吳新環(huán)， 黃花榮， 鐘英強(qiáng)△， 葉小研， 王 琳

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1消化內(nèi)科， 2兒科， 3病理科, 廣東 廣州 510120)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、腫瘤壞死因子受體Ⅱ-抗體融合蛋白和美沙拉嗪對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)與組織損傷指數(shù)的影響*

吳新環(huán)1， 黃花榮2， 鐘英強(qiáng)1△， 葉小研1， 王 琳3

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1消化內(nèi)科，2兒科，3病理科, 廣東 廣州 510120)

目的研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、腫瘤壞死因子受體Ⅱ-抗體融合蛋白(TNFRⅡ-IgG)和美沙拉嗪對(duì)2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)與組織損傷指數(shù)(TDL)的影響。方法MSCs應(yīng)用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)。TNBS/乙醇灌腸誘導(dǎo)SD大鼠結(jié)腸炎模型。81只SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(n=15，A組)、結(jié)腸炎組(n=15，B組)、MSCs治療1組(3×106MSCs,n=15，C組)、MSCs 治療2組(5×106MSCs,n=15，D組)、TNFRⅡ-IgG治療組(n=6，E組)和美沙拉嗪治療組(n=15，F(xiàn)組)。采用DAI描述大鼠的表現(xiàn)，大體CMDI描述腸道的肉眼下表現(xiàn)，TDI評(píng)價(jià)腸道組織學(xué)改變。結(jié)果MSCs經(jīng)過(guò)3次傳代后可純化。B組大鼠各時(shí)點(diǎn)DAI、CMDI和TDI評(píng)分均顯著高于A組(P<0.05)；第6天除A組外各組大鼠評(píng)分之間無(wú)明顯差異(P>0.05)；第9天 C組、D組和F組各評(píng)分均低于B組(P<0.05)，C組評(píng)分與D組無(wú)顯著差異(P>0.05)；第14天 C、D、E和F組評(píng)分均低于B組(P<0.05)，其中F組評(píng)分最高(P<0.05)，E組次之(P<0.05)，D組評(píng)分最低(P<0.05)。結(jié)論MSCs、TNFRⅡ-IgG和美沙拉嗪灌腸液可顯著改善TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠第14天的DAI、CMDI和TDI指標(biāo)，其中效果最好的是MSCs，其次是TNFRⅡ-IgG，美沙拉嗪灌腸液效果較差。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 腫瘤壞死因子受體Ⅱ-抗體融合蛋白； 美沙拉嗪； 炎癥性腸??； 大鼠

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的病因與發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，主要涉及遺傳、免疫、感染與環(huán)境因素。目前傳統(tǒng)的藥物以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)抗體對(duì)IBD的治療作用主要是緩解癥狀和促進(jìn)腸道病損黏膜的愈合，而無(wú)法徹底治愈IBD，且其不良反應(yīng)也較多；TNF受體Ⅱ(TNF receptorⅡ，TNFRⅡ)-抗體融合蛋白(TNFRⅡ-IgG)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究較多[1]，但應(yīng)用其治療IBD的研究很少。近年研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是IBD的一種新型有效的治療方法[2]。2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TBNS) /乙醇灌腸造模法屬于正常免疫系統(tǒng)下的半抗原誘導(dǎo)性模型制備方法，是目前應(yīng)用最廣泛的一種腸道炎癥模型，該方法誘發(fā)的體內(nèi)免疫反應(yīng)以Th1型反應(yīng)為主，類似于人類的克羅恩病(Crohn disease，CD)[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察并比較MSCs、TNFRⅡ-IgG和美沙拉嗪對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)與組織損傷指數(shù)(tissue damage index,TDI)的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(200±10)g(6周齡)或(100±10)g(4周齡),均購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件均為SPF級(jí)，晝夜節(jié)律為12 h/12 h，無(wú)特殊實(shí)驗(yàn)要求時(shí)正常供應(yīng)飼料和飲水。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2主要試劑與藥物 低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；0.25%含EDTA胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；大鼠單克隆抗體：anti-CD29(Biolegend)，anti-CD45(Biolegend)，anti-CD34(Santa Cruz)，anti-CD44(Santa Cruz)；50 g/L TNBS溶液(Sigma)；重組人TNFRⅡ-IgG(上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司)；美沙拉嗪灌腸液(Falk)。

