陳 賽， 蔡詩達(dá)， 張 楚， 鄧 琳， 趙 陽， 于德欽， 劉海旺， 張友才， 李樹壯

(大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

TRPM2通道在星形膠質(zhì)細(xì)胞氨中毒中的作用*

陳 賽， 蔡詩達(dá)， 張 楚， 鄧 琳， 趙 陽， 于德欽， 劉海旺， 張友才， 李樹壯1△

(大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

目的通過建立星形膠質(zhì)細(xì)胞氨中毒的模型，探討瞬時受體電位M2 (TRPM2)陽離子通道在其中發(fā)揮的作用。方法分離并培養(yǎng)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。實驗分為5組：對照組、氯化銨處理組、氯化銨+3-氨基苯甲酰胺 (3-AB)處理組、氯化銨+PJ-34 處理組和TRPM2基因敲除小鼠+氧化銨處理組。測定細(xì)胞的活性、caspase-3 活性、細(xì)胞壞死和體積大小，以此來衡量氨中毒的程度。用全細(xì)胞膜片鉗記錄TRPM2通道電流變化。結(jié)果氯化銨引起細(xì)胞腫脹伴隨著細(xì)胞壞死。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制劑3-AB和PJ-34抑制了氯化銨引起的陽離子電流，并減輕了氯化銨引起的相應(yīng)細(xì)胞傷害。TRPM2基因敲除小鼠組細(xì)胞的傷害明顯減輕(P<0.01)。結(jié)論TRMP2通道的激活是細(xì)胞暴露于氯化銨后發(fā)生腫脹、壞死的必要步驟；氯化銨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹與壞死密切相關(guān)。

瞬時受體電位M2陽離子通道；星形細(xì)胞；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶

星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹和腦水腫引起的顱內(nèi)壓增高是急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)的并發(fā)癥之一[1]。已有很多體內(nèi)和體外實驗表明,高血氨均可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹。有研究證實，氨可通過激活p38信號途徑引起星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫[2]，但尚不能解釋氨中毒引起星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的所有機制。谷氨酰胺是氨解毒過程中生成的，盡管已有研究表明腦水腫的進(jìn)展依賴于星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酰胺的聚集，但Jayakumar等[3]的研究表明，谷氨酰胺的聚集引起細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，繼而引起細(xì)胞腫脹，并非谷氨酰胺的聚集引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓增高而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹。因此，活性氧造成星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹并死亡的機制尚不明確。

瞬時受體電位M2(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)陽離子通道是近年來研究的熱點之一。它起初曾被命名為TRPC7 和 LTRPC2，屬于非選擇性陽離子熱敏通道，在大量免疫細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)[4]。它可允許鈉、鉀和鈣離子通過，且可被腺苷二磷酸核糖和過氧化氫激活[5]。此外，激活的TRPM2通道還可介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的細(xì)胞死亡[6]。既然TRPM2通道的激活能引起鈉和鈣離子超載，那么TRPM2通道也可能參與氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹的過程。通過本實驗，我們探討TRPM2通道在氨中毒誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹中所起到的作用。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞及培養(yǎng)

原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分離自出生2～3 d后的C57BL/6小鼠和C57BL/6種系中TRPM2基因敲除(knockout,KO)小鼠的大腦皮質(zhì)(由大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心和日本國立自然科學(xué)研究機構(gòu)提供)。取材過程如下,麻醉新生小鼠后，取其大腦皮質(zhì)在冰冷的Leibovitz’s L-15培養(yǎng)液(Invitrogen)中剪碎。然后將其放入富含木瓜蛋白酶(1×104U/L; Worthington Biochemical)的Earle’s平衡鹽溶液中，置于37 ℃恒溫環(huán)境下消化30 min。用70 μm尼龍濾器過濾細(xì)胞，然后以2.5×105cells/cm2的密度植入培養(yǎng)瓶。細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[7]：將DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基置于CO2濃度為5% 的潮濕空氣中培養(yǎng)細(xì)胞，并加入10% FBS、4×104U/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素和1.5 g/L NaHCO3。每2～3 d更換培養(yǎng)液。對培養(yǎng)瓶中細(xì)胞作傳代培養(yǎng)并在2～3周內(nèi)利用。某些實驗中，細(xì)胞在使用前需轉(zhuǎn)移到96孔板或包被聚乙烯亞胺的蓋玻片上培養(yǎng)1～2 d。

