徐天嬌， 曾菊絨△， 胥曉麗， 陳 琳， 彌 曼， 魏 明， 李 萍

(1西安醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，陜西 西安710021； 2陜西省人民醫(yī)院病理科，陜西 西安 710068)

胰島素與硒合用對糖尿病大鼠心肌重構(gòu)的影響*

徐天嬌1， 曾菊絨1△， 胥曉麗1， 陳 琳2， 彌 曼1， 魏 明1， 李 萍1

(1西安醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，陜西 西安710021；2陜西省人民醫(yī)院病理科，陜西 西安 710068)

目的觀察胰島素與硒合用對糖尿病心肌病大鼠心肌重構(gòu)的影響并初步探討其機(jī)制。方法SD大鼠經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，誘導(dǎo)12周后建成糖尿病大鼠心肌重構(gòu)動(dòng)物模型。采用One TouchⅡ血糖儀和血糖試紙測定血糖水平；微柱法測定糖化血紅蛋白濃度；酶學(xué)法測定甘油三酯和總膽固醇的含量；Mallory三色染色檢測心肌組織內(nèi)膠原纖維含量的變化；雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清TNF-α的動(dòng)態(tài)變化，免疫組化檢測各組心肌組織TNF-α的表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，模型組大鼠糖脂代謝紊亂，心臟功能明顯下降(P<0.01)，心肌組織異常膠原纖維大量堆積，血液及心肌組織中TNF-α的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。胰島素與硒合用比單用胰島素治療更能明顯改善糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂，減輕心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，抑制血液及心肌組織中TNF-α的表達(dá)(P<0.01)，改善心臟的結(jié)構(gòu)與功能。結(jié)論胰島素與硒合用對糖尿病心肌病大鼠心肌重構(gòu)有明顯的改善作用，其對TNF-α表達(dá)的抑制可能是其作用的分子機(jī)制之一。

胰島素； 亞硒酸鈉； 糖尿??； 心肌重構(gòu)； 腫瘤壞死因子

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，具有極高的病死率和致殘率[1]，其病理生理特點(diǎn)為左心室舒張功能障礙，晚期也有收縮功能的降低。心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)和心肌間質(zhì)纖維化是左心室舒張和收縮功能障礙的主要病理基礎(chǔ)[2]。對糖尿病的有效治療是控制心功能惡化的關(guān)鍵。胰島素的降糖效果迅速且明顯，但長期大量使用療效降低，并引起低血糖、冠心病等副作用。因此，研制新的組方藥物可能會(huì)為糖尿病的防治及胰島素的應(yīng)用展現(xiàn)嶄新的前景。本研究室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明，胰島素與硒合用能明顯降低糖尿病大鼠的血糖及血脂，改善心肌的能量代謝障礙,說明胰島素與硒合用存在可行性，并摸索出兩藥的合理配比劑量是1 U·kg-1∶180 μg·kg-1[3]。但胰島素與硒聯(lián)合用藥對于糖尿病心肌病所致的心肌重構(gòu)是否具有防治作用尚不明確，本實(shí)驗(yàn)旨在闡明兩藥聯(lián)合對糖尿病心肌病大鼠心肌重構(gòu)的作用，并初步探討其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1主要儀器和試劑

清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重180～200 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號為SCXK(陜)2010-0006。分籠飼養(yǎng)，房間溫度保持在25 ℃左右，濕度在50%左右。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)和亞硒酸鈉購自Sigma，中效胰島素購自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院(諾和靈公司)。血糖儀和血糖試紙(強(qiáng)生公司)；SABC 免疫組化試劑盒和DAB 顯色試劑盒購于博士德公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

2糖尿病心肌病大鼠造模及分組

SD大鼠38只，隨機(jī)選8只作為正常對照組(control)，其余30只為模型組。模型組采用一次性腹腔注射STZ 50 mg·kg-1復(fù)制大鼠糖尿病模型，1 周后于大鼠尾尖采血，血糖儀測定血糖，并測尿糖。血糖>16.7 mmol·L-1、尿糖+++～++++者確定為糖尿病模型誘導(dǎo)成功。30只誘導(dǎo)成功的大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。(1)糖尿病心肌病模型組(DCM)：自由飲食和進(jìn)水；(2)胰島素(insulin,Ins)干預(yù)組(DCM+Ins)：皮下注射胰島素1 U·kg-1·d-1；(3)胰島素與亞硒酸鈉聯(lián)合干預(yù)組(DCM+Ins+Se)：皮下注射胰島素1 U·kg-1·d-1，同時(shí)管飼亞硒酸鈉180 μg·kg-1·d-1。正常對照組腹腔注射生理鹽水，以上各組均以普通飼料持續(xù)喂養(yǎng)12周[4]。

