何婉媚， 曾 勉， 易 慧， 蔣玉潔， 常敏嬋

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院MICU，廣東 廣州 510080)

Ghrelin對(duì)膿毒癥肺損傷大鼠肺泡巨噬細(xì)胞及肺組織iNOS表達(dá)的影響*

何婉媚， 曾 勉△， 易 慧， 蔣玉潔， 常敏嬋

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院MICU，廣東 廣州 510080)

目的觀察ghrelin對(duì)膿毒癥肺損傷大鼠肺泡巨噬細(xì)胞及肺組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表達(dá)的影響。方法SD雄性大鼠分為假手術(shù)組、膿毒癥組及ghrelin治療組，前2組各設(shè)術(shù)后6 h、12 h和20 h亞組。通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture, CLP)建立膿毒癥模型，ghrelin治療組于術(shù)后3 h及15 h腹腔注射ghrelin，術(shù)后20 h取材。各組按術(shù)后既定時(shí)間行支氣管肺泡灌洗收集肺泡巨噬細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞中iNOS mRNA的表達(dá)水平。另一部分大鼠則在術(shù)后20 h采集右肺，行肺病理學(xué)檢查及Western blotting檢測(cè)肺組織iNOS蛋白表達(dá)。結(jié)果膿毒癥組在CLP術(shù)后6 h、12 h和20 h肺泡巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平分別為1.33±0.05、1.44±0.08和1.57±0.11，均高于假手術(shù)組(P<0.05)，并不隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高；但在術(shù)后20 h卻低于ghrelin治療組(2.27±0.37；P<0.05)。Ghrelin治療組CLP術(shù)后20 h肺組織iNOS蛋白表達(dá)水平(0.87± 0.03)低于膿毒癥組(P<0.05)。Ghrelin治療組肺組織病理學(xué)評(píng)分(5.83±0.477)較膿毒癥組(7.83±0.75)低，2組均高于假手術(shù)組(P<0.05)。結(jié)論CLP術(shù)后6～20 h，大鼠肺泡巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平升高，但無時(shí)間依賴性。Ghrelin對(duì)膿毒癥大鼠肺泡巨噬細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)起上調(diào)作用，而對(duì)肺組織iNOS蛋白表達(dá)起抑制作用，減輕肺損傷程度。

Ghrelin； 膿毒癥； 肺損傷； 一氧化氮合酶； 肺泡巨噬細(xì)胞

生長(zhǎng)激素釋放肽ghrelin是1999年在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種由28個(gè)氨基酸組成的內(nèi)源性的生長(zhǎng)激素釋放激素受體的配體。人們發(fā)現(xiàn)外源性給予ghrelin可使急性肺損傷(acute lung injury, ALI)動(dòng)物的肺損傷程度和死亡率下降[1-2]，這與ghrelin抑制NF-κB活化的作用有關(guān)[2]。NF-κB調(diào)控包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)在內(nèi)的多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，激活NF-κB可增加iNOS mRNA的表達(dá)[3]。Chen等[1]在含肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和ghrelin后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性提高。iNOS與ALI的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。敲除iNOS基因的小鼠在注射LPS后，肺損傷的程度較野生型小鼠顯著減輕[4]。此外，肺泡巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞內(nèi)iNOS的活性可影響膿毒癥肺部微血管的通透性與氧化應(yīng)激的程度[5]。這與ghrelin改善肺損傷的作用似乎存在矛盾。另一方面，目前的研究顯示ghrelin對(duì)iNOS表達(dá)的影響不一[6-9]，國(guó)內(nèi)外尚未見ghrelin對(duì)ALI肺泡巨噬細(xì)胞和肺組織iNOS表達(dá)的影響的研究報(bào)道。為更好了解ghrelin對(duì)膿毒癥肺組織iNOS表達(dá)的影響，我們建立盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)所致的膿毒癥肺損傷大鼠模型，擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察不同時(shí)點(diǎn)肺泡巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)水平變化以及外源性給予ghrelin對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞和肺組織iNOS表達(dá)的影響，探討ghrelin對(duì)ALI的影響程度，為其應(yīng)用于臨床提供更多的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)分組