2方法

2.1細(xì)胞活性的鑒定 參照文獻(xiàn)[8]，用MTT比色分析法確定細(xì)胞活性 (Cell Counting Kit-8; Dojindo)。使用caspase-3、-7試劑盒(Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay; Promega)檢測caspase-3、-7的活性，評估細(xì)胞凋亡程度；采用具有數(shù)碼相機的倒置IX71顯微鏡來觀察用Hoechst 33342(2 mg/L)和碘化丙啶(PI； 5 mg/L)雙重染色的細(xì)胞，進(jìn)而評估細(xì)胞壞死及細(xì)胞凋亡。

2.2細(xì)胞體積的測量 室溫下通過CDA-500顆粒分析儀(Sysmex)測量平均細(xì)胞體積。將儀器用已知體積的乳膠微球校準(zhǔn)后，細(xì)胞群的平均體積可通過測量細(xì)胞體積分布計算得出。

2.3膜片鉗實驗 在室溫下進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。膜片電極由硼硅玻璃毛坯管通過P-2000激光微電極拉引器(Sutter Instrument)拉制而成，當(dāng)管內(nèi)充滿細(xì)胞內(nèi)液時會產(chǎn)生2～4 MΩ的電阻。用Axopatch 200B膜片鉗放大器做記錄(Molecular Devices)；同時用pCLAMP 9.2軟件(Molecular Devices)控制數(shù)據(jù)的采集與分析。串聯(lián)電阻<5 MΩ。給予控制電壓為0 mV持續(xù)時間為2 s的 ±60 mV的交變階梯脈沖，監(jiān)控電流激活和恢復(fù)的時程，每15 s重復(fù)運用1次。使用預(yù)電壓0 mV持續(xù)時間為600 ms、增量為20 mV、測試電壓±100 mV的階梯脈沖，觀察電流分布的電壓相關(guān)性。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞外液成分(mmol/L)為：140 NaCl, 4 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 5葡萄糖, 10 TEA-Cl, 10 HEPES (pH 7.4, 305 mosmol/kg H2O)。 如果實驗需要避免Na+的干擾，可用N-甲基-D-葡萄糖胺氯化物[N-methyl-D-glucamine (NMDG)-Cl]取代NaCl。細(xì)胞內(nèi)液的成分(mmol/L)為：140 CsOH, 140葡萄糖酸, 8 NaCl, 2 MgCl2, 3 Na2ATP, 0.15 Na2GTP, 10 HEPES (pH 7.2, 295 mosmol/kg H2O)。

2.4RT-PCR 快速解凍冷凍的星形膠質(zhì)細(xì)胞。用RNeasy(Qiagen)分離出總RNA, 經(jīng)過Oligotex(Qiagen)分離純化得到Poly(A)+RNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA。得到的cDNA中加入寡核苷酸(正義寡核苷酸5’-AGCGCCCGGCATCTCCTCTATC-3’,反義寡核苷酸5’-ATTGTCTGTGTTCCTTGGGTCATCC-3’),設(shè)立94 ℃ 20 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min作為1個反應(yīng)循環(huán)，共30個循環(huán)。

3統(tǒng)計學(xué)處理

以上實驗用不同批次的星形膠質(zhì)細(xì)胞重復(fù)做4～8次，數(shù)據(jù)通過單因素方差分析和Turkey兩兩比較法處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1由氯化銨引起的細(xì)胞壞死需要聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]的活化

3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)和PJ-34明顯抑制了由氯化銨誘導(dǎo)的細(xì)胞腫脹(圖1A)及細(xì)胞活性降低(圖1B)。并且，暴露在氯化銨中PI陽性的細(xì)胞在3-AB或PJ-34存在的條件下數(shù)量有所減少，說明細(xì)胞壞死的數(shù)量下降(圖2)。盡管如此，對照組細(xì)胞隨著氯化銨濃度以及暴露時間的改變其caspase-3活性并無明顯區(qū)別(圖3)。這些結(jié)果表明PARP影響由氯化銨引起的細(xì)胞壞死，而不影響細(xì)胞凋亡。

