蔣學風， 唐瓊蘭， 何欣欣， 姜靜茹， 徐建平, 王曉玉， 羅 新

(1暨南大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510632； 2中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510120)

EphA2及其配體在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達及其與血管生成的關系*

蔣學風1△， 唐瓊蘭2， 何欣欣2， 姜靜茹1， 徐建平1, 王曉玉1， 羅 新1

(1暨南大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510632；2中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510120)

目的探討生促紅素肝細胞受體A2 (EphA2)及其配體ephrin-A1在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達及其與腫瘤血管生成的關系。方法利用免疫組織化學法檢測56例子宮內(nèi)膜樣腺癌、20例子宮內(nèi)膜增生過長、30例正常子宮內(nèi)膜增殖期和30例分泌期組織中EphA2、ephrin-A1、雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的表達，并采用CD34抗體標記微血管內(nèi)皮細胞，計算微血管密度(MVD)。分析EphA2和ephrin-A1的表達與MVD之間的相關性及其與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的關系。結(jié)果子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中EphA2和ephrin-A1的表達顯著高于子宮內(nèi)膜樣增生過長及正常子宮內(nèi)膜(P<0.05)；EphA2和ephrin-A1表達水平及MVD值與子宮內(nèi)膜樣腺癌FIGO分期、腫瘤分化程度、肌層浸潤深度、淋巴微血管浸潤和孕激素受體表達有關(P<0.05)；Spearman等級相關分析表明EphA2和ephrin-A1表達分別與MVD呈顯著正相關(r=0.476,P<0.05；r=0.501,P<0.05)。結(jié)論EphA2及其配體ephrin-A1在子宮內(nèi)膜樣腺癌中高表達,可能參與了腫瘤血管生成和孕激素抵抗。

子宮內(nèi)膜樣腺癌； 受體,EphA2； Ephrin-A1； 血管生成

受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)是外界刺激信息傳遞至細胞核，轉(zhuǎn)化成細胞效應的信號轉(zhuǎn)導通路中的關鍵分子組成。生促紅素肝細胞受體A2 (erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2)是該家族中被發(fā)現(xiàn)具有酪氨酸激酶活性的第1個蛋白。研究表明,EphA2可在多種人體腫瘤組織中過表達, EphA2能促進血管內(nèi)皮細胞的遷移,與其配體Ephrin-A1結(jié)合可促進組織和內(nèi)皮細胞形成毛細血管樣結(jié)構，在腫瘤新生血管形成及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[1-2]。EphA2同樣可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[3-4]，但有關EphA2及其配體ephrin-A1的表達以及二者與血管生成的關系研究尚少見報道。本實驗采用免疫組織化學技術檢測子宮內(nèi)膜樣腺癌組織、子宮內(nèi)膜增生過長及正常內(nèi)膜組織中EphA2和ephrin-A1的表達，用CD34標記血管內(nèi)皮細胞，測定微血管密度(microvessel density, MVD)，通過分析EphA2、ephrin-A1表達與MVD之間的相關性及其與臨床病理特征的關系，探討EphA2及其配體ephrin-A1對子宮內(nèi)膜癌中血管生成的作用及臨床意義。

材 料 和 方 法

1病例資料

收集2000年1月至2005年1月在我院婦產(chǎn)科因子宮內(nèi)膜樣腺癌行剖腹手術或腹腔鏡手術的患者共56例。年齡30～70歲，中位年齡58歲，平均(54.12±10.38)歲，絕經(jīng)婦女36例，占64.93%。術前均未經(jīng)過放療、化療或其它抗腫瘤治療。采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009手術-病理分期標準[5]。子宮內(nèi)膜增生過長選自同期手術病理證實的石蠟包埋組織，共20例。對照組以同期因子宮肌瘤行子宮全切手術標本，正常增殖期30例，分泌期30例。

2試劑

鏈親和素-生物素-過氧化物酶(streptavidin-biotin immunoperoxidase，SP)試劑盒及雌激素受體(estrogen receptor,ER;ZM-0104)、孕激素受體(progesterone receptor, PR;ZM-0215)、CD34(ZM-0046)鼠抗人單克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司，EphA2(C-20)和ephrin-A1(V-18)兔抗人多克隆抗體購于Santa Cruz。

3方法

3.1免疫組織化學法 采用SP染色法,具體操作步驟按SP試劑盒說明書進行。EphA2 Ⅰ抗和ephrin-A1 Ⅰ抗工作濃度為1∶300，CD34 Ⅰ抗工作濃度均為1∶100，ER工作濃度為1∶50，PR工作濃度為1∶100，以乳腺浸潤性導管癌為陽性對照，PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。