2方法

2.1SD大鼠骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 原代培養(yǎng)采取全骨髓法。4周齡SD大鼠頸椎脫臼處死后75%乙醇中浸泡10 min，移入超凈臺(tái)，截取雙下肢股骨與脛骨，剪開兩側(cè)骨端，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔至發(fā)白為止，將獲得的骨髓細(xì)胞懸液移入離心管，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的低糖DMEM重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。以后每3 d換液1次，當(dāng)長(zhǎng)到80%～90%融合時(shí)，以1∶2傳代培養(yǎng)[4]。取第4代細(xì)胞,制成1×109/L的單細(xì)胞懸液,每管加入100 μL相關(guān)抗體，室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29、CD34、CD44和CD45的表達(dá)。第5代細(xì)胞作移植用。

2.2TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型建立 造模前禁食不禁水48 h, 禁食24 h后刺激大鼠以排出大腸遠(yuǎn)端的大便，共2次，之間相隔6 h以上，排空大便后腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。手提大鼠尾部，使大鼠倒立，將一直徑2.0 mm 長(zhǎng)約12 cm 的硅膠管從肛門輕柔插入結(jié)腸距肛門緣8 cm 處，一次性注入含TNBS的50%乙醇溶液(TNBS按照80 mg/kg給藥加上等體積的無(wú)水乙醇)，5 s灌完，灌完后維持倒立位置30 s～60 s，防止漏出藥液[3]。

2.3實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法 體重為(200±10)g成年雌性大鼠隨機(jī)分為6組(A、B、C、D、E與F組，后5組在第0天接受TNBS灌腸誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型)。A組為正常對(duì)照組(n=15，不做任何干預(yù)處理)；B組為結(jié)腸炎造模組(n=15，第2天尾靜脈注射1 mL DMEM);C組為MSCs治療1組(n=15，第2天尾靜脈注射1 mL含有3×106MSCs的細(xì)胞懸液)；D組為MSCs治療2組(n=15，第2天尾靜脈注射1 mL含有5×106MSC的細(xì)胞懸液)；E組為TNFRⅡ-IgG治療組(n=6，從第7天開始在每天的同一時(shí)段皮下注射直至第13天)；F組為美沙拉嗪治療組(n=15，從第2天開始給予美沙拉嗪灌腸液直至第13天)。美沙拉嗪灌腸液的劑量為100 mg·kg-1·d-1[5]。TNFRⅡ-IgG的劑量為5 mg·kg-1·d-1[6]。除E組外其他組分別在第6天、第9天、第14天處死5只大鼠，E組在第14天處死6只大鼠。

3觀察指標(biāo)與評(píng)分方法

3.1大鼠的一般情況 每天固定時(shí)段內(nèi)觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、毛發(fā)光澤、飲食情況等并記錄體質(zhì)量變化、大便性狀和便血情況并進(jìn)行評(píng)分。DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[7]。DAI=(體重下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+隱血分?jǐn)?shù))/3。大便性狀正常是成形大便；稀便是糊便或者半成形大便但不黏附肛門；腹瀉是水樣便并且黏附肛門。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3.2結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index, CMDI)評(píng)分 戊巴比妥鈉致死劑量處死大鼠后，取末端大腸10 cm，縱行切開后用冰生理鹽水沖洗干凈后肉眼觀察大腸黏膜損傷情況，并進(jìn)行CMDI評(píng)分[6]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)1：0分，沒(méi)有損傷；1分，充血，無(wú)潰瘍；2分，點(diǎn)狀或線性潰瘍，無(wú)明顯的炎癥；3分，有1個(gè)明顯炎癥表現(xiàn)的潰瘍；4分，2個(gè)或更多的潰瘍或者炎癥部位；5分，2個(gè)或者更多的有炎癥表現(xiàn)的潰瘍，或者有一潰瘍/炎癥的范圍超過(guò)了1 cm；6～10分，如果損傷范圍超過(guò)了2 cm，范圍每多1 cm評(píng)分就加1分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)2：0分，沒(méi)有粘連；1分，輕度粘連(跟其它組織容易剝離)；2分，重度粘連?？偡?評(píng)分1+評(píng)分2。

