程建華， 劉 雙， 韓 釗， 曹 紅， 楊金龍

(溫州醫(yī)學(xué)院 1附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 2附屬第二醫(yī)院麻醉科 , 浙江 溫州 325000)

姜黃素通過調(diào)控Notch通路促進(jìn)大鼠腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移*

程建華1△， 劉 雙1， 韓 釗1， 曹 紅2， 楊金龍1

(溫州醫(yī)學(xué)院1附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,2附屬第二醫(yī)院麻醉科 , 浙江 溫州 325000)

目的觀察姜黃素對大鼠局灶性腦缺血后室管膜下區(qū)(SVZ)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖和遷移的影響，及其與Notch信號通路的相關(guān)性。方法采用線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，隨機(jī)分成假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(I/R)及姜黃素治療組(I/R+curcumin)。動物在模型成功后1 h連續(xù)腹腔注射姜黃素7 d后處死。免疫熒光法檢測各組梗死側(cè)SVZ BrdU及BrdU/DCX標(biāo)記NSCs的數(shù)目及遷移趨勢。Western blotting方法檢測各組Notch通路的中間產(chǎn)物Notch 細(xì)胞內(nèi)域(NICD)的表達(dá)。結(jié)果I/R+curcumin組的大鼠梗死側(cè)SVZ BrdU及BrdU/DCX標(biāo)記的NSC較I/R組顯著增多(P<0.05)，同時其較I/R組更廣泛地分布在往病灶遷移的路徑上。I/R+curcumin組較I/R組的NICD生成也增多(P<0.05)。結(jié)論姜黃素能促進(jìn)缺血性大鼠腦SVZ NSCs增殖和遷移，其機(jī)制可能是通過激活Notch信號通路產(chǎn)生的。

姜黃素； 局灶性腦缺血； 神經(jīng)干細(xì)胞； 神經(jīng)再生； Notch通路

缺血性腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，存在高致殘率。較多研究已經(jīng)證實腦缺血能促進(jìn)成年動物腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的增殖、遷移和分化，分化的新生神經(jīng)元能部分地替代受損的神經(jīng)元，從而在一定程度上改善神經(jīng)功能缺損[1]。Notch信號通路是一條經(jīng)典的保守途徑，在生物發(fā)育中起重要的調(diào)控作用，屬于干細(xì)胞分化的抑制性通路，可抑制NSCs向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化，由此間接維持干細(xì)胞的多能性和自新能力，Notch 細(xì)胞內(nèi)域(Notch intracellular domain，NICD)是該通路的一個重要中間產(chǎn)物，有研究證實，缺血性腦卒中的大鼠NSCs的增殖、遷移和分化與Notch信號通路相關(guān)[2-3]。姜黃素(curcumin)是姜科姜黃屬植物根莖的主要成分，有少量研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能促進(jìn)NSCs的再生[4-6]。據(jù)本研究者所知，姜黃素是否促進(jìn)缺血性腦梗死NSCs再生及該影響是否與Notch通路相關(guān)，均還未見報道。本研究初步探討姜黃素對成年大鼠局灶性腦缺血后室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)內(nèi)源性NSCs增殖、遷移的影響，及通過測定NICD的變化，初步研究其與Notch信號通路的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1試劑和儀器

激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000,JAP)；圖像分析軟件(ImageJ)；姜黃素(Sigma)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU)(Sigma)、玉米油(Sigma)；綿羊抗大鼠BrdUⅠ抗(Abcam)；雙皮質(zhì)素(doublecortin,DCX;Santa Cruz)；TRITC熒光Ⅱ抗(Jackson ImmunoResearch)；NICD (Santa Cruz)；線栓(北京沙龍生物技術(shù)有限公司)。