3.2實驗結(jié)果的判斷

3.2.1EphA2和ephrin-A1結(jié)果判斷 EphA2和ephrin-A1為細胞質(zhì)呈棕黃色為陽性，根據(jù)顯色強度分為0～3級[4]。0級:陰性(-)，細胞無棕黃色染色；1級:弱陽性(+),細胞染色較淡； 2級:陽性(++)，細胞中度染色；3級:強陽性(+++)，細胞染色較深。

3.2.2CD34結(jié)果判斷 每一個染成棕黃色的、可與周圍血管、腫瘤細胞和其它結(jié)締組織區(qū)分開來的內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇，不論管腔和紅細胞出現(xiàn)與否，均作為1個單一的、可計數(shù)的微血管；管腔面積>8個紅細胞直徑，或帶有較厚肌層的微血管不計數(shù)。

3.2.3MVD計數(shù)方法 先于低倍光鏡(×40和×100)下確定3個血管著色最密集區(qū)域，然后在高倍視野(×400)內(nèi)計數(shù)微血管的數(shù)目，取3個視野的均值作為MVD。雙盲法判定結(jié)果，每張切片由2位病理醫(yī)師分別判定、計數(shù)。2人計數(shù)相差10%以上重新計數(shù)[6]。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用2檢驗、方差分析及Spearman等級相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1EphA2和ephrin-A1在子宮內(nèi)膜樣腺癌及內(nèi)膜增生組織中的表達

EphA2和ephrin-A1蛋白陽性表達于細胞漿,呈棕黃色顆粒。在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中EphA2和ephrin-A1蛋白的表達以及陽性率明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生、增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜組織 (P<0.05或P<0.01)，而不典型增生、正常增殖期子宮內(nèi)膜和分泌期子宮內(nèi)膜組織之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖1、表1。

Figure 1. The expression of EphA2,ephrin-A1 and CD34 in endometrial endometrioid adenocarcinoma(EEA;immunohistochemical staining,×100).A: EphA2 expression in EEA grade 1; B: EphA2 expression in EEA grade 3; C:ephrin-A1 expression in EEA grade 1; D: ephrin-A1 expression in EEA grade 3; E: CD34 expression in EEA grade 1; F: CD34 expression in EEA grade 3.

圖1EphA2、ephrin-A1和CD34在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達

表1 EphA2和ephrin-A1蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達

*P<0.05,**P<0.01vsendometrial endometrioid adenocarcinoma group.

2EphA2、ephrin-A1表達和MVD與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征的關系

CD34主要表達于血管內(nèi)皮細胞膜。微血管染色呈棕黃色，主要位于腺癌間質(zhì)區(qū)域,見圖1。子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中MVD(33.19±5.87)顯著高于子宮內(nèi)膜增生過長組織(28.37±6.35；P<0.05)、增殖期(22.86±4.90；P<0.01)及分泌期子宮內(nèi)膜組織(21.72±4.78;P<0.01)。

EphA2、ephrin-A1表達和MVD與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和ER陽性無關，而與FIGO分期、腫瘤分化、肌層浸潤、淋巴微血管浸潤和PR有關(P<0.05)，見表2。

在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中,隨著分化程度的降低, EphA2和ephrin-A1蛋白的表達顯著升高(P<0.05)；隨肌層浸潤深度的增加, 或腫瘤期別越晚，EphA2和ephrin-A1蛋白的表達顯著升高(P<0.05)；淋巴微血管浸潤或孕激素受體陰性，EphA2和ephrin-A1蛋白的表達均顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2EphA2、ephrin-A1表達和MVD與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關系

Table 2. The relation between the expression of EphA2 and ephrin-A1,MVD and clinicopathological characteristics of endometrial endometrioid adenocarcinoma

GroupnEphA2Ephrin?A1MVD(mm-2．Mean±SD)P-++++++P-++++++PAge(years) ≤49201559>0．0543211>0．0529．98±8．67>0．05 ≥50364382137101635．05±9．45FIGOstage(2009) I/II39471216<0．05691014<0．0532．47±8．89<0．01 III/IV17111141121340．38±5．49Histopathologicalgrade G1/241571217<0．05691016<0．0531．98±6．24<0．01 G315011130121241．07±5．13Myometrialinvasion ≤1/238471215<0．05691013>0．0530．63±8．01<0．01 >1/218111151121439．82±7．92Lymphovascularinvasion Negative41571217<0．05691115<0．0529．49±8．26<0．01 Positive15011131111239．95±9．11Lymphnodemetastasis Negative42471219>0．05691017>0．0532．93±8．93<0．05 Positive14111111121038．08±9．54Estrogenreceptor Negative2723616>0．0544514>0．0533．17±7．06>0．05 Positive29357143671337．16±8．97Progesteronereceptor Negative2501618<0．0511617<0．0532．64±6．49<0．01 Positive31577126961039．96±8．72

