jié)果重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，熒光顯微鏡觀察顯示hnRNP K主要定位于胞核中，而重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后，可見(jiàn)胞內(nèi)有蛋白聚集體形成并隨NaAsO2刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增，且過(guò)表達(dá)hnRNP K可抑制NaAsO2刺激細(xì)胞生成ROS；JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125明顯抑制聚集體的形成。結(jié)論hnRNP K主要定位在NIH3T3細(xì)胞的胞核中，胞漿少量分布；NaAsO2可誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞形成hnRNP K蛋白聚集體，此聚集體可抑制胞內(nèi)ROS生成，且該聚集體的形成有賴于JNK介導(dǎo)的信號(hào)通路。

核不均一核糖核蛋白K； 亞砷酸鈉； 聚集體； JNK信號(hào)通路

核不均一核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, hnRNP K)是一種進(jìn)化高度保守的核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白，屬于核不均一核糖核蛋白(hnRNPs)家族成員之一[1]。該蛋白家族是存在于真核生物體內(nèi)的一種多功能蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)大約20種(A～U)，它們具有類似的結(jié)構(gòu)特征和胞內(nèi)分布。研究表明，hnRNPs在多種生物學(xué)過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要角色，如新合成的mRNA前體經(jīng)過(guò)加工剪接，才能成為成熟的mRNA，此過(guò)程受特異的hnRNPs所調(diào)控；hnRNP A2/B1可用于肺癌輔助診斷的標(biāo)志[2]。hnRNP K與其它hnRNPs相比有不同的結(jié)構(gòu)特征，它含有3個(gè)與DNA-RNA結(jié)合的KH結(jié)構(gòu)域(K homology domain)KH1、KH2和KH3，1個(gè)KI域(K interactive region)和1個(gè)C端蛋白激酶連接域，這與hnRNP K的許多生物學(xué)功能息息相關(guān),如調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[3]，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及腫瘤轉(zhuǎn)移等細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)節(jié)[4]，同時(shí)，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5-6]。hnRNP K的研究多集中在肝癌、肺癌、慢性髓細(xì)胞白血病等惡性腫瘤中，而在如氧化應(yīng)激、慢性炎癥等相關(guān)研究中并未深入。Toshiyuki等[7]研究顯示，熒光顯微鏡下可觀察到hnRNP K與其結(jié)合蛋白R(shí)NA結(jié)合基序蛋白42(RNA-binding motif protein 42, RBM42)，均可在亞砷酸鹽刺激MTD-1 A細(xì)胞后形成應(yīng)激顆粒(stress granules, SGs)，且共定位于SGs中，相互獨(dú)立存在。因此，本研究想通過(guò)構(gòu)建hnRNP K真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，過(guò)表達(dá)hnRNP K蛋白，熒光顯微鏡觀察亞砷酸鈉(sodium arsenite, NaAsO2)刺激細(xì)胞的反應(yīng)情況，并進(jìn)一步探討該現(xiàn)象是否與氧化應(yīng)激以及應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)。這些將為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)hnRNP K在細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

SPF級(jí)6～8周C57/BL6小鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所)；CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)；熒光顯微鏡(Zeiss)；SpectraMax M5 型酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；Petri皿和細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)；真核表達(dá)載體pcDNA3-HA、腸桿菌菌株DH5α和NIH3T3細(xì)胞系(本室保存)；DNA ladder和Taq DNA聚合酶(TaKaRa)；限制性內(nèi)切酶、High DNA連接酶(TaKaRa)；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒(Axygen)，RNeasy Mini Kit、RT-PCT兩步法試劑盒和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(HyClone)；血凝素(hemagglutinin,HA)抗體(Cell Signaling Technology)；hnRNP K兔源抗體(Bioworld Technology)，Alexa Fluor 488偶聯(lián)的抗兔IgG和Alexa Fluor 594偶聯(lián)的抗鼠IgG(Molecular Probes)；活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成由華大基因公司完成。

2方法

2.1小鼠肝臟組織總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 摘除C57/BL6小鼠眼球，放血處死，迅速取出1/4肝小葉組織，液氮速凍下研磨，加入約1 mL Trizol，用Trizol法提取總RNA。以制備的總RNA為模板，按照Toyobo RT-PCR兩步法試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)獲得小鼠的cDNA。