3.3組織損傷指數(shù)評(píng)分 剪取部分病變組織立即放于4%的多聚甲醛液中固定，石蠟包埋后切片，HE染色后行TDI評(píng)分[8]，見表2。

表2 組織學(xué)損傷指數(shù)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1SD大鼠骨髓MSCs培養(yǎng)后形態(tài)與鑒定

原代培養(yǎng)3 d后換液，顯微鏡下可見MSCs呈梭形、三角形及多角形，可見散在的由MSCs形成的細(xì)胞集落，也可見少量圓形透亮的雜細(xì)胞。3～6 d細(xì)胞數(shù)量迅速增多，呈漩渦狀生長(zhǎng)，10 d后可長(zhǎng)到90%融合。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯增快，細(xì)胞形態(tài)仍為梭形或多角形，有粗大突起，6～7 d可長(zhǎng)滿。雜細(xì)胞隨傳代減少，到第3代MSCs可達(dá)到明顯純化，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：第4代MSCs表達(dá)CD29及CD44，不表達(dá)CD34及CD45。CD29和CD44的陽(yáng)性率分別為(98.26±0.52)%和(98.98±0.49)%，提示細(xì)胞為MSCs，見圖2。

Figure 1. Morphological feature of MSCs under phase-contrast microscope (×100). A: passage 0； B: passage 5.

圖1相差顯微鏡下原代和第5代大鼠MSCs的形態(tài)

Figure 2. Expression of markers CD29 (A), CD34 (B), CD44 (C) and CD45 (D) in rat MSCs tested by flow cytometry.

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠第4代MSCs表面CD抗原的表達(dá)

2TNBS/乙醇誘導(dǎo)SD大鼠結(jié)腸炎模型

采用TNBS/乙醇灌腸后發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎模型大鼠DAI、CMDI和TDI評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組大鼠，結(jié)腸炎模型大鼠經(jīng)TNBS誘導(dǎo)后第2天出現(xiàn)腹瀉、膿血便和體質(zhì)量下降，大鼠結(jié)腸組織表現(xiàn)為腸管增粗和腸壁增厚，并與腹腔內(nèi)組織粘連，腸黏膜明顯充血水腫、糜爛和潰瘍形成。鏡下可見炎癥累及結(jié)腸腸壁全層，大量炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞)浸潤(rùn)，并可見腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)破壞，腸上皮不完整及脫落，糜爛以及潰瘍形成。從第9天開始大鼠體重緩慢增加，腹瀉與便血減輕，持續(xù)至第14天。

3各組大鼠的DAI評(píng)分

除正常組外，各組大鼠癥狀在前6 d無(wú)明顯差異。B組第6天DAI評(píng)分明顯高于A組(P<0.01)，稍高于C、D和F組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第9天 C、D和F組的DAI評(píng)分明顯低于B組(P<0.01)。第14天 C組、D組、E組和F組的DAI評(píng)分明顯低于B組(P<0.01)，F(xiàn)組高于E組(P<0.05),C組和D組低于E組(P<0.01),C組高于D組(P<0.01),見表3。

表3各組大鼠DAI評(píng)分

Table 3. The score of disease activity index in every group (mean±SD)

Groupn6d9d14dA15000B153．00±0．23??2．93±0．282．00±0．23C152．80±0．18??1．67±0．24##0．67±0．47##D152．73±0．28??1．60±0．27##0．13±0．30##E61．05±0．33##F152．85±0．32??2．56±0．30##1．43±0．35##