2動物及分組

30只健康雄性SD大鼠，體重250～280 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(滬)2007-0005。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)、腦缺血再灌注(cerebral ischemia/reperfusion，I/R)組(n=10)和姜黃素治療(I/R+curcumin)組(n=10)，大鼠于手術(shù)前自由飲水、飲食5 d，保持飼養(yǎng)環(huán)境安靜，以日光采光，明暗周期各12 h，保持室溫在18～22 ℃之間。大鼠在模型成功后1 h立即給予腹腔注射用藥：姜黃素治療組給予姜黃素(溶劑為玉米油)注射，其注射劑量為300 mg/kg，其余各組給予等劑量的注射用玉米油，連續(xù)給藥7d。各組大鼠在處死前3 d每天腹腔注射50 mg/kg BrdU，每天2次。

3大鼠MCAO模型制作

參照Zea Longa線栓法再加以改進(jìn)，以左側(cè)大腦栓塞為例。大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。實驗前腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈和迷走神經(jīng)。頸總動脈打一活結(jié)，在頸外動脈離心端1cm處結(jié)扎頸外動脈，同時夾閉頸內(nèi)動脈，然后在頸外動脈上切一小切口，將線栓插入后剪短頸外動脈，之后將線栓沿著頸內(nèi)動脈入顱的方向插入，當(dāng)插入約距頸總動脈分叉處18～20 mm左右時感到一輕微阻力時便立即停止插入，即表明已經(jīng)阻塞住大腦中動脈。阻斷120 min后，將線栓拔出，解除頸總動脈活結(jié)，貫通頸總動脈與頸內(nèi)動脈通路。完成腦缺血再灌注損傷的模型。假手術(shù)組除將線栓插入深度不阻塞大腦中動脈外，其余均與上述手術(shù)步驟相同。

4免疫熒光法檢測SVZ的BrdU及BrdU/DCX的標(biāo)記

每組5只大鼠用于免疫熒光檢測。 做厚度為4 μm的切片，利用免疫熒光檢測方法檢測大腦梗死側(cè)SVZ的BrdU/DCX的表達(dá)。首先，石蠟切片脫蠟水化：在二甲苯中脫蠟30 min后放入梯度酒精中水化。其次，檸檬酸高壓抗原修復(fù)3 min，自然降至室溫。PBS沖洗后將切片置于2 mol/L HCl中冰上孵育10 min，室溫下孵育10 min，37 ℃下孵育20 min后直接置于0.1 mol/L 硼酸中中和10 min。最后，PBS沖洗后滴加BrdUⅠ抗(1∶50)及DCX(1∶50)，室溫孵育1 h后4 ℃孵育過夜，12 h后滴加熒光Ⅱ抗，室溫下放置30 min后利用激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。陰性對照采用PBS代替Ⅰ抗的孵育，其它步驟與上述步驟相同。

5蛋白印跡法(Westernblotting)檢測NICD

每組5只大鼠用于蛋白印跡檢測。首先在蛋白裂解前，先將PMSF預(yù)先加入蛋白裂解液RIPA中，冰上裂解1 h，12 000×g離心15 min，取上清液。之后，利用酶標(biāo)儀采用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行測定，根據(jù)畫出的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各個蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白分子量大小配置10%分離膠與5%濃縮膠，根據(jù)各個樣品的濃度定量吸取50 μg蛋白量，同上樣緩沖液按照4∶1的比例混合，將各個樣品定容到20 μL，不足體積的樣品利用ddH2O補(bǔ)齊。在上樣前首先將蛋白樣品100 ℃變性5 min，再利用微量上樣注射器進(jìn)行上樣。樣品在濃縮膠及分離膠中設(shè)定的電泳電壓分別為80V和100V，當(dāng)溴酚藍(lán)跑到分離膠底部時電泳完畢。之后利用濕轉(zhuǎn)恒流0.3A的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1.5 h,蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后將膜取出，在5%脫脂牛奶中封閉2 h，封閉過后利用TBST輕輕沖洗即進(jìn)行NICD(1∶200)Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，16 h后將膜取出TBST搖床上沖洗3×5 min沖洗過后換成Ⅱ抗在搖床上搖晃1 h，TBST沖洗過后利用ECL顯色液暗室底片曝光成像，最后利用UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像后ImageJ軟件進(jìn)行NICD蛋白及β-actin蛋白灰度值的測定后按照其比值的大小進(jìn)行最終相對表達(dá)量的比較。