2.2pcDNA3-hnRNP K-HA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)含有KpnI和EcoR I酶切位點(diǎn)的上、下游引物，以RT-PCR得到的hnRNP K cDNA為模板，擴(kuò)增得到帶有酶切位點(diǎn)的hnRNP K編碼序列。上游引物5’-TT GGTACCATGGAGACCGAACAGCC-3’，下游引物5’-CGGAATTCGAAAAACTTTCCAGAATACTGCTT-3’，不含終止密碼子。以Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，用KpnI和EcoR I進(jìn)行雙酶切，載體pcDNA3-HA也同時(shí)采用KpnI和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收后，用High DNA連接酶37 ℃連接2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌并接種到含有氨芐青霉素的LB瓊脂糖培養(yǎng)板，37 ℃孵箱培養(yǎng)12 h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振搖過(guò)夜。小量提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行菌液PCR、酶切及測(cè)序鑒定，構(gòu)建質(zhì)粒命名為pcDNA3-hnRNP K-HA。

2.3脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及表達(dá) NIH3T3細(xì)胞用含10% FBS的DMEM，于5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前18～24 h，將1×105細(xì)胞鋪于3.5 cm皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至約70%融合時(shí)，用PBS洗3次，加入400 μL含有10% FBS的培養(yǎng)基，然后，分別將1.0 μg重組質(zhì)粒pcDNA3-hnRNP K-HA和空載體質(zhì)粒pcDNA3-HA(對(duì)照)用Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至終體積50 μL，轉(zhuǎn)染試劑則按LipofectamineTM2000∶質(zhì)粒為1∶3，溶于50 μL Opti-MEM，混勻后室溫靜置5 min，將分別含有質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑50 μL Opti-MEM充分混勻后的，于室溫下孵育20 min。最后將100 μL含有DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基加入上述3.5 cm皿中。細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，PBS洗3次，加入2 mL含有10% FBS的培養(yǎng)基，于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

2.4Western blotting檢測(cè) NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，Ⅰ抗anti-HA(1∶1 000)和anti-β-actin(1∶3 000)4 ℃孵育過(guò)夜后，與1∶6 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗鼠IgG室溫孵育70 min，用Pierce公司的SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，并在Kodak IS4000R圖像工作站上采集圖像。

2.5細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)

2.5.1檢測(cè)內(nèi)源性hnRNP K定位實(shí)驗(yàn) 接種1×104細(xì)胞至Petri皿中，12 h后補(bǔ)液，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h左右，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，150 μL PBS洗滌3次，每次5 min；4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS洗3次；含0.1% Triton X-100的PBS(PBST)透化細(xì)胞膜5 min，PBS洗3次；3% BSA封閉2 h，PBST洗3次，然后用1% BSA稀釋hnRNP K兔源抗體(1∶200)孵育2 h，PBST洗3次；用1% BSA稀釋Alexa Fluor 488偶聯(lián)的抗兔IgG(1∶6 000)室溫孵育1 h，PBST洗3次；50 mg/L DAPI(1∶200)染核，用PBS稀釋，室溫染色15 min，PBS洗3次；于Zeiss熒光顯微鏡下觀察和圖像采集。

2.5.2NaAsO2刺激實(shí)驗(yàn) 接種轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3和重組載體pcDNA3-hnRNP K-HA的NIH3T3細(xì)胞，按每皿1×104細(xì)胞鋪至Petri皿中，12 h后補(bǔ)液，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h左右，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%時(shí)換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)8 h，實(shí)驗(yàn)組分別給予200 μmol/L NaAsO2刺激0 min、15 min、30 min和60 min，免疫染色步驟同上，Ⅰ抗用1% BSA稀釋HA-Tag特異性抗體(1∶200)孵育，Ⅱ抗用1% BSA稀釋Alexa Flour 594偶聯(lián)的抗鼠IgG(1∶6 000)孵育。

2.5.3通路抑制劑預(yù)處理實(shí)驗(yàn) 接種轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3和重組載體pcDNA3-hnRNP K-HA的NIH3T3細(xì)胞，按每皿1×104細(xì)胞鋪至Petri皿中，12 h后補(bǔ)液，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h左右，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%時(shí)換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)8 h，實(shí)驗(yàn)組采用JNK、MEK、PI3K/Akt、NF-κB以及核轉(zhuǎn)運(yùn)等5種信號(hào)通路抑制劑[依次為： SP600125(200 nmol/L)、PD98059(200 nmol/L)、wortmannin(200 nmol/L)、BAY11-7082(5 μmol/L)和WGA(20 μg/L)]預(yù)處理轉(zhuǎn)染后的NIH3T3細(xì)胞1 h，再給予200 μmol/L NaAsO2刺激1 h，免疫染色步驟同上。

