馬泳泳， 周淑娟， 葛杭萍， 蔡芳芳， 章 瑜， 俞 康

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科， 2溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000)

丙戊酸鈉對(duì)RPMI822和U266細(xì)胞增殖及IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路的影響*

馬泳泳1△， 周淑娟1， 葛杭萍2， 蔡芳芳1， 章 瑜1， 俞 康1

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科，2溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000)

目的探討丙戊酸鈉(valproic acid sodium, VPA)對(duì)人骨髓瘤RPMI8226和U266細(xì)胞增殖及IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路的作用。方法RPMI8226和U266細(xì)胞經(jīng)不同濃度VPA處理12及24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，MTT法檢測(cè)VPA對(duì)細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VPA處理后的細(xì)胞周期及凋亡率，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清IL-6的濃度，半定量RT-PCR檢測(cè)VPA作用后RPMI8226和U266細(xì)胞中STAT3、STAT5、Bcl-xL、Mcl-1、c-Myc、CCND1和VEGF mRNA表達(dá)水平。Western blotting檢測(cè)JAK2和STAT5總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(1) 10、20及40 μmol/L VPA處理RPMI8226和U266細(xì)胞12 h及24 h后，細(xì)胞存活率值顯著下降，與各對(duì)照組比較均有顯著差異(P<0.05)，各對(duì)照組之間無顯著差異。(2) VPA處理RPMI8226和U266細(xì)胞 24 h后,G1/G0期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,細(xì)胞凋亡率增加，且凋亡率與VPA的作用劑量相關(guān)。(3) VPA處理RPMI8226和U266細(xì)胞24 h后，上清IL-6濃度與VPA濃度呈負(fù)相關(guān)。(4)RPMI8226和U266細(xì)胞組在40 μmol/L VPA處理后其STAT3、STAT5、Bcl-xL、Mcl-1、c-Myc、CCND1和VEGF mRNA表達(dá)減低，與未處理組比較有顯著差異。(5)與對(duì)照組比較，VPA處理組p-JAK2、JAK2、p-STAT5和STAT5蛋白表達(dá)均顯著降低。結(jié)論(1) VPA對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有體外抑制作用； (2) VPA對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株的體外抑制可能是通過調(diào)節(jié)IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

丙戊酸鈉; 多發(fā)性骨髓瘤; 白細(xì)胞介素6; JAK/STAT信號(hào)通路

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細(xì)胞惡性克隆增生性疾病，是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。目前仍不可治愈。在MM腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和生存過程中及白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)已被證實(shí)是重要旁分泌細(xì)胞因子[1]。在IL-6誘導(dǎo)的Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT) 通路中, STAT1和STAT3持續(xù)活化是MM腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和生存的重要刺激因子[2-3]。

丙戊酸鈉(sodium valproate,VPA)是一種傳統(tǒng)的抗癲癇、躁狂抑郁癥藥物，毒副作用輕微，長(zhǎng)期使用患者耐受性好；屬短鏈脂肪酸類組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor, HDACi)。近年來，越來越多的證據(jù)表明VPA具有抗腫瘤的作用[4-7]。但是VPA是否對(duì)多發(fā)性骨髓瘤有抑制作用及對(duì)骨髓瘤發(fā)生的主要激活通路IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路的作用尚不清楚。本研究對(duì)VPA是否能抑制人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226和U266的增殖及在其對(duì)IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路的作用進(jìn)行探討。

材 料 和 方 法

1主要藥品和試劑

VPA 購(gòu)自杭州賽諾菲安萬特公司。RPMI-1640培養(yǎng)液為Gibco 產(chǎn)品, 胎牛血清(fetal calf serium,FCS)購(gòu)自杭州四季青生物公司，TRIzoL 購(gòu)自Invitrogen; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas, IL-6 ELISA 試劑盒購(gòu)自晶美生物技術(shù)公司。JAK2、p-JAK2、STAT5和p-STAT5抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。One-Step RT-PCR試劑盒均為Qiagen產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見表1。