3生化指標(biāo)測定

各組大鼠喂養(yǎng)12周后，處死前腹主動(dòng)脈采血檢測血糖、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)和血脂。采用One TouchⅡ血糖儀和血糖試紙測定血糖水平；微柱法測定HbA1c濃度；酶學(xué)法測定甘油三酯 (triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)的含量。

4血清TNF-α表達(dá)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測

各組分別于第2、4、6、8、10、12周，空腹12 h后，采用尾部采血2 mL，注入試管中，待凝固后分離血清，低溫冷凍離心(3 000 r·min-1，4 ℃) 15 min。雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測TNF-α，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

5大鼠心臟功能檢測

各組大鼠處死之前，先監(jiān)測血流動(dòng)力學(xué)。動(dòng)物麻醉后分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，將內(nèi)徑約為1 mm的PE-50聚乙烯導(dǎo)管逆行插入左心室，當(dāng)血壓波變?yōu)榫哂忻黠@舒張期而且峰頂平坦的波形時(shí)，表明導(dǎo)管已經(jīng)進(jìn)入心室。穩(wěn)定20 min后，記錄左室收縮末壓(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

6心肌組織膠原纖維的Mallory染色及定量分析

處死動(dòng)物后，迅速開胸，摘取心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗心腔中的血塊，剪除心臟周圍結(jié)締組織和血管，濾紙吸干水分，取左室心肌組織，按Mallory原法固定，處理包埋，切片脫蠟至水，結(jié)果使膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞核深紅色，胞漿紅色。采用DT2000型圖像分析軟件2.0進(jìn)行拍照和分析，測量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF=心肌膠原面積/所測視野總面積，所有標(biāo)本隨機(jī)取8個(gè)視野測量，取平均值。

7免疫組化檢測心肌組織TNF-α的表達(dá)

取心肌組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片；3% H2O2室溫孵育10 min，正常山羊血清封閉20 min；滴加1∶500 TNF-α抗體，37 ℃孵育1 h，緩沖液清洗；滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，37 ℃ 孵育20 min；PBS洗3次，滴加SABC 37 ℃ 孵育20 min；DAB顯色，PBS清洗；蘇木素輕度復(fù)染，乙醇脫水，中性樹膠封片。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1動(dòng)物一般情況

模型組多食、多飲、多尿，體質(zhì)量明顯減輕，血糖水平升高，符合糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；藥物干預(yù)各組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給予藥物，各組動(dòng)物均以普通飼料喂養(yǎng)12周后，模型組死亡2只，藥物干預(yù)組各死亡1只，尸檢結(jié)果表明死于感染及糖尿病并發(fā)癥。對照組為8只。

2胰島素與硒聯(lián)合應(yīng)用對糖尿病大鼠糖脂代謝的影響

與對照組比較，模型組及藥物干預(yù)組血糖、HbAIc、TC和TG水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，胰島素單用組及胰島素與硒聯(lián)合用藥組的血糖、HbA1c、TC和TG水平均明顯降低(P<0.01)；與胰島素單用組相比，聯(lián)合用藥組各指標(biāo)下降更為明顯(P<0.01)。表明胰島素與硒聯(lián)合用藥對改善糖尿病大鼠的糖脂代謝更為顯著，見表1。

表1胰島素與硒聯(lián)合用藥對糖尿病大鼠糖脂代謝的影響

Table 1. Effects of combination of insulin(Ins,1 U·kg-1) and selenium(Se,180 μg·kg-1) on blood glucose and blood lipid in DCM rats(Mean±SD)

GroupnBG(mmol·L-1)HbA1c(%)TC(mmol/L)TG(mmol/L)Control85.42±0.705.17±0.641.62±0.140.73±0.08DCM821.46±3.76△△8.98±1.02△△2.98±0.24△△1.83±0.09△△DCM+Ins915.48±1.74△△**7.02±0.45△△**2.90±1.89△△1.51±0.07△△**DCM+Ins+Se99.03±1.08△△**##5.85±0.33**##2.22±0.23△△**##1.10±0.15△△**##

△△P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsDCM group；##P<0.01vsDCM+Ins group.