動(dòng)物選自中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重280～330 g，動(dòng)物使用許可證分別為SCXK(粵)2009-0011和SYXK(粵)2007-0081。將80只大鼠隨機(jī)分配至10個(gè)組，分別為A、B、C、D、E、F、G、H、I和J組，每組8只大鼠。B、D、F和I組均通過CLP建立膿毒癥模型[膿毒癥組(CLP組)]，G和J組在建立CLP模型后3 h及15 h給予ghrelin干預(yù)[ghrelin治療組(CLP+ghrelin組)]，A、C、E和H組行假手術(shù)[假手術(shù)組(sham)]。A和B組及C和D組分別在術(shù)后6 h及12 h行支氣管肺泡灌洗，E、F和G組則在術(shù)后20 h行支氣管肺泡灌洗。H、I和J組各組均于術(shù)后20 h處死大鼠，采集右上肺葉存于-80 ℃?zhèn)溆茫蚁路稳~置于10%中性甲醛固定液中。

2膿毒癥模型制作

采用CLP制作膿毒癥模型，術(shù)前不禁食、水。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。1%戊巴比妥 50 mg/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，沿腹正中線作2 cm切口，距回盲瓣0.5 cm的部位予3/0縫合線環(huán)形結(jié)扎盲腸，用18號(hào)注射器針頭貫通穿刺盲腸2次，輕輕擠壓腸管使腸道內(nèi)容物自穿刺孔溢出，原位回納盲腸，逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后立即皮下注射無菌生理鹽水30 mL/kg，以補(bǔ)充術(shù)中體液丟失及抗休克。假手術(shù)組則在找到盲腸后，將其外置于腹外2 min后按原位回納腹腔，余步驟同手術(shù)組。

3藥物干預(yù)

G組及J組于術(shù)后3 h及15 h腹腔內(nèi)注射ghrelin(Enzo產(chǎn)品)。按文獻(xiàn)資料[2,10]，注射藥物總劑量為40 nmol/kg，按時(shí)點(diǎn)每次給予20 nmol/kg，溶解于1 mL生理鹽水后注射；其余各組注射1 mL生理鹽水作為對(duì)照。

4標(biāo)本采集

4.1支氣管肺泡灌洗及肺泡巨噬細(xì)胞的收集與純化 參照文獻(xiàn)[1]方法提取及純化肺泡巨噬細(xì)胞。按既定時(shí)間將大鼠的氣管切開插入氣管導(dǎo)管，分3次經(jīng)導(dǎo)管緩慢注入無菌生理鹽水，共15 mL，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)回收率大約85%～90%。將BALF離心(4 ℃、800 r/min)10 min，棄上清，無菌PBS液洗滌細(xì)胞沉淀物2次，加入含10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞存活率>90%。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×109/L后種板(35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿)，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，獲得貼壁的純化肺泡巨噬細(xì)胞。經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色鑒定該方法獲得的貼壁肺泡巨噬細(xì)胞純度>90%。

4.2肺泡巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的檢測(cè) 按Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，按RT試劑盒合成cDNA，PCR擴(kuò)增：PCR引物由上海生工生物公司合成，iNOS上游引物5′-CCT GGA GGT TCT AGA TGA GAG T-3′,下游引物5′-CTT CAG GTT ATT GAT CCA AGT G-3′；iNOS擴(kuò)增片段為451 bp。β-actin上游引物5′-CCA TTG AAC ACG GCA TTG-3′,下游引物5′-TAC GAC CAG AGG CAT ACA-3′。β-actin擴(kuò)增片段為234 bp。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃補(bǔ)平5 min，內(nèi)參照基因28個(gè)循環(huán)，目的基因38個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外線燈下觀察拍照，用Gel-Pro Analyzer圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，以iNOS/β-actin比值表示iNOS mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。

4.3Western blotting測(cè)定肺組織iNOS 研磨、裂解右上肺葉提取組織總蛋白，取20 μg變性后蛋白提取液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，I抗(Abcam公司的抗iNOS多克隆抗體1∶500或β-actin單克隆抗體1∶1 000)4 ℃孵育過夜，兔II抗(1∶2 000)(廣州昂科公司)室溫孵育1 h，洗膜；應(yīng)用增強(qiáng)的化學(xué)放射發(fā)光法(ECL)標(biāo)記結(jié)合信號(hào)，X線曝光，以上操作每一樣品重復(fù)2次。采用Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析，以iNOS蛋白條帶吸光度值與對(duì)應(yīng)β-actin蛋白條帶吸光度值間的比值對(duì)iNOS蛋白表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