2主要方法

2.1細(xì)胞株的培養(yǎng) 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226和U266由溫州醫(yī)學(xué)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)前從-196 ℃液氮罐中取出，快速?gòu)?fù)蘇后用用含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸后, 置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每2～3 d換液1次。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT 增殖抑制實(shí)驗(yàn) 以每孔2×108/L的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔200 μL；培養(yǎng)過夜后分別加入0、10、20及40 μmol/L VPA；分別作用0、12及24 h后每孔加入MTT(5 g/L) 20 μL，37 ℃放置4 h；離心，棄上清液，每孔加入二甲亞砜(DMSO) 150 μL，混勻吹打，使沉淀充分溶解；用酶聯(lián)免疫分析儀讀取490 nm處的吸光度(A)值，并用以下公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)平行孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。存活率(%)=藥物組A值/對(duì)照組A值×100%。

表1 引物序列

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率 選擇未處理以及用10及40 μmol/L VPA處理24 h后的RPMI8226和U266細(xì)胞,將各組細(xì)胞吹打均勻,制成單細(xì)胞懸液,轉(zhuǎn)移至5 mL離心管,1 000 r/min離心5 min。PBS洗2次,用PBS重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L。沿管壁緩慢加入-20 ℃預(yù)冷的95%乙醇,使其終濃度為70%,冰浴30 min,4 ℃放置。用PBS洗去細(xì)胞固定液乙醇,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×109/L,加入等體積的PI染液1 mL,4 ℃放置30 min。以300目尼龍膜過濾,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2.4血清IL-6檢測(cè) 將1×109/L細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，24 h后棄除培養(yǎng)液，分別加入10、20及40 μmol/L VPA，以不加藥細(xì)胞作為對(duì)照。作用12和24 h后收集細(xì)胞，分別用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)IL-6 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.5RT-PCR法檢測(cè)STAT3、STAT5、Bcl-xL、Mcl-1和c-Myc、CCND1和VEGF mRNA的表達(dá) 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照OneStep RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行RT-PCR，總反應(yīng)體積50.0 μL，其中5× OneStep RT-PCR buffer 10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5× Q-Solution 10.0 μL， RNase inhibitor 10 U， RNA 1.0 μg，引物0.6 μmol/L。退火溫度分別為56 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、58 ℃、57 ℃和58 ℃。然后，取RT-PCR產(chǎn)物10.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel-Pro Analyzer 3.0)分析各目的基因與β-actin條帶吸光度值。

2.6Western blotting檢測(cè)JAK2、STAT5總蛋白及磷酸化JAK2、STAT5蛋白水平 U266和RPMI8226細(xì)胞經(jīng)不同濃度VPA作用12和24 h后,收集各組骨髓瘤細(xì)胞4×109/L, PBS清洗后加入蛋白抽提裂解液50 μL抽提細(xì)胞總蛋白,冰浴15 min,離心收集細(xì)胞總蛋白。蛋白提取物經(jīng)定量后, 30 μg上樣至8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠,電泳,常規(guī)轉(zhuǎn)膜。后者經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后,分別與1∶500稀釋度的相應(yīng)Ⅰ抗(抗JAK2抗體、抗p-JAK2抗體、抗STAT5抗體和抗p-STAT5抗體)和適宜稀釋度的Ⅱ抗(羊抗鼠Ig-HRP)孵育,經(jīng)Odyssey顯色系統(tǒng)顯色,收集蛋白印跡圖。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率

VPA處理前U266和RPMI8226細(xì)胞存活率無顯著差異(P>0.05)；10、20及40 μmol/L VPA處理12 h及24 h后，細(xì)胞存活率顯著下降，與各對(duì)照組比較均有顯著差異(P<0.05)，各對(duì)照組之間無顯著差異，見表2。

表2 RPMI8226和U266細(xì)胞的存活率

*P<0.05vs0 μmol/L VPA.