3EphA2和ephrin-A1表達與MVD的相關性

在56例子宮內(nèi)膜腺癌組織中, EphA2表達陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)及強陽性(+++)組織的MVD分別為(20.19±6.12)、(27.98±5.09)、(33.08±5.92)和(39.72±7.01)，ephrin-A1各表達級子宮內(nèi)膜樣腺癌組織的MVD分別為(19.94±6.42)、(26.79±6.09)、(32.74±6.82)和(40.17±6.47)。經(jīng)方差分析,EphA2和ephrin-A1表達各級別組間MVD均有顯著差異(P<0.01)；經(jīng)Spearman等級相關分析, EphA2表達與MVD呈顯著正相關(r=0.476,P<0.05)，ephrin-A1表達與MVD呈顯著正相關(r=0.501,P<0.05)，見表3。

表3 EphA2和ephrin-A1表達與MVD的相關性

討 論

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是西方國家最常見的婦科惡性腫瘤，在我國發(fā)病率僅次于宮頸癌，近幾年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈增高趨勢。子宮內(nèi)膜樣腺癌是其最常見的病理類型，它的發(fā)生與無孕激素拮抗的雌激素長期刺激密切相關，但其發(fā)生機制仍不十分明確[7-8]。腫瘤血管生成(angiogenesis)與肌層浸潤仍是子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生發(fā)展的重要特征。因此，針對血管生成的相關基因和蛋白的研究，可以為子宮內(nèi)膜癌侵襲轉(zhuǎn)移的早期診斷和靶向治療提供依據(jù)。

EphA2是由Lindberg 等[9]于1990 年從人角化上皮細胞cDNA文庫中篩選得到的Eph受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)之一，是該家族成員第1個被發(fā)現(xiàn)有酪氨酸激酶活性的基因。EphA2基因定位于人染色體1p36.1，編碼1個含有976個氨基酸殘基的多肽，為膜結(jié)合型糖蛋白，包括1個氨基末端胞外配體結(jié)合域、1個跨膜結(jié)構域和1個胞內(nèi)酶結(jié)構域，其中胞內(nèi)區(qū)包含具有酪氨酸激酶活性的結(jié)構域(TK)。EphA2受體與其細胞膜上的8種配體(ephrins)任何一種特異性結(jié)合,尤其是ephrin-A1，而后產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導能直接參與各種生理活動,包括細胞連接、遷移、增殖和分化、血管新生等，而EphA2異常時同樣可通過信號轉(zhuǎn)導促使腫瘤的發(fā)生、腫瘤血管的生成以及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，近年來已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥機制研究領域的熱點之一[10]。

本組資料顯示，在正常子宮內(nèi)膜分泌期、增殖期、內(nèi)膜增生過長和子宮內(nèi)膜樣腺癌中，EphA2和ephrin-A1表達逐漸升高，而且與MVD相關，提示EphA2及其配體不僅可通過促進血管生成參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展，而且與正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的生理性變化有關。EphA2和ephrin-A1在增殖期表達高于分泌期，提示EphA2可能促進細胞增殖和血管新生在子宮內(nèi)膜增生修復過程中扮演重要角色，從而保證子宮內(nèi)膜層在卵泡期(約2周)內(nèi)能迅速增厚超過10 mm，為排卵后的妊娠做好準備。