4.4肺組織病理檢查 右下肺葉組織予10%中性甲醛固定48 h后，脫水石蠟包埋制備石蠟切片，經(jīng)透明、水化后，予蘇木素、伊紅染色，最后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察支氣管黏膜、黏膜下、肺組織形態(tài)和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，于×200鏡下隨機(jī)選擇視野進(jìn)行觀察，拍照，參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行各項(xiàng)評(píng)分：分別對(duì)毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞、肺泡腔纖維蛋白及中性粒細(xì)胞滲出、氣道黏膜上皮細(xì)胞脫落以及肺泡間隔情況評(píng)分后計(jì)算各項(xiàng)的總分。

4.5CLP術(shù)后20 h的死亡率 觀察H、I和J 3組大鼠在CLP術(shù)后20 h內(nèi)的死亡情況，并統(tǒng)計(jì)死亡率。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 13.0 for Windows 軟件處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM表示)，方差齊者，采用方差分析進(jìn)行分析；各組間多重比較采用LSD法進(jìn)行分析，分類資料采用卡方檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1膿毒癥模型檢驗(yàn)

于術(shù)后10 h隨機(jī)抽取模型組大鼠進(jìn)行血培養(yǎng)，可見大腸埃希氏菌，本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了大鼠膿毒癥模型。

2肺泡巨噬細(xì)胞活力和純度的測(cè)定

臺(tái)盼藍(lán)染色后，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。鏡下巨噬細(xì)胞大部分呈圓形，折光性強(qiáng)?；罴?xì)胞不著色，死細(xì)胞藍(lán)染，活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比表示細(xì)胞活力，經(jīng)檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞活力均>90%，見圖1A。高倍鏡下觀察瑞氏-吉姆薩染色后的細(xì)胞形態(tài)，見圖1B，可見肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞大小不一，核大藍(lán)染，呈腎形或橢圓形，多偏一側(cè)；胞質(zhì)呈灰藍(lán)色，部分胞質(zhì)內(nèi)可見吞噬顆粒，如白色箭頭所示。計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞的百分比表示細(xì)胞純度，本實(shí)驗(yàn)方法所得肺泡巨噬細(xì)胞純度均>90%。

Figure 1. Alveolar macrophages. A: trypan blue staining; B: Wright-Giemsa staining.

圖1肺泡巨噬細(xì)胞

3肺泡巨噬細(xì)胞iNOSmRNA表達(dá)

經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定所提取RNA的A260/A280在1.8～2.0；經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見各處理組總RNA 28S和18S區(qū)帶，且28S區(qū)帶亮度約為18S的2倍。

與假手術(shù)組比較，在6、12和20 h，膿毒癥組iNOS mRNA顯著升高(P<0.05，P<0.05，P<0.01)；術(shù)后20 h，ghrelin治療組較假手術(shù)組(P<0.01)及膿毒癥組(P<0.05)升高。然而在20 h內(nèi)，膿毒癥組各時(shí)點(diǎn)之間的iNOS mRNA的表達(dá)無顯著差異，見圖2、表1。

Figure 2. RT-PCR analysis of iNOS mRNA expression in alveolar macrophages from each group. A, C, E: sham group; B, D, F: CLP group; G: CLP+ghrelin group.

圖2各組iNOSDNA瓊脂糖電泳條帶

表1肺泡巨噬細(xì)胞iNOSmRNA的表達(dá)水平

Table 1. The level of iNOS mRNA in alveolar macrophages(mean±SEM.n=8)

Group6h12h20hSham0．74±0．140．68±0．180．63±0．19CLP1．33±0．05#1．44±0．08#1．57±0．11#GLP+ghrelin//2．27±0．37#?

#P<0.05vssham；*P<0.05vsCLP.

4Ghrelin對(duì)CLP大鼠肺組織iNOS蛋白表達(dá)水平的影響

術(shù)后20 h，膿毒癥組(I組)與ghrelin治療組(J組)肺組織iNOS蛋白的表達(dá)水平較假手術(shù)組(H組)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；ghrelin治療組較膿毒癥組稍有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖3、表2。

Figure 3. The expression of pulmonary iNOS protein in each group detected by Western blotting assay.