6結(jié)果觀察與統(tǒng)計學(xué)處理

各組5只大鼠，每只大鼠隨機(jī)抽取6～10張不同的切片，在×400光學(xué)顯微鏡下，每張隨機(jī)選取5個視野計數(shù)細(xì)胞。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。單因素方差分析采用One-way ANOVA，方差齊性組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊組間比較采用Dunnett’s T3 法檢驗。檢驗標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

圖1顯示，激光共聚焦顯微鏡下可見各組缺血側(cè)SVZ的NSCs呈現(xiàn)不同程度的BrdU及BrdU/DCX抗體染色；BrdU和DCX熒光染色在鏡下分別為紅色和綠色，細(xì)胞呈神經(jīng)元形態(tài)，BrdU分布于胞漿及胞核，DCX主要分布于胞漿。假手術(shù)組僅有少量的BrdU陽性細(xì)胞出現(xiàn)，而缺血再灌注組和姜黃素治療組有大量的BrdU陽性細(xì)胞出現(xiàn)(P<0.01)。同缺血再灌注組相比，姜黃素治療組的BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)量也更多(P<0.05)。從圖1A中還可以看出，姜黃素治療組的BrdU/DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞較缺血再灌注組更廣泛地分布在往病灶遷移的路徑上。上述結(jié)果表明姜黃素提高了缺血性卒中后SVZ中NSCs的增殖及遷移能力。

Figure 1. The 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) and doublecortin (DCX) immunofluorescent staining of ischemic lateral subventricular zone (SVZ) observed under confocal laser scanning microscope (×400) and quantitative analysis of BrdU-positive and BrdU/DCX double-positive cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vssham;△P<0.05vsI/R.

圖1缺血側(cè)SVZ的BrdU和DCX免疫熒光染色及BrdU陽性細(xì)胞和BrdU/DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞的定量分析

圖2顯示,各組大鼠缺血側(cè)SVZ組織提取的蛋白均與NICD多抗特異性結(jié)合，在相對分子量約110 kD處出現(xiàn)陽性條帶。與假手術(shù)組相比，姜黃素治療組及缺血再灌注組的NICD明顯增多(P<0.01)，表明腦缺血能激活Notch通路。與缺血再灌注組相比，姜黃素治療組的NICD表達(dá)更多(P<0.05)，提示姜黃素治療組較缺血再灌注組更多地激活Notch通路。

Figure 2. Western blotting analysis of NICD expression.Mean±SD.n=5.**P<0.01vssham;△P<0.05vsI/R.

圖2Westernblotting分析NICD的表達(dá)

討 論

缺血性卒中能激活腦內(nèi)SVZ的內(nèi)源性NSCs的增殖、遷移和分化，分化的新生神經(jīng)元能部分地替代和修復(fù)受損的神經(jīng)元，從而在一定程度上改善神經(jīng)功能缺損[1]。本研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，對照組SVZ BrdU陽性細(xì)胞及BrdU/DCX的陽性細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。