**P<0.01vsgroup A；##P<0.01vsgroup B.

4各組大鼠CMDI評(píng)分

第6天 B、C、D和E組CMDI評(píng)分明顯高于A組(P<0.01)，B、C、D和F組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。第9天 B組CMDI評(píng)分明顯高于A組(P<0.01)，C組和D組低于B和F組(P<0.01)，C組和D組之間無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)，F(xiàn)組低于B組(P<0.01)，與第6天 相比無(wú)明顯差別(P>0.05)。第14天 B組CMDI評(píng)分明顯高于A組(P<0.01)，C、D、E和F組明顯低于B組(P<0.01)，F(xiàn)組評(píng)分高于C、D和E組(P<0.05),C組和D組CMDI評(píng)分低于E組(P<0.05)，D組稍低于C組(P<0.05),見圖3、表4。

5各組大鼠TDI評(píng)分

第6天 B、C和D組TDI評(píng)分明顯高于A組，B、C、D和F組之間評(píng)分無(wú)明顯差異(P>0.05)。第9天B和F組 TDI評(píng)分高于C組和D組(P<0.01)，B組高于F組(P<0.05)。第14天 B組TDI評(píng)分高于A、C、D、E和F組(P<0.01)，F(xiàn)組評(píng)分高于C、D和E組(P<0.01),E組評(píng)分高于C與D組(P<0.05),C組評(píng)分高于D組(P<0.05),見圖4、表5。

Figure 3. Macroscopic changes of rat colons in different groups on day 14. A: normal control group, normal gut; B: colitis group, one ulcer of three centimeters; C: MSCs treatment 1 group, local hyperemia, no ulcer; D: MSCs treatment 2 group, no hyperemia, no ulcer; E: TNFR Ⅱ-IgG treatment group, local hyperemia, no ulcer; F: mesalazine treatment group, ulcer with significant inflammation.

圖3第14天各組大鼠結(jié)腸的大體圖片

表4各組大鼠CMDI評(píng)分比較

Table 4. The score of colon macroscopic damage index of rats in the 6 groups (mean±SD)

Groupn6d9d14dA15000B159．00±0．70??9．20±0．83??7．80±1．10??C158．60±0．54??4．20±0．83##2．40±0．89##D158．40±0．55??3．60±0．14##1．20±0．44##E63．50±1．04##F158．70±0．89??8．00±0．31##4．67±1．03##

**P<0.01vsgroup A；##P<0.01vsgroup B.

Figure 4. Histological changes of rats colons in 6 groups on day 14 (HE staining,×100). A: normal control group, normal mucosa; B: colitis group, transmural inflammation, entire crypt and epithelium lost; C: MSCs treatment 1 group, almost complete regeneration; D: MSCs treatment 2 group, complete regeneration; E: TNFRⅡ-IgG treatment group, epithelium regeneration with crypt depletion; F: mesalazine treatment group, surface epithelium intact.

圖4第14天各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變

表5各組大鼠TDI評(píng)分比較

Table 5. The score of tissue damage index of rats in the 6 groups(mean±SD)

Groupn6d9d14dA15000B1516．00±0．70??15．20±0．4411．60±1．14C1515．80±0．83??8．40±0．89##2．80±0．83##D1515．60±0．54??8．20±0．44##1．60±0．55##E63．83±1．16##F1515．90±0．65??14．60±0．83#7．50±0．54##