Figure 1. Both 3-AB and PJ-34 significantly inhibited NH4Cl-triggered cell death in astrocytes. A: 3-AB (100 μmol/L) and PJ-34 (1 μmol/L) attenuated NH4Cl (5 mmol/L)-induced astrocyte swelling; B: 3-AB and PJ-34 increased astrocyte viability.Mean±SD.n=4～5.**P<0.01vsNH4Cl.

圖13-AB和PJ-34抑制NH4Cl引起的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞損害

Figure 2. Both 3-AB (100 μmol/L) and PJ-34 (1 μmol/L) inhibited NH4Cl (5 mmol)-triggered necrosis of astrocytes, but not apoptosis [Hoechst 33342 (green) and propidium iodide (red) staining, ×200]. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsNH4Cl.

圖23-AB和PJ-34抑制NH4Cl引起的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死

Figure 3. Caspase-3 activity was not significantly changed after exposure to NH4Cl in a time- and concentration-dependent manner. A: no marked difference of caspase-3 activity was observed in the astrocytes exposed to different concentrations of NH4Cl; B: caspase-3 activity was not significantly changed in a time-dependent manner.

圖3各組caspase-3活性無明顯差異

2非選擇性陽離子流的觸發(fā)與暴露于氯化銨后誘導(dǎo)的細(xì)胞腫脹有關(guān)

在沒有氯化銨存在的條件下，除了一些小的基礎(chǔ)電流，我們沒有檢測到其它電流。而細(xì)胞在5 mmol/L的氯化銨處理8～16 h后，一些大的宏觀電流可被測到。細(xì)胞外液中用NMDG+取代Na+后，這種大電流被抑制(圖4)。這表明該電流是非選擇性陽離子流。有趣的是，電流在超極化電位時很快失活。

Figure 4. Representative records of whole-cell current on astrocytes. A: normal cells; B: cells treated with 5 mmol/L NH4Cl for 8～16 h (the current was inhibited by NMDG); C:I-Vrelationships for the current density in response to step pulses. Each point represents the mean data obtained from 10 different cells.

圖4NH4Cl激發(fā)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞陽離子通道開放

氯化銨在 3-AB或PJ-34存在的條件下不能觸發(fā)陽離子流(圖5)。這個結(jié)果說明離子流的觸發(fā)是由PARP的激活介導(dǎo)的，并且通過氨激活陽離子通道所致的離子內(nèi)流誘導(dǎo)了細(xì)胞腫脹。

Figure 5. Both 3-AB and PJ-34 inhibited whole-cell current on astrocytes.A:NH4Cl (5 mmol/L)+3-AB (100 mmol/L);B: NH4Cl (5 mmol/L)+PJ-34 (1 μmol/L);C：I-Vrelationships for the current density in response to step pulses. Each point represents the mean data obtained from 10 different cells.

圖53-AB和PJ-34抑制NH4Cl觸發(fā)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞陽離子電流

3TRPM2通道促進(jìn)了由氯化銨引起的細(xì)胞壞死

氨處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后6 h、12 h、24 h,TRPM2的表達(dá)增強(圖6)。這些結(jié)果表明，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，氨會刺激TRPM2基因蛋白表達(dá)。GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)參照蛋白，CD11為小膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)參照蛋白，βⅢ-tubulin為神經(jīng)元的內(nèi)參照蛋白，圖6所示也說明實驗組織來源于星形膠質(zhì)細(xì)胞，而無小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元(這2種細(xì)胞無需刺激就表達(dá)TRPM2)的污染。

氯化銨能使野生型(wild-type,WT)小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2表達(dá)增加，但不能增加KO小鼠TRPM2的表達(dá)(圖7)。氯化銨在KO小鼠星形細(xì)胞中不能觸發(fā)陽離子流(圖8)。氯化銨不能誘導(dǎo)KO小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹(圖9A)，并且KO小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞對氯化銨中毒具有一定的抵抗能力(圖9B)。KO小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞暴露于氯化銨后壞死數(shù)減少(圖10)。這些結(jié)果都強有力地證明了TRPM2通道參與了由氯化銨引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死。

Figure 6. Up-regulation of TRPM2 mRNA in NH4Cl (5 mmol/L)-treated astrocytes. Mean±SD.**P<0.01vs0 h.