2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VPA處理后RPMI8226和U266細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡率的影響

VPA處理24 h的RPMI8226和U266細(xì)胞,G1/G0期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,細(xì)胞凋亡率增加，且凋亡率與VPA的作用劑量呈正相關(guān),見表3。

表3VPA處理24h對(duì)RPMI8226和U266細(xì)胞細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響

Table 3. Distribution of cell cycle and apoptotic rates of RPMI8226 and U266 cells treated with VPA for 24 h(%.Mean±SD.n=12)

VPA(μmol/L)RPMI8226cellsU266cellsG0/G1SG2/MApoptoticrateG0/G1SG2/MApoptoticrate049．9±2．248．2±3．51．9±0．1045．8±3．252．8±2．11．4±0．201065．4±4．5?31．2±3．6?3．4±0．3?5．9±1．0?66．3±3．1?29．1±1．8?4．6±1．2?6．3±1．1?4072．1±6．9?25．7±2．1?2．2±0．37．8±1．6?71．9±4．5?24．4±2．3?3．7±0．4?8．6±2．5?

*P<0.05vs0 μmol/L VPA.

3上清液IL-6檢測(cè)

VPA處理24 h的RPMI8226和U266細(xì)胞上清液IL-6濃度與VPA濃度呈負(fù)相關(guān),見圖1。

4RT-PCR結(jié)果

RPMI8226和U266細(xì)胞在40 μmol/L VPA處理后其STAT3、STAT5、Bcl-xL、Mcl-1、c-Myc、CCND1和VEGF mRNA表達(dá)減低，與未處理組比較有顯著差異，見圖2、3。

5Westernblotting檢測(cè)JAK2、STAT5總蛋白及磷酸化JAK2、STAT5蛋白水平

與陰性對(duì)照組比較，VPA處理組JAK2、p-JAK2、p-STAT5和STAT5 蛋白表達(dá)均顯著降低，差異顯著(P<0.05)，見圖4、表4。

Figure 1. Supernatant interleukin-6 levels of RPMI8226 and U266 cells treated by VPA for 24 h.Mean±SD.n=12.*P<0.05vs0 μmol/L VPA.

圖1VPA處理24h的RPMI8226和U266細(xì)胞上清液IL-6濃度

Figure 2. RT-PCR results for STAT3， STAT5， Bcl-xL， Mcl-1, c-Myc， CCND1 and VEGF mRNA expression levels.1,2: 0 μmol/L VPA; 3, 4: 40 μmol/L VPA; 1, 3: RPMI8226 cells; 2, 4: U266 cells.

圖2RT-PCR檢測(cè)40μmol/LVPA處理后STAT3、STAT5、Bcl-xL、Mcl-1、c-Myc、CCND1和VEGFmRNA表達(dá)水平

討 論

多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制涉及染色體易位、細(xì)胞因子異常、骨髓微環(huán)境改變以及信號(hào)通路異常等。細(xì)胞因子的異常可影響正常B細(xì)胞激活、發(fā)育和分化,對(duì)MM的發(fā)生、發(fā)展均起到關(guān)鍵性作用,IL-6已被證實(shí)是促進(jìn)MM腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和生存的重要旁分泌細(xì)胞因子[1]。IL-6受體包含2條鏈:相對(duì)分子質(zhì)量為8.0×104的α鏈(IL-6R)和相對(duì)分子質(zhì)量為1.3×105的β鏈(gp130)。首先IL-6與IL-6R結(jié)合,形成復(fù)合物,再與gp130結(jié)合,進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Gp130轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈的活化是漿細(xì)胞瘤增生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。Gp130同源/異源二聚化后,通過JAK/Tik激酶和Lyn激酶的活化、轉(zhuǎn)錄因子STAT家族的磷酸化、Ras-MAP通路各級(jí)激酶的活化以及各種轉(zhuǎn)錄因子由自身激酶磷酸化活化等機(jī)制實(shí)現(xiàn)IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。

Figure 3. Expression of STAT3，STAT5，Bcl-xL，Mcl-1，c-Myc，CCND1 and VEGF mRNA in RPMI8226 cells (A) and U266 cells (B). Mean±SD.n=12.*P<0.05vs0 μmol/L VPA.

圖3各組STAT3、STAT5、Bcl-xL、Mcl-l、c-Myc、CCND1和VEGFmRN表達(dá)水平

Figure 4. Expression of JAK2，p-JAK2，p-STAT5 and STAT5 proteins in RPMI8226 and U266 cells treated with VPA for 24 h.1～4： 0， 10， 20 and 40 μmol/L VPA, respectively.