**P<0.01vsgroup A；#P<0.05，##P<0.01vsgroup B.

討 論

MSCs與生物制劑對(duì)促進(jìn)黏膜愈合已成為當(dāng)今IBD研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，而美沙拉嗪對(duì)輕度的黏膜炎癥有一定的修復(fù)作用，在同一炎癥程度的動(dòng)物模型中，三者對(duì)炎癥黏膜的修復(fù)作用如何，相關(guān)的研究很少。TNBS/乙醇誘導(dǎo)SD大鼠結(jié)腸炎程度可直接影響到實(shí)驗(yàn)干預(yù)的效果，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用TNBS/乙醇100 mg/kg的劑量大鼠體重下降明顯，膿血便嚴(yán)重，死亡率高，逐步減量至80 mg/kg，灌腸后發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎模型大鼠表現(xiàn)與Morris等[3]的研究大致相同，灌腸所用的TNBS劑量與Li等[5]的不一致，與楊曉彤等[9]的研究一致。在該模型下，本組資料發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪組大鼠DAI、CMDI和TDI評(píng)分在第14天評(píng)分明顯低于結(jié)腸炎組，但是大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)不明顯，糊便多見；腸黏膜充血水腫，糜爛和潰瘍?nèi)钥梢?；鏡下仍可見少量到中量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見隱窩損傷。治療效果不佳且起效時(shí)間慢，這與Feagan等[10]的報(bào)道有所區(qū)別。這可能與藥的劑型、給藥方式和動(dòng)物的炎癥程度有關(guān)。

TNFRⅡ-IgG主要應(yīng)用治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并在多個(gè)大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)[11-12]證實(shí)了依那西普(國(guó)外上市的TNFRⅡ-IgG制劑)的療效。TNFRⅡ-IgG在IBD中應(yīng)用的研究很少。本組資料顯示TNFRⅡ-IgG治療組可明顯緩解大鼠消瘦、血便等癥狀，減輕結(jié)腸的損害，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞再生，提示TNFRⅡ-IgG能明顯減輕TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥。TNFRⅡ-IgG在用藥后3 d已經(jīng)起效，且在用藥7 d后發(fā)揮明顯的治療作用，與美沙拉嗪組相比顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。TNFRⅡ-IgG的治療機(jī)制可能通過(guò)抑制炎癥誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡從而減輕TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸損害[13]。Paiotti等[6]的研究顯示依那西普可減輕TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸損害。本研究為TNFRⅡ-IgG在IBD中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

自Drakos等[14]第1次報(bào)道1例CD患者在骨髓移植6個(gè)月無(wú)疾病活動(dòng)后，相繼有類似的臨床研究報(bào)道[15]。MSCs具有很強(qiáng)的可塑性，可分化為腸上皮細(xì)胞[16]，也可以分化為肌成纖維細(xì)胞[17]；除了多向分化的潛能外，還可分泌多種細(xì)胞因子[18]；也具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用[19]。現(xiàn)在還不能完全明確MSCs治療IBD的機(jī)制，可能是通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮治療作用[20]。MSCs容易分離獲得，可在體外大量擴(kuò)增且仍保持增殖與分化潛能。因此MSCs移植是一種十分有吸引力的治療方式。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)在炎癥環(huán)境條件下可促進(jìn)MSCs增殖[21]。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MSCs干預(yù)后前6 d的表現(xiàn)跟結(jié)腸炎組大鼠無(wú)明顯差異，第6天的DAI評(píng)分雖然低于結(jié)腸炎組但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種現(xiàn)象的原因不明。Tanaka等[17]在葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動(dòng)物模型中觀察到在誘導(dǎo)結(jié)腸炎的過(guò)程中MSCs是沒(méi)有任何治療作用的，可能是因?yàn)镸SCs從注射到發(fā)揮治療作用需要一定時(shí)間，當(dāng)然也有可能是結(jié)腸炎造模時(shí)的炎癥程度偏重有關(guān)。移植過(guò)MSCs的大鼠從第7天開始體質(zhì)量開始增加，腹瀉和便血減輕，到第14 d時(shí)大鼠一般情況良好，無(wú)腹瀉和便血，大鼠腸黏膜有輕度充血，糜爛和潰瘍已不可見，鏡下可見腸黏膜腺體和上皮增生，結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。研究提示MSCs起效時(shí)間比較慢，在移植2周后黏膜基本可完全恢復(fù)。

本研究首次觀察到MSCs在TNBS誘導(dǎo)的動(dòng)物結(jié)腸炎中具有劑量依賴性的干預(yù)作用，高劑量MSCs可取得更好的治療效果。Tanaka等[17]在DSS誘導(dǎo)的動(dòng)物結(jié)腸炎中也有類似的研究結(jié)果。與之不同的是本研究中第6天和第9天的損傷評(píng)分沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的區(qū)別，表明高劑量的優(yōu)勢(shì)需要一定時(shí)間才能發(fā)揮出來(lái)。