2.6ROS的檢測(cè) 按步驟2～3脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的方法，培養(yǎng)2個(gè)3.5 cm皿NIH3T3細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3和重組質(zhì)粒pcDNA3-hnRNP K-HA，轉(zhuǎn)染24 h后，分別消化細(xì)胞，以每孔1×104接種于Costar? 96孔板內(nèi)，共設(shè)立6組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞并分別依次給予NaAsO2刺激0 min、30 min和60 min；陽(yáng)性對(duì)照組(試劑盒中陽(yáng)性刺激物ROSup處理)，另設(shè)空白對(duì)照組(不鋪細(xì)胞，給予DCFH-DA探針?lè)跤?，每組做3個(gè)復(fù)孔。其中，實(shí)驗(yàn)組給予200 μmol/L NaAsO2刺激細(xì)胞，而陽(yáng)性對(duì)照組加入1∶1 000 ROSup稀釋液刺激。接著應(yīng)用ROS檢測(cè)試劑盒，按照1∶1 000用無(wú)血清的培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，每孔100 μL稀釋液，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用SpectraMax M5型酶標(biāo)儀，在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(least significant difference, LSD)-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1pcDNA3-hnRNPK-HA重組質(zhì)粒的鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒菌液經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)1 400 bp左右的DNA片段，與插入的DNA序列大小相符，經(jīng)KpnI和EcoR I雙酶切后可見(jiàn)5.4 kb和1 400 bp左右的2個(gè)條帶，符合預(yù)期大小，見(jiàn)圖1。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3-hnRNP K-HA構(gòu)建正確。

Figure 1. Identification of pcDNA3-hnRNP K-HA fusion protein expression vector by agarose gel electrophoresis. M: 1 kb marker; 1: pcDNA3-HA digested byKpnI andEcoR I; 2: hnRNP K coding sequence digested byKpnI andEcoR I; 3: amplified hnRNP K from pcDNA3-hnRNP K-HA.

圖1pcDNA3-hnRNPK-HA融合蛋白表達(dá)載體的電泳鑒定

2Westernblotting檢測(cè)hnRNPK-HA融合蛋白的表達(dá)

pcDNA3-hnRNP K-HA重組質(zhì)粒在NIH3T3細(xì)胞中可有效表達(dá)，且?guī)A標(biāo)簽的融合蛋白分子量約58 kD，與小鼠hnRNP K分子量相近，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Expression of hnRNP K-HA fusion protein in NIH3T3 cells detected by Western blotting. 1: un-transfected cells; 2: cells transfected with empty vector; 3: cells transfected with recombinant vector.

圖2Westernblotting檢測(cè)hnRNPK-HA在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

3hnRNPK在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)與定位

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示內(nèi)源性hnRNP K主要定位于胞核中，胞漿中有少量分布，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The expression and localization of hnRNP K in NIH3T3 cells (immunofluorescent staining，×600).

圖3hnRNPK在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)與定位

4NaAsO2誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞hnRNPK蛋白聚集體的形成

免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示，外源性hnRNP K在NIH3T3細(xì)胞中有表達(dá)，過(guò)表達(dá)的蛋白在胞漿胞核中均有分布，主要分布在胞漿中。轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pcDNA3的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到標(biāo)記的蛋白熒光信號(hào)，正常情況下，融合蛋白呈彌散性分布在胞漿和胞核中，而NaAsO2刺激后，細(xì)胞內(nèi)有較為明顯的紅色熒光聚集體的形成，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增。15 min后無(wú)明顯變化，30 min形成微小顆粒狀物，60 min形成的微小聚集體更為明顯，見(jiàn)圖4。

5hnRNPK抑制NIH3T3細(xì)胞ROS的生成

陽(yáng)性對(duì)照組ROSup刺激細(xì)胞后，胞內(nèi)ROS水平明顯上升。未轉(zhuǎn)染重組載體的實(shí)驗(yàn)組中，NaAsO2刺激30 min和60 min與未刺激組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染重組載體后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升趨勢(shì)減緩，NaAsO2刺激60 min同未轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。這些結(jié)果表明，NaAsO2誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞產(chǎn)生ROS，而hnRNP K降低細(xì)胞內(nèi)ROS生成水平。