圖4Westernblotting檢測(cè)JAK2和STAT5蛋白表達(dá)

表4Westernblotting檢測(cè)JAK2和STAT5蛋白表達(dá)

Table 4. Expression of JAK2，p-JAK2，p-STAT5 and STAT5 proteins of RPMI8226 and U266 cells treated with VPA for 24 h (Mean±SD.n=12)

CellsVPA(μmol/L)p?JAK2/β?actinJAK2/β?actinp?STAT5/β?actinSTAT5/β?actinp?JAK2/JAK2p?STAT5/STAT5RPMI822600．71±0．030．93±0．060．55±0．070．74±0．040．76±0．060．73±0．02100．43±0．02?0．68±0．05?0．32±0．01?0．61±0．020．63±0．020．52±0．03?200．31±0．04?0．37±0．02?0．12±0．04?0．28±0．05?0．83±0．030．43±0．04?400．27±0．01?0．29±0．02?0．05±0．01?0．27±0．02?0．93±0．050．38±0．01?U26600．33±0．040．52±0．030．46±0．060．62±0．020．63±0．050．73±0．07100．24±0．050．31±0．06?0．25±0．04?0．38±0．04?0．77±0．050．65±0．02200．12±0．05?0．18±0．04?0．08±0．02?0．23±0．03?0．67±0．050．34±0．03?400．12±0．04?0．19±0．09?0．05±0．06?0．24±0．03?0．62±0．020．21±0．04?

*P<0.05vs0 μmol/L VPA

JAK/STAT通路是細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素等衍廣泛涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此通路的持續(xù)激活與人類多種腫瘤尤其是造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。在血液病患者中普遍存在JAK/STAT通路的持續(xù)激活，STAT3的持續(xù)性激活在MM腫瘤發(fā)生中的作用受到廣泛關(guān)注[9]。STAT3作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，誘導(dǎo)下游靶基因表達(dá)。細(xì)胞因子等配體與細(xì)胞表面(或者胞漿內(nèi)的)相應(yīng)受體結(jié)合后，誘發(fā)了受體的集聚和二聚化，導(dǎo)致與gp130相連的JAK磷酸化而激活，繼而使得STAT3分子C端的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，通過其SH2區(qū)形成二聚體而被活化[10]。激活的二聚體接著轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，識(shí)別并結(jié)合到靶基因DNA特異的反應(yīng)元件，誘導(dǎo)了抗凋亡蛋白Bcl-xL、Mcl-1和細(xì)胞周期控制蛋白c-Myc、cyclin D1和VEGF等表達(dá)[8,11]。

VPA是一種傳統(tǒng)的抗癲癇、躁狂抑郁癥藥物，毒副作用輕微，長(zhǎng)期使用患者耐受性好；屬短鏈脂肪酸類HDACi。近年來，越來越多的證據(jù)表明VPA作為HDACi具有抗腫瘤的作用，可能機(jī)制在于其抑制了HDACs活性,導(dǎo)致組蛋白高乙?；癄顟B(tài),使得染色質(zhì)保持更加開放的構(gòu)型，開放構(gòu)型的染色質(zhì)引起翻譯沉默路徑活化或通過募集一些阻遏蛋白抑制異常表達(dá)的基因，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制,細(xì)胞周期阻滯及凋亡[12]。VPA對(duì)包括子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)均有抑制作用，并誘導(dǎo)其分化和凋亡。VPA對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性細(xì)胞毒性，而對(duì)正常造血細(xì)胞無嚴(yán)重毒性，且與多種化療藥物有協(xié)同作用。但是VPA是否對(duì)多發(fā)性骨髓瘤有抑制作用及對(duì)骨髓瘤發(fā)生的主要激活通路IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路的作用尚不清楚。本研究對(duì)VPA是否能抑制人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226和U266的增殖及在其對(duì)IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路的作用進(jìn)行探討。

本研究發(fā)現(xiàn)VPA作用于RPMI8226和U266細(xì)胞12 h及24 h后，細(xì)胞增殖均出現(xiàn)不同程度的抑制，隨VPA藥物濃度升高，細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)抑制程度也逐漸增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VPA處理后的細(xì)胞周期及凋亡率發(fā)現(xiàn)，隨藥物濃度升高,G1期細(xì)胞比例逐漸增多，S期細(xì)胞比例逐漸減少，細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，凋亡增多，由此證實(shí)VPA對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有體外抑制作用。