3各組動(dòng)物心功能參數(shù)比較

由表2可見，與對照組比較，模型組及藥物干預(yù)組+dp/dtmax明顯增大(P<0.01)，LVSP、LVEDP和-dp/dtmax明顯減小(P<0.01)。說明經(jīng)STZ誘導(dǎo)12周后，心臟收縮及舒張功能均有不同程度的下降，與對照組比較，模型組心功能降低最為明顯(P<0.01)，從心功能方面提示了動(dòng)物模型的制備比較成功；與模型組比較，藥物干預(yù)各組心臟功能明顯改善(P<0.01)，但與胰島素給藥組比較，胰島素與硒合用組心功能的改善更為明顯(P<0.01)。

表2 各組心功能參數(shù)的比較

△△P<0.01vscontrol group；*P<0.05，**P<0.01vsDCM group；##P<0.01vsDCM+Ins group.

4心肌膠原纖維Mallory染色

正常對照組心肌纖維呈束狀分布，排列整齊、致密，斷裂不明顯，膠原纖維堆積少。模型組心肌纖維呈現(xiàn)進(jìn)行性排列紊亂、增粗，肌纖維間隙明顯增寬，并可見大量異常膠原纖維堆積。胰島素單獨(dú)給藥組及聯(lián)合用藥組心肌纖維排列紊亂、增粗及間隙增寬等現(xiàn)象均明顯減輕，異常膠原纖維堆積均顯著減少，但聯(lián)合用藥組比單用胰島素治療改善更明顯,見圖1。這說明胰島素與硒聯(lián)合應(yīng)用治療糖尿病能明顯改善心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)。

Figure 1. Mallory staining of myocardium collagen fiber in rats (×400). A:control； B: DCM； C: DCM+Ins； D: DCM+Ins+Se.

圖1心肌膠原纖維Mallory染色

5大鼠心肌膠原纖維定量分析

與對照組比較，模型組及藥物干預(yù)各組CVF均增高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，藥物干預(yù)各組CVF均不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與胰島素單獨(dú)給藥組比較，胰島素與硒聯(lián)合應(yīng)用組CVF降低更加明顯(P<0.01),提示聯(lián)合用藥能明顯減少心肌膠原纖維堆積,見圖2。

Figure 2. Comparison of collagen volume fraction in myocardium among groups.Mean±SD.△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsDCM group；##P<0.01vsDCM+Ins group.

圖2各組心肌膠原纖維容積分?jǐn)?shù)的比較

6各組大鼠血清TNF-α的動(dòng)態(tài)變化

由圖3可見，模型組大鼠血清TNF-α濃度呈時(shí)間依賴性升高，明顯高于其它組，提示糖尿病大鼠TNF-α在血清中的濃度隨著病變程度的加重而升高。藥物干預(yù)后TNF-α均有明顯下降，但依然高于正常水平。然而胰島素與硒聯(lián)合用藥TNF-α濃度的下降較單用胰島素組更為顯著。

Figure 3. Dynamic changes of TNF-α in serum of rats in each group. Mean±SD.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDCM;△△P<0.01vsDCM+Ins.

圖3各組大鼠血清TNF-α的動(dòng)態(tài)變化

7心肌組織中TNF-α表達(dá)

鏡下可見，TNF-α表達(dá)部位主要在心肌間質(zhì)及成纖維細(xì)胞胞漿，其胞核內(nèi)和心肌細(xì)胞內(nèi)較少，陽性結(jié)果為胞漿出現(xiàn)不同濃度的棕黃色顆粒。與正常對照組比較，模型組心肌間質(zhì)及成纖維細(xì)胞胞漿TNF-α染色明顯增強(qiáng)；藥物干預(yù)各組染色均比模型組減弱，但胰島素與硒聯(lián)合用藥TNF-α染色減弱比單用胰島素組更明顯，見圖4。

Figure 4. Immunohistochemical staining of TNF-α in the myocardium of rats (×400).A: control; B: DCM; C: DCM+Ins; D: DCM+Ins+Se.