6NaAsO2誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞hnRNPK蛋白聚集體的形成依賴于JNK通路

由于外源性hnRNP K在200 μmol/L NaAsO2刺激1 h時(shí)，NIH3T3細(xì)胞中蛋白聚集體的形成最多且最為明顯，因此，選擇1 h為NaAsO2刺激時(shí)間，使用SP600125、PD98059、wortmannin、BAY11-7082和WGA等5種抑制劑預(yù)處理細(xì)胞1 h后，檢測(cè)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白聚集體形成的影響。給予JNK通路特異性抑制劑SP600125預(yù)處理后，細(xì)胞中的蛋白聚集體明顯解聚，呈彌散分布，恢復(fù)到了靜息狀態(tài)下水平，而給予MEK抑制劑PD98059、PI3K/Akt抑制劑wortmannin、NF-κB抑制劑BAY11-7082以及出核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑WGA預(yù)處理細(xì)胞，NaAsO2刺激1 h后，細(xì)胞內(nèi)的蛋白聚集體無(wú)明顯變化。SP600125可抑制NaAsO2誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞hnRNP K蛋白聚集體的形成，提示該聚集體的形成依賴于JNK信號(hào)通路，見(jiàn)圖6。

Figure 4. NaAsO2stimulated the formation of hnRNP K-HA fusion protein aggregates in NIH3T3 cells (immunofluorescent staining，×600). Control: NIH3T3 cells transfected with pcDNA3; 0 min, 15 min, 30 min and 60 min: cells were transfected with pcDNA3-hnRNP K-HA, and stimulated with 200 μmol/L NaAsO2for 0, 15, 30 and 60 min, respectively.

圖4NaAsO2刺激NIH3T3細(xì)胞hnRNPK-HA融合蛋白聚集體的形成

Figure 5. hnRNP K suppressed intracellular ROS generation in NIH3T3 cells.NC: negative control; PC: positive control, cells stimulated with ROSup; EV: cells transfected with empty vector; 0 min, 30 min and 60 min: cells were transfected with recombinant vector, and stimulated with 200 μmol/L NaAsO2for 0, 30 and 60 min, respectively. Mean±SD.n=3.##P<0.01vs0 min;*P<0.05vsnon-transfection.

圖5hnRNPK抑制NIH3T3細(xì)胞內(nèi)ROS生成

討 論

研究表明，hnRNP K參與染色體的重塑，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移都與該家族蛋白有關(guān)，且已有研究證實(shí)hnRNP K在胰腺癌[8]、肺癌[9]、前列腺癌[10]等多種腫瘤細(xì)胞和組織中呈高表達(dá)，主要通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞增殖有關(guān)基因的表達(dá)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由此可見(jiàn)，包括hnRNP K在內(nèi)的hnRNPs家族成員在各種腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此，研究hnRNPs蛋白家族參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制，對(duì)于我們認(rèn)識(shí)其與氧化應(yīng)激相關(guān)的各種疾病具有重要意義。

本研究中，細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，內(nèi)源性hnRNP K蛋白主要定位于胞核中，而在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞中，融合蛋白主要表達(dá)定位于胞漿中，且NaAsO2不同時(shí)間刺激后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光聚集體，胞漿中的融合蛋白以聚集體形式呈點(diǎn)狀分布，且隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)有遞增趨勢(shì)。蛋白聚集體被認(rèn)為是細(xì)胞的一種防御反應(yīng)，通常細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊蛋白會(huì)被蛋白酶體降解，但在熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激等環(huán)境因素作用下，一些錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)不被降解，反而會(huì)形成蛋白聚集體[11]。它與許多疾病，如神經(jīng)退行性疾病包括肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茲海默氏癥和瘋牛病等關(guān)系密切[12]。其中，有研究發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞在受環(huán)境刺激如氧化應(yīng)激、熱休克、紫外照射時(shí)，在胞質(zhì)中會(huì)形成致密顆粒狀聚合體，即SGs。SGs 可以在壓力情況下作為mRNA 的儲(chǔ)存場(chǎng)所，當(dāng)應(yīng)激解除時(shí)，SGs解聚，mRNA從SGs中釋放出來(lái)，可以繼續(xù)參與翻譯[13-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)中所觀察到的蛋白聚集體，是否為SGs，還需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

Figure 6. Effects of five different pathway inhibitors on the formation of hnRNP K protein aggregates in NIH3T3 cells (immunofluorescent staining，×600).