圖6NH4Cl引起小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2表達(dá)

Figure 7. TRPM2 mRNA expression in wild-type (WT) andTRPM2 knockout (KO) astrocytes treated with (6 h) or without (0 h) NH4Cl (5 mmol/L).

圖7WT和KO小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞分別在不用NH4Cl處理和用NH4Cl處理6h后，其TRPM2mRNA的表達(dá)情況

Figure 8. Representative record of whole-cell current on 5 mmol/L NH4Cl-treated astrocytes isolated fromTRPM2 KO mice.

圖8TRPM2基因敲除小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的電流情況

討 論

目前的研究證實，高濃度氯化銨可導(dǎo)致原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹和壞死。氯化銨引發(fā)的細(xì)胞腫脹和壞死是由PARP的活化介導(dǎo)的。我們發(fā)現(xiàn)暴露在氯化銨中的星形膠質(zhì)細(xì)胞的TRPM2通道可通過PARP激活。在敲除TRPM2基因的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，氨不能引發(fā)細(xì)胞腫脹和壞死。這些結(jié)果說明TRPM2通道的激活是氨引起星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死的基礎(chǔ)。

Figure 9.TRPM2 knockout eliminated NH4Cl (5 mmol/L)-induced astrocyte injury.A:TRPM2 knockout attenuated NH4Cl-induced astrocyte swelling; B:TRPM2 knockout increased astrocyte viability.Mean±SD.n=3～5.**P<0.01vsWT.

圖9TRPM2基因敲除對NH4Cl引起的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹與活性改變的影響

Figure 10.TRPM2 knockout reduced NH4Cl (5 mmol)-induced necrosis of astrocytes [Hoechst 33342 (green) and propidium iodide (red) staining, ×200]. Mean±SD.n=3～5.**P<0.01vsWT+NH4Cl.

圖10TRPM2基因敲除對NH4Cl引發(fā)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死的影響

氨是一種神經(jīng)毒素，可造成機體的多種紊亂。谷氨酰胺合成酶可以解除星形膠質(zhì)細(xì)胞的氨毒，以達(dá)到防止神經(jīng)元氨中毒的目的。氨濃度上升可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞損傷。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是闡明氨中毒原理的模型。目前的研究表明，氨引起的細(xì)胞死亡與caspase無關(guān)，并且細(xì)胞用氨處理后，PI染色陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有所增加。這些都表明氨造成了星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死。持續(xù)的細(xì)胞腫脹，又稱為細(xì)胞壞死性體積膨脹，與細(xì)胞壞死有關(guān)[9]。通過本實驗可得知星形膠質(zhì)細(xì)胞暴露在氯化銨中可發(fā)生細(xì)胞腫脹，這與先前的研究結(jié)果一致，因此進(jìn)一步證明了星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡是壞死性的。

氨誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹的機制現(xiàn)在還不十分明確。起初認(rèn)為氨解毒過程中過度積累的谷氨酰胺滲透到星形膠質(zhì)細(xì)胞中導(dǎo)致了細(xì)胞腫脹。雖然谷氨酰胺合成酶抑制劑在防止腦腫脹和星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹方面有效[4]，然而，并沒有證據(jù)表明細(xì)胞腫脹與細(xì)胞內(nèi)谷氨酸鹽的含量有關(guān)[5]。Jayakumar等[6]的報告稱暴露在氨中的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸鹽濃度升高的速度要快于細(xì)胞腫脹發(fā)生的速度，并且在發(fā)生腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞中并沒有觀察到谷氨酸鹽的積累。因此，我們重點觀察其它有關(guān)谷氨酸鹽代謝的反應(yīng)是否與氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹有關(guān)。