圖3各組大鼠肺組織iNOS蛋白的表達(dá)水平

5病理學(xué)HE染色

在大體肺組織中，可見膿毒癥組大鼠的肺組織腫脹，個(gè)別大鼠胸腔內(nèi)有少量血性積液；假手術(shù)組肺組織表面光潔，呈粉紅色，未見出血點(diǎn)，無胸腔積液。Ghrelin治療組的肺組織腫脹，少許胸腔積液。在光學(xué)顯微鏡下可見，假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)完整，氣道上皮細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)無水腫，個(gè)別標(biāo)本可見小灶性炎癥細(xì)胞滲出，無出血，肺泡腔無水腫液、無透明膜(圖4A)。而膿毒癥組(圖4B)部分肺泡結(jié)構(gòu)受到破壞，部分上皮細(xì)胞變形脫落，肺泡間質(zhì)和肺泡腔有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫明顯，部分有出血，有一例大鼠可見血管內(nèi)微血栓形成，部分肺泡腔可見少許水腫液，具有ALI的病理改變。與假手術(shù)組比較，膿毒癥組、ghrelin治療組肺病理評(píng)分增加，有顯著差異，均P<0.01。而ghrelin治療組(圖4C)與膿毒癥組比較，肺組織病理?yè)p傷程度有所減輕(P<0.05)。各組病理學(xué)改變?cè)u(píng)分見表2。

6CLP術(shù)后20h大鼠的死亡率

CLP術(shù)后20 h，假手術(shù)組(H)大鼠無死亡(0/25)，膿毒癥組(J)和ghrelin治療組(J)的死亡率分別為68%(17/25)和45%(14/25)，2組間比較無顯著差異(P>0.05)。

Figure 4. Histopathological changes of the right lower lobe of lung (HE staining,×200) A: sham; B: CLP; C:CLP+ghrelin.

圖4右下肺組織HE染色

表2肺iNOS蛋白表達(dá)及肺組織病理學(xué)評(píng)分

Table 2. The expression of pulmonary iNOS protein and pulmonary histopathological score (mean±SEM.n=8)

GroupiNOSHistopathologicalscoreSham0．53±0．033．00±0．36CLP1．08±0．05#7．83±0．75#CLP+ghrelin0．87±0．03#?5．83±0．477#?

#P<0.05vssham；*P<0.05vsCLP.

討 論

膿毒癥是肺損傷最常見的病因[12]，CLP模型則一直被認(rèn)為是膿毒癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”模型[13]。經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，大鼠CLP術(shù)后5 h與20 h分別出現(xiàn)高動(dòng)力循環(huán)與低動(dòng)力循環(huán)表現(xiàn)，這2個(gè)時(shí)點(diǎn)分別被認(rèn)為是膿毒癥的早期和晚期階段[14]。因此,實(shí)驗(yàn)中我們主要觀察CLP術(shù)后6～20 h的大鼠肺內(nèi)iNOS表達(dá)水平的變化。

肺內(nèi)多種細(xì)胞，如肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞可表達(dá)iNOS[15]，后者在炎癥病理狀態(tài)下表達(dá)增加，并參與一系列病理生理的發(fā)生、發(fā)展。雖然肺泡巨噬細(xì)胞占肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)95%，但在重癥感染下，卻以中性粒細(xì)胞為主，占90%以上[16]。本實(shí)驗(yàn)中可獲得的肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目較少，因此本研究通過RT-PCR方法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示CLP術(shù)后6 h大鼠肺泡巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平已升高，提示炎癥感染刺激肺泡巨噬細(xì)胞活化，iNOS表達(dá)增加。然而隨著時(shí)間推移，膿毒癥組肺泡巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平在術(shù)后6～20 h內(nèi)并沒有明顯變化。我們認(rèn)為可能與細(xì)胞凋亡數(shù)目增加以致肺泡巨噬細(xì)胞 iNOS mRNA表達(dá)的總體水平不再上升有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，CLP術(shù)后9 h和20 h大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡數(shù)目比假手術(shù)組分別增加2.5倍和3.2倍[17]。我們?cè)诖笫驝LP術(shù)后3 h給予外源性ghrelin，觀察到術(shù)后20 h ghrelin治療組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平較膿毒癥組增高，提示ghrelin上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞 iNOS mRNA的表達(dá)。Chen等[1]則在孵育有原代肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基中同時(shí)加入LPS和ghrelin后也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)上清液NOS活性較非ghrelin干預(yù)組增高。對(duì)于我們的研究結(jié)果與設(shè)想不一致，我們認(rèn)為ghrelin除通過調(diào)控NF-κB抑制炎癥因子產(chǎn)生外，還可能通過某些機(jī)制抑制肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡。目前有研究發(fā)現(xiàn)ghrelin可以減輕小鼠嚴(yán)重缺血肌皮組織細(xì)胞及糖尿病大鼠垂體泌乳細(xì)胞凋亡[7, 18]。Sudar等[9]對(duì)大鼠采用腦室內(nèi)注射ghrelin后發(fā)現(xiàn)，大鼠心臟iNOS mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，磷酸化Akt和ERK1/2增加，認(rèn)為ghrelin通過Akt和ERK1/2信號(hào)通路途徑調(diào)控iNOS的表達(dá)。ERK及Akt信號(hào)通路可通過對(duì)抗凋亡蛋白或促凋亡蛋白的磷酸化作用參與抑制細(xì)胞凋亡的作用[19-20]。但凋亡是否在此起到作用，仍需進(jìn)一步行相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