本研究進(jìn)一步檢測(cè)了RPMI8226和U266細(xì)胞在VPA作用后IL-6/JAK/STAT通路中的IL-6濃度，STAT、Bcl-xL、Mcl-1、c-Myc、CCND1和VEGF表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)STAT通路各基因的mRNA表達(dá)下調(diào)，JAK2及STAT5總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平均顯著降低。本研究顯示不同濃度VPA作用于RPMI8226和U266細(xì)胞,能夠從基因水平抑制STAT3和STAT5的表達(dá),進(jìn)而影響STAT3和STAT5蛋白的轉(zhuǎn)錄,抑制STAT3和STAT5的磷酸化,阻斷其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，VPA濃度越高,抑制作用越明顯。

本研究檢測(cè)到IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路靶基因的異常表達(dá)。而文獻(xiàn)提示它們與腫瘤增殖密切相關(guān)；Bcl-xL和Mcl-1[13-14]是Bcl-2家族中重要的凋亡抑制蛋白，在正常組織中低表達(dá)，在人類惡性腫瘤組織中廣泛表達(dá)，它們的異常表達(dá)可使已有基因異常改變的細(xì)胞逃避凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，與許多惡性腫瘤的化療耐藥性存在密切關(guān)系；原癌基因c-myc屬myc基因家族中的一員，是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要基因，與細(xì)胞的生長(zhǎng)分化有關(guān)，對(duì)凋亡也起重要作用；CCND1基因編碼的細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子,在乳腺癌、骨髓瘤等腫瘤中過度表達(dá)[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)研究了VPA對(duì)骨髓瘤RPMI8226和U266細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路的作用,但VPA抑制骨髓瘤是否還有其它信號(hào)途徑的參與,以及這些信號(hào)通路與JAK/STAT信號(hào)通路的相互關(guān)系尚不清楚,VPA的多靶點(diǎn)抑制骨髓瘤作用尚待進(jìn)一步研究。

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EffectsofsodiumvalproateonRPMI8226andU266cellproliferationandIL-6/JAK/STATsignalingpathway

MA Yong-yong1, ZHOU Shu-juan1, GE Hang-ping2, CAI Fang-fang1, ZHANG Yu1, YU Kang1

(1DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,2WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:myy8635@126.com)

AIM: To investigate the effects of sodium valproate (VPA) on the proliferation of multiple myeloma cell lines RPMI8226 and U266 and the regulation of IL-6/JAK/STAT signaling pathway.METHODSThe cells were treated with different concentrations of VPA for 12 h and 24 h. The growth of RPMI8226 cells and U266 cells was detected by MTT assay. Apoptotic rates and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The mRNA expression of STAT3, STAT5 and STAT target genes Bcl-xL, Mcl-1, c-Myc, CCND1 and VEGF was measured by RT-PCR. Western blotting analysis was used to determine the total proteins and protein phosphorylation levels of JAK2 and STAT5.RESULTSVPA inhibited the growth and induced the apoptosis of RPMI8226 cells and U266 cells in a concentration- and time-dependent manner. The levels of IL-6 in the culture supernatants of RPMI8226 cells and U266 cells treated with VPA were significantly higher than that in negative control group. VPA down-regulated the mRNA expression of STAT3, STAT5, Bcl-xL, Mcl-1, c-Myc, CCND1 and VEGF. After treated with VPA, the protein levels of p-JAK2, JAK2, p-STAT5 and STAT5 in RPMI8226 cells and U266 cells were significantly lower than those in control group.CONCLUSIONVPA inhibits the proliferation of PRMI8226 cells and U266 cellsinvitro. The modulation of IL-6/JAK/STAT signaling pathway may be involved in its potential mechanisms.

Valprote acid sodium; Multiple myeloma; Interleukin-6; JAK/STAT signaling pathway

R557+.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.011

1000- 4718(2013)05- 0833- 06

2012- 11- 19

2013- 03- 27

溫州市科技計(jì)劃(No. Y20100106)

△通訊作者 Tel: 0577-88069517; E-mail: myy8635@126.com