圖65種不同通路抑制劑預(yù)處理NIH3T3細(xì)胞對(duì)hnRNPK蛋白聚集體形成的影響

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中hnRNP A1出現(xiàn)大量的積累，呈現(xiàn)高磷酸化狀態(tài)，從而影響細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，這一過(guò)程可能與p38應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其下游信號(hào)通路有關(guān)[15]。Yang等[16]研究表明，hnRNP A18也參與了細(xì)胞應(yīng)激的調(diào)控，在hnRNP A18過(guò)表達(dá)時(shí)，可以減少紫外線照射對(duì)細(xì)胞的殺傷程度，而抑制hnRNP A18的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞對(duì)于紫外線殺傷的敏感性增加，可見(jiàn)hnRNP A18對(duì)細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)也有重要的保護(hù)作用。而hnRNP K與hnRNP A1/A18隸屬于同一家族蛋白，它是否也參與了某種信號(hào)通路的調(diào)控呢？本實(shí)驗(yàn)中，NaAsO2誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞hnRNP K形成的蛋白聚集體，受到JNK特異性抑制劑SP600125的抑制作用。而JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的一員，許多外界應(yīng)激因素(如物理射線、熱休克、氧化損傷)等都能激活JNK，因此JNK為介導(dǎo)應(yīng)激過(guò)程的重要激酶分子[17]，大量實(shí)驗(yàn)研究顯示JNK信號(hào)通路在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及多種疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。因此，本研究中，NaAsO2誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞內(nèi)hnRNP K蛋白聚集體的形成，且過(guò)表達(dá)hnRNP K可拮抗NaAsO2刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS水平，兩者可能存在某種關(guān)系，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該聚集體的形成依賴于JNK信號(hào)通路?？傊@些為我們進(jìn)一步探討hnRNP K與氧化應(yīng)激損傷等相關(guān)生物學(xué)功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此，進(jìn)一步明確JNK是如何影響hnRNP K蛋白聚集體形成的機(jī)制，進(jìn)而探索其相關(guān)生物學(xué)功能具有重要意義。

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EffectsofJNKsignalingpathwayonhnRNPKproteinaggregatesinNIH3T3cellstreatedwithsodiumarsenite

FAN Qi-huang, JIANG Feng, HU Shui-wang, TANG Zhao-liang, JIANG Yong

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:jiang48231@163.com)

AIM: To explore the role of JNK signaling pathway in the formation of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) K protein aggregates by observing the expression and localization of hnRNP K in NIH3T3 cells induced by sodium arsenite(NaAsO2).METHODSThe recombinant vector pcDNA3-hnRNP K-HA was constructed and transfected into NIH3T3 cells. The expression and localization of endogenous hnRNP K and distribution of the protein aggregates stimulated with NaAsO2at different time points were observed under fluorescence microscope. The level of reactive oxygen species (ROS) in the cells was detected by a ROS assay kit. After pretreated with the inhibitors of 5 signaling pathways (JNK, MEK, PI3K/Akt, NF-κB and nuclear transport), the changes of the protein aggregates were observed.RESULTSThe recombinant plasmid was correctly constructed. The hnRNP K was mainly distributed in the nucleus. The intracellular fluorescent aggregates increased with the prolonging stimulation of NaAsO2in the cells transfected with the recombinant plasmid, and the overexpression of hnRNP K inhibited ROS generation in the cells induced by NaAsO2. SP600125, an inhibitor of JNK signaling pathway, significantly inhibited the formation of protein aggregates.CONCLUSIONThe hnRNP K is primarily located in the nucleus of NIH3T3 cells, with a small amount in the cytoplasm. The formation of protein aggregates is significant after NaAsO2stimulation, which can restrain the level of intracellular ROS, and the process is involved in JNK signaling pathway.

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K; Sodium arsenite; Aggregates; JNK signaling pathway

Q256

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.020

1000- 4718(2013)06- 1070- 06

2013- 03- 25

2013- 05- 14

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.81030055)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 10251051501000003)；教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(No.IRT0731)

△通訊作者 Tel: 020-61648231; E-mail: jiang48231@163.com

▲并列第1作者