另一方面，我們發(fā)現(xiàn)ghrelin減弱膿毒癥急性肺損傷肺部iNOS蛋白表達(dá)，這可能是ghrelin對(duì)肺內(nèi)不同細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響不一所致。肺內(nèi)多種細(xì)胞可以表達(dá)iNOS[15]，現(xiàn)有資料顯示ghrelin對(duì)iNOS既有上調(diào)也有抑制作用，提示ghrelin對(duì)不同細(xì)胞所產(chǎn)生的作用可能不同。譬如Minici等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ghrelin有下調(diào)人血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的作用。肺組織病理結(jié)果顯示ghrelin治療組的肺損傷程度較膿毒癥組減輕，提示ghrelin有減輕肺損傷的作用，這可能與肺部iNOS的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)ghrelin治療組與膿毒癥組在CLP術(shù)后20 h內(nèi)的死亡率無明顯差異，但我們認(rèn)為這與盲腸穿孔的病因未去除有關(guān)，日后的研究需要結(jié)合感染菌的毒力和菌負(fù)荷情況進(jìn)一步分析。

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EffectofghrelinoniNOSexpressioninalveolarmacrophagesandlungtissuesinratswithsepsis-associatedlunginjury

HE Wan-mei, ZENG Mian, YI Hui, JIANG Yu-jie, CHANG Min-chan

(MedicalIntensiveCareUnit,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zengmian2004@163.com)

AIM: To investigate the effect of ghrelin on inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in alveolar macrophages and lung tissues in sepsis-induced acute lung injury (ALI) rats.METHODSThe septic rat model was established by cecal ligation and puncture (CLP). Male SD rats were divided into sham group, CLP group and CLP+ghrelin group. The rats in the former 2 groups were further divided into 3 subgroups, which were 6 h, 12 h and 20 h post-operation groups. Ghrelin was administered by intraperitoneal injection at 3 h and 15 h after operation in ghrelin group. The samples were harvested 20 h after operation. The mRNA expression of iNOS in alveolar macrophages collected from bronchoalveolar lavage was detected by RT-PCR. The protein levels of lung iNOS were measured by Western blotting. The lung pathological examination was performed 20 h after operation.RESULTSIn CLP group, the mRNA expression levels of iNOS in the alveolar macrophages were 1.33±0.05, 1.44±0.08, 1.57±0.11 at 6 h, 12 h and 20 h after CLP, respectively, which were higher than that in sham group, but did not show time correlation. However, it was lower in CLP group than that in CLP+ghrelin group at 20 h after CLP (2.27±0.37,P<0.05). At 20 h after CLP, the protein level of lung iNOS was decreased in CLP+ghrelin group (0.87± 0.03) as compared with CLP group (1.08±0.05). Compared with sham group, the histopathological score was increased in both CLP group and CLP+ghrelin group, but it was lower in CLP+ghrelin group (5.83±0.477) than that in CLP group (7.83±0.75).CONCLUSIONGhrelin treatment improves the degree of ALI. During 6 h to 20 h after CLP, the mRNA expression of iNOS in alveolar macrophages was elevated, but the difference was not seen as the time went on. Ghrelin up-regulates the mRNA expression of iNOS in alveolar macrophages and inhibits iNOS expression in lungs of septic rats.

Ghrelin; Sepsis; Lung injury; Nitric oxide synthase; Alveolar macrophages

R515.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.022

1000- 4718(2013)05- 0895- 05

2012- 12- 30

2013- 04- 28

廣東省科技計(jì)劃(No.2008B030301057)

△通訊作者 Tel： 020-87755766； E-mail: zengmian2004@163.com