圖4免疫組化檢測大鼠心肌組織TNF-α表達(dá)

討 論

心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)和間質(zhì)纖維化是糖尿病心肌病的特征性病理改變，最終將導(dǎo)致心室收縮及舒張功能障礙，誘發(fā)心力衰竭[5]。糖代謝紊亂是加速糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要原因，高血糖作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，直接引起心肌損害而導(dǎo)致心臟功能惡化。因此，安全而有效地控制高血糖對治療糖尿病心肌病具有十分重要的意義。硒是人體必須的微量元素，其缺乏將會(huì)導(dǎo)致腫瘤和心血管疾病的產(chǎn)生。將胰島素與硒聯(lián)合應(yīng)用是基于硒的抗氧化作用及類胰島素樣作用[6-7]。硒的類胰島素樣作用已經(jīng)在糖利用[8]和糖代謝[9]方面得到了證實(shí)。Ghosh等[10]的研究也表明，糖尿病大鼠經(jīng)硒治療后，胰島素水平明顯升高。因此胰島素與硒聯(lián)合應(yīng)用應(yīng)該優(yōu)于單用胰島素治療。前期的研究結(jié)果已證明，將胰島素與硒合用治療糖尿病，明顯改善了糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂，為延緩并防治心肌損傷提供了條件[3]。

本實(shí)驗(yàn)采用STZ成功誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌重構(gòu)動(dòng)物模型，12 周后通過心功能指標(biāo)檢測，模型組有明顯的心臟舒縮功能障礙，Mallory染色顯示心肌纖維排列紊亂、增粗及間隙增寬，異常膠原纖維堆積增多，表明長期的糖脂代謝異常必將導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)破壞及功能的惡化。胰島素與硒聯(lián)合用藥比單獨(dú)應(yīng)用胰島素治療更能顯著改善心臟的結(jié)構(gòu)及功能。

研究表明，炎癥在糖尿病心肌重構(gòu)過程中起著十分重要的作用[11]。TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，在正常血清及心肌組織表達(dá)較少，但在病理因素的刺激下，TNF-α分泌增加，參與心肌重構(gòu)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組從第2周開始血清中的TNF-α持續(xù)高表達(dá)，第12周檢測結(jié)果顯示血清及心肌組織TNF-α的表達(dá)均明顯高于對照組。胰島素與硒合用比單獨(dú)應(yīng)用胰島素治療更能有效抑制血液及心肌組織中TNF-α的表達(dá)，減輕心肌重構(gòu)的程度，改善心功能。

總之，本研究結(jié)果表明：胰島素與硒合用比單獨(dú)使用胰島素治療更能有效改善糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂，減輕心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，改善心臟的結(jié)構(gòu)與功能，拮抗單用胰島素治療易引起冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)兩藥合用和單用胰島素時(shí)胰島素的劑量一致，故合用時(shí)減少胰島素劑量能否達(dá)到同樣的效果，尚有待進(jìn)一步研究。此外，胰島素與硒聯(lián)合用藥對糖尿病大鼠心肌保護(hù)作用的詳細(xì)分子機(jī)制及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亦有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步闡明。

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Effectofinsulincombinedwithseleniumonmyocardialremodelingindiabeticrats

XU Tian-jiao1, ZENG Ju-rong1, XU Xiao-li1, CHEN Lin2, MI Man1, WEI Ming1, LI Ping1

(1DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2DepartmentofPathology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China.E-mail:jrzeng988@163.com)

AIM: To investigate the effects of insulin combined with selenium on myocardial remodeling in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats.METHODSThe animal model of diabetic cardiomyopathy was induced by intraperitoneal injection of STZ (50 mg/kg) in rats. The level of blood glucose was estimated using One Touch SureStep blood glucose meter. Hemoglobin A1c level was detected by microcolumn assay. Triglyceride and total cholesterol were measured by enzymatic method. Collagen content in the myocardium was determined by Mallory staining. The expression of tumor necrosis factor α (TNF-α) in the serum and myocardium was observed by the methods of ELISA and immunohistochemistry, respectively.RESULTSCompared with control group, the animals in model group showed metabolic disorders of glucose and lipid, and the cardiac function declined significantly (P<0.01).The myocardial cells showed disorder of distribution, filament breakage and collagen hyperplasia,and serum and myocardial TNF-α levels were significantly elevated.Insulin in combination with selenium significantly decreased the levels of blood glucose and lipid, and markedly inhibited the expression of TNF-α in the serum and myocardium than those in the rats administered with insulin alone (P<0.01).CONCLUSIONCombination of insulin and selenium significantly improves the structure and function of the heart by down-regulation of TNF-α.

Insulin; Sodium selenite; Diabetes mellitus; Myocardial remodeling; Tumor necrosis factor

R963

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.006

1000- 4718(2013)06- 0993- 05

2012- 12- 10

2013- 04- 10

陜西省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃(No. 12JK0710)

△通訊作者 Tel: 029-86177562; E-mail: jrzeng988@163.com