有大量研究發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中也能激活NSC的Notch通路[2-3]。Notch信號通路在誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞選擇繼續(xù)增殖或向神經(jīng)元分化上起著關(guān)鍵作用[7]。Notch受體是一個300 kD的單跨膜蛋白，當(dāng)配體受體結(jié)合后，Notch蛋白相繼發(fā)生2次蛋白水解，首先是被腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor alpha converting enzyme,TACE)酶解，然后被γ-分泌酶裂解，其胞內(nèi)段被酶切，形成水溶性的NICD，并轉(zhuǎn)移到胞核。NICD與胞核上的DNA結(jié)合蛋白CSL結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄因子，刺激靶因子Hes1、Hes3和Hes5等的轉(zhuǎn)錄，Hes1、Hes3和Hes5編碼的核bHLH蛋白繼而抑制其下游的某些靶點基因(其中促進(jìn)神經(jīng)元分化的基因有Mash-1、neurogenin、Shh等)，從而抑制神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，而保持神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖狀態(tài)[7-8]。由此可見，NICD是反映Notch活性的一個重要指標(biāo)，故本研究通過測定NICD來評估Notch通路的激活程度。

有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血4 h和24 h后SVZ的NICD、Hes1及Shh水平升高。給予Notch通路激動劑可以增加SVZ區(qū)的細(xì)胞增殖，而給予Notch通路的抑制劑(受體蛋白阻滯劑和γ-分泌酶抑制劑)則會減少由于缺血誘導(dǎo)的SVZ細(xì)胞增殖的數(shù)量[3]。國內(nèi)也有報道大鼠局灶性腦缺血2 h再灌注1周、2周和3周后，額頂葉皮質(zhì)Notch-1及Jagged1這2個Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比明顯增高[9]。本研究的假手術(shù)組與缺血再灌注組相比較中， Western blotting結(jié)果表明缺血再灌注組NICD水平增加明顯(P<0.05)，表明缺血再灌注組在此階段激活了Notch通路，與相關(guān)研究結(jié)果相一致。

本實驗重點研究了姜黃素對缺血性腦損傷后NSCs增殖及遷移的影響及其與Notch信號通路的相關(guān)性。有研究表明姜黃素可以促進(jìn)神經(jīng)元再生[4-6]和改善神經(jīng)元的損傷[10]。通過細(xì)胞培養(yǎng)，姜黃素促進(jìn)C17.2細(xì)胞(具有多能的神經(jīng)前體細(xì)胞)及胚胎皮層神經(jīng)干細(xì)胞增殖，也能促進(jìn)正常成年大鼠海馬的NSCs增殖。該實驗還對成年海馬齒狀回處標(biāo)記BrdU的新生神經(jīng)元進(jìn)行NeuN(成熟神經(jīng)元標(biāo)志物)染色,發(fā)現(xiàn)在齒狀回處有大量BrdU和NeuN雙染色的細(xì)胞，該實驗表明姜黃素可以促進(jìn)增殖的神經(jīng)干細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元[5]。從本研究的免疫熒光結(jié)果看出，在7 d與對照組相比，姜黃素在大鼠局灶性腦缺血后更能促進(jìn)SVZ神經(jīng)元的增殖和遷移。BrdU免疫熒光染色結(jié)果顯示：在缺血后7d，姜黃素治療組與缺血再灌注組比較，陽性細(xì)胞數(shù)更明顯增多(P<0.05)。這說明了缺血性腦損傷后，姜黃素更能促進(jìn)缺血誘導(dǎo)的NSCs增殖。DCX是一種促進(jìn)微管聚合的蛋白，可代表遷移的神經(jīng)細(xì)胞[11]。激光共聚焦結(jié)果顯示，給予姜黃素后，BrdU/DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)均較缺血再灌注組增多，且更廣泛地分布在往病灶遷移的路徑上，提示姜黃素除促進(jìn)缺血后內(nèi)源性NSCs的增殖外，也促進(jìn)其遷移。結(jié)合Western blotting結(jié)果，姜黃素治療組NICD的表達(dá)較缺血再灌注組增加，表明姜黃素可增加NICD的表達(dá)，并伴隨BrdU/NeuN陽性細(xì)胞數(shù)的增多，從而證明姜黃素可促進(jìn)局灶性腦缺血后SVZ的NSCs增殖和遷移，其作用機(jī)制可能是通過激活Notch信號通路實現(xiàn)的。至于姜黃素對缺血性卒中的內(nèi)源性NSCs分化及與Notch通路的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，姜黃素可以促進(jìn)大鼠局灶性腦缺血后SVZ的NSCs增殖和遷移，這一效應(yīng)可能是通過激活Notch信號通路實現(xiàn)的。