通過一系列的研究，我們證實了PARP抑制劑(3-AB和PJ-34)可防止星形膠質(zhì)細(xì)胞的氨中毒。PARP是一種核酶。氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起DNA的損傷，從而活化該酶?；罨腜ARP水解β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)，并在受體蛋白上形成腺苷二磷酸核糖聚合物[10]。PARP在溫和的應(yīng)力條件下可以修復(fù)DNA[11]。另一方面，大量PARP會水解NAD+，從而促進(jìn)細(xì)胞的死亡。此過程中NAD+的消耗與ATP的消耗同步[12]。PARP介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是壞死性的[13]。因此，PARP參與了由氨引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死這一過程也是理所當(dāng)然的。

那么這些信號是如何誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹的呢？我們已經(jīng)知道離子通道在細(xì)胞體積的調(diào)節(jié)和細(xì)胞死亡中起到了重要的作用[9]。目前的研究表明在暴露于氨的星形膠質(zhì)細(xì)胞中可以觀察到非選擇性陽離子通道。這個通道在處于超極化電位時展現(xiàn)出了時間依賴性失活現(xiàn)象，這與 TRPM2通道的特點相似。其余的幾個實驗也進(jìn)一步證實了氨可能觸發(fā)能通過TRPM2通道的離子流。首先，由氨觸發(fā)的陽離子流可被3種已知的TRPM2通道阻斷劑所抑制。其次，施加 PARP抑制劑后，在暴露于氨的星形膠質(zhì)細(xì)胞中不能檢測出陽離子流；因為PARP抑制劑阻礙腺苷二磷酸核糖的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制TRPM2通道激活。再次，在缺乏TRPM2通道的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，我們觀察不到氨觸發(fā)的離子流。重要的是，TRPM2通道離子的功能表達(dá)與氨引發(fā)的細(xì)胞腫脹和壞死有著密切的關(guān)系。這些結(jié)果表明TRPM2通道的激活在星形膠質(zhì)細(xì)胞的氨中毒方面起到關(guān)鍵作用。

(致謝:對日本國立自然科學(xué)研究機構(gòu)生理學(xué)研究所Okada教授給于部分實驗支持表示衷心感謝。)

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TRPM2channelisessentialforammoniaintoxicationinastrocytes

CHEN Sai, CAI Shi-da, ZHANG Chu，DENG Lin, ZHAO Yang, YU De-qin, LIU Hai-wang, ZHANG You-cai, LI Shu-zhuang

(DepartmentofPhysiology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China.E-mail:shuzhuangli@126.com)

AIM: To study the effects of transient receptor potential melastatin 2 (TRPM2) cation channel on ammonia intoxication in astrocytes.METHODSPrimary astrocytes were isolated, cultured and divided into 5 groups: control group, ammonium chloride (NH4Cl) treatment group, NH4Cl+3-aminobenzamide (3-AB) treatment group, NH4Cl+PJ-34 treatment group, andTRPM2 knockout+NH4Cl treatment group. Cell viability, caspase-3 activity, cell necrosis and cell volume were measured to assess the extent of ammonia toxicity. Whole-cell patch-clamp was performed to record the currents via TRPM2 channels.RESULTSNH4Cl caused cell swelling accompanied with cell necrosis. The poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors, 3-AB and PJ-34, inhibited the cation currents activated by NH4Cl, and attenuated NH4Cl-induced cell damage. InTRPM2-deficient astrocytes, decreased cell damage was observed.CONCLUSIONTRPM2 activation is essential for cell swelling and necrosis in astrocytes exposed to NH4Cl. NH4Cl-triggered astrocyte swelling is closely correlated with necrosis.

Transient receptor potential melastatin 2 cation channel; Astrocytes; Poly(ADP-ribose) polymerase

R741.02

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.015

1000- 4718(2013)06- 1039- 07

2012- 05- 17

2013- 01- 17

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30971065)；大連市科技計劃項目(No.2012E12SF074)；遼寧省教育廳基金資助項目(No.2009A194)

△通訊作者Tel： 0411-86110353； E-mail: shuzhuangli@126.com