血管生成是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發(fā)展而成新生血管的過程。腫瘤組織的增殖依賴血液供應,血管生成在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究表明，EphA2及其配體ephrin-A1在許多惡性腫瘤的血管內(nèi)皮細胞中共表達[11],二者的結(jié)合可促進腫瘤血管內(nèi)皮細胞的遷移,并通過影響細胞骨架、基質(zhì)黏附和(或)細胞黏附而促進組織和內(nèi)皮細胞形成毛細血管樣結(jié)構,而抑制EphA2的活化可以削弱腫瘤的血管形成[3]。腫瘤血管的新生受多種因子的調(diào)節(jié),是促血管因子和血管生成抑制因子間失衡的結(jié)果, EphA2促血管生成機制可能是通過與其配體結(jié)合,激活下游的一系列信號轉(zhuǎn)導,從而刺激血管內(nèi)皮生長因子等促血管因子的表達而實現(xiàn)的。本實驗結(jié)果顯示,子宮內(nèi)膜癌組織中微血管密度顯著高于子宮內(nèi)膜不典型增生及正常子宮內(nèi)膜,并隨子宮內(nèi)膜癌分化程度的降低、肌層浸潤深度的增加、淋巴微血管浸潤、腫瘤期別晚等升高,且與EphA2及其配體ephrin-A1的表達呈正相關,表明EphA2可能發(fā)揮了血管促進劑的作用,在子宮內(nèi)膜腺癌血管生成過程中扮演了重要角色。因此，抑制EphA2的活化可削弱腫瘤的血管形成,從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。深入開發(fā)和應用選擇性EphA2抑制劑有望為子宮內(nèi)膜癌的預防和治療開辟新的途徑[12]。

本組資料也顯示子宮內(nèi)膜樣腺癌中EphA2及其配體ephrin-A1的表達與FIGO分期、腫瘤分化、肌層浸潤、淋巴微血管浸潤和孕激素受體陰性有關。低分化子宮內(nèi)樣膜腺癌高表達的EphA2與配體ephrin-A1結(jié)合后，通過促進血管生成，從而有利于腫瘤細胞肌層浸潤、轉(zhuǎn)移，促進病情進展，腫瘤的惡性程度提高。近來Voss等[13]認為低分化子宮內(nèi)膜樣腺癌在免疫表型和生物學行為方面具有II型子宮內(nèi)膜樣癌的特征，臨床處理上，更應按II型子宮內(nèi)膜癌進行處理[14]， EphA2與ephrin-A1是否是II型子宮內(nèi)膜癌的免疫表型特征尚需進一步研究。

孕激素受體陰性的子宮內(nèi)膜樣腺癌中EphA2和ephrin-A1均高表達，且EphA2和ephrin-A1的表達與孕激素受體陰性呈正相關。EphA2和ephrin-A1可能與孕激素受體丟失有關[4]，從而參與孕激素抵抗，這可能是子宮內(nèi)膜癌孕激素治療不敏感的原因之一。高表達EphA2、ephrin-A1的子宮內(nèi)膜樣腺癌可能不宜選擇孕激素治療。因此EphA2和ephrin-A1的表達有望作為早期子宮內(nèi)膜癌保留生育能力治療的篩選和療效觀察指標，針對EphA2和ephrin-A1的靶向治療有望恢復子宮內(nèi)膜癌孕激素治療的敏感性，值得從細胞培養(yǎng)和動物模型實驗上進一步證實。

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ExpressionofEphA2andephrin-A1inendometrialendometrioidadenocarcinomaandtheirrelationshipwithangiogenesis

JIANG Xue-feng1, TANG Qiong-lan2, HE Xin-xin2, JIANG Jing-ru1, XU Jian-ping1, WANG Xiao-yu1, LUO Xin1

(1DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofPathology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:xuefengjiang@126.com)

AIM: To investigate the expression of erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2 (EphA2) and its ligand ephrin-A1 in endometrial endometrioid adenocarcinoma (EEA), and to analyze their relationship with angiogenesis of the tumor.METHODSThe CD34-stained microvessel density (MVD) and the expression of ephA2 and ephrin-A1 were detected by immunohistochemical assay in 56 cases of EEA, 20 cases of endometrial hyperplasia, 30 cases of normal proliferative endometrium and 30 cases of normal secretory endometrium. The correlations among the expression of EphA2 and ephrin-A1, MVD and clinicopathological features were analyzed.RESULTSMVD and the expression of EphA2 and ephrin-A1 in EEA were significantly higher than those in the tissues from endometrial hyperplasia and normal endometrium (P<0.05). They were related to FIGO stage, histological differentiation, depth of myometrial invasion, lymphovascular invasion and progesterone receptor expression (P<0.05). A significant positive correlation between MVD and the expression of EphA2 and ephrin-A1 was observed by Spearman rank correlation test (r=0.476,P<0.05;r=0.501,P<0.05).CONCLUSIONOverexpression of EphA2 and its ligand ephrin-A1 in EEA may be involved in the angiogenesis and progesterone resistance.

Endometrioid adenocarcinoma; Receptors,EphA2; Ephrin-A1; Angiogenesis

R714.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.015

1000- 4718(2013)05- 0857- 05

2012- 12- 31

2013- 03- 25

暨南大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(No.1055912068)

△通訊作者Tel: 020-38688769; E-mail： xuefengjiang@126.com