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視網(wǎng)膜波在整個視覺系統(tǒng)發(fā)育過程中協(xié)調(diào)形成圖案的活動

脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)與功能的發(fā)育最初由遺傳因子支配，隨后再由神經(jīng)元的活動進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。然而，神經(jīng)系統(tǒng)的基本特點在感官體驗之前顯現(xiàn)是有可能的。因此，在經(jīng)驗發(fā)生之前的功能依賴性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育必然是由自發(fā)性活動驅(qū)動的。為了驗證這種體內(nèi)自發(fā)性活動的起源和性質(zhì)，美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Ackman等用視覺光學(xué)的研究方法檢測新生小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠在睜眼之前就存在自發(fā)性的視網(wǎng)膜活動波，并在整個視覺系統(tǒng)播散。這種形成圖案的活動(patterned activity)包括整個視野，依賴于膽堿能神經(jīng)傳遞。這種活動優(yōu)先起源于雙眼視網(wǎng)膜，展示了兩個半球之間的時空相互關(guān)聯(lián)。視網(wǎng)膜活動波是中腦和初級視皮層活動的起始來源，但僅調(diào)節(jié)次級視覺區(qū)正在進(jìn)行的活動。因此，這種視網(wǎng)膜的自發(fā)性活動可在整個視覺系統(tǒng)中傳播，它所攜帶的組成圖形的信息能夠在視覺體驗產(chǎn)生之前引導(dǎo)半球內(nèi)及半球間復(fù)雜環(huán)路的活動依賴性發(fā)育。

Nature, 2012, 490(7419):219-227(羅小鵬)

CurcuminpromotesproliferationandmigrationofneuralstemcellsincerebralischemicratsbyregulatingNotchsignaling

CHENG Jian-hua1, LIU Shuang1, HAN Zhao1, CAO Hong2, YANG Jin-long1

(1DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,2DepatrtmentofAnesthesiology,theSecondAffiliatedHospital,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:cjhua23@tom.com)

AIM: To investigate the proliferation and migration of neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone (SVZ) on focal cerebral ischemia with curcumin treatment, and to explore the relationship between these effects and Notch signaling.METHODSThe animal model was established by an intraluminal suture method to induce middle cerebral artery occlusion in rats. The rats were randomly divided into sham group, cerebral ischemia/reperfusion (I/R) group, and I/R+curcumin group. The animals were given curcumin for 7 d intraperitoneally. One hour after the model was successfully established, the rats were sacrificed. Immunofluorescence was used to label the NSCs by BrdU and BrdU/DCX, and the migration tendency was observed. The expression of Notch intracellular domain (NICD, the Notch signaling pathway intermediate product) was detected by Western blotting.RESULTSCompared with I/R group, BrdU-positive and BrdU/DCX double positive cells in I/R+curcumin group were significantly higher than those in I/R group (P<0.05), and more positive cells were on the way of migration to the ischemic lesion zone. The expression level of NICD in I/R+curcumin group was significantly higher than that in I/R group (P<0.05).CONCLUSIONCurcumin promotes NSC proliferation and migration in SVZ after focal cerebral ischemia. The possible mechanism may be that curcumin activates Notch signaling.

Curcumin; Focal cerebral ischemia; Neural stem cells; Neurogenesis; Notch pathway

R743

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.019

1000- 4718(2013)05- 0878- 05

2012- 11- 05

2013- 01- 22

浙江省中醫(yī)藥管理局科研項目(No.2010ZB093)

△通訊作者 Tel: 0577-55579365; E-mail： cjhua23@tom.com