MSCs移植后大鼠DAI、CMDI和TDI評(píng)分均低于TNFRⅡ-IgG組和美沙拉嗪組，顯示MSCs移植比傳統(tǒng)藥物美沙拉嗪和新型免疫抑制劑TNFRⅡ-IgG的療效更好，大大提高了MSCs作為難治性疾病IBD的一種高效治療方式的可能性。

本實(shí)驗(yàn)表明MSCs對(duì)IBD有肯定的治療效果，且優(yōu)于傳統(tǒng)藥物美沙拉嗪和新型免疫抑制劑TNFRⅡ-IgG，同時(shí)MSCs的治療作用還呈一定劑量-效應(yīng)關(guān)系，為IBD的治療提供了一種新選擇，也為MSCs在動(dòng)物結(jié)腸炎研究中劑量和時(shí)間的選擇提供了一定的依據(jù)。MSCs治療IBD的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。新型免疫抑制劑TNFRⅡ-IgG也顯示出顯著的治療效果，為IBD的治療又提供了一種新的選擇。

[1] Reich K, Segaert S, Van de Kerkhof P, et al. Once-weekly administration of etanercept 50 mg improves patient-reported outcomes in patients with moderate-to-severe plaque psoriasis[J]. Dermatology, 2009, 219(3): 239-249.

[2] 昝 慧，鐘英強(qiáng). 間充質(zhì)干細(xì)胞治療炎性腸病的研究進(jìn)展[J]. 新醫(yī)學(xué),2011, 42(4): 211-214.

[3] Morris GP, Beck PL, Herridge MS, et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J]. Gastroenterology, 1989, 96(3): 795-803.

[4] 昝 慧，黃花榮，鐘英強(qiáng)，等. 硫唑嘌呤對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志,2012, 28(5): 785-790.

[5] Li J, Zhou R, He W, et al. Effects of recombinant human intestinal trefoil factor on trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis in rats[J]. Mol Biol Rep,2011, 38(7): 4787-4792.

[6] Paiotti AP, Ribeiro DA, Silva RM, et al. Effect of COX-2 inhibitor lumiracoxib and the TNF-alpha antagonist etanercept on TNBS-induced colitis in Wistar rats[J]. J Mol Histol, 2012, 43(3): 307-317.

[7] Cooper HS, Murthy SN, Shah RS, et al. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis[J]. Lab Invest,1993, 69(2):238-249.

[8] Dieleman LA, Palmen MJ, Akol H, et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines[J]. Clin Exp Immunol, 1998, 114(3): 385-391.

[9] 楊曉彤，張明明，洪 娜，等.Faecalibacteriumprausnitzii對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠Foxp3+Treg細(xì)胞的影響[J]. 胃腸病學(xué),2012,17(3):141-145.

[10] Feagan BG,Macdonald JK. Oral 5-aminosalicylic acid for induction of remission in ulcerative colitis[J]. Cochrane Database Syst Rev,2012,10: CD000543.

[11] Klareskog L, van der Heijde D, de Jager JP, et al. Therapeutic effect of the combination of etanercept and methotrexate compared with each treatment alone in patients with rheumatoid arthritis: double-blind randomised controlled trial[J]. Lancet,2004, 363(9410): 675-681.

[12] Kristensen LE, Saxne T, Geborek P. The LUNDEX, a new index of drug efficacy in clinical practice: results of a five-year observational study of treatment with infliximab and etanercept among rheumatoid arthritis patients in southern Sweden[J]. Arthritis Rheum, 2006, 54(2):600-606.

[13] Fries W, Muja C, Crisafulli C, et al. Infliximab and etanercept are equally effective in reducing enterocyte apoptosis in experimental colitis[J]. Int J Med Sci,2008,5(4):169-180.

[14] Drakos PE, Nagler A, Or R.Case of Crohn's disease in bone marrow transplantation[J]. Am J Hematol, 1993,43(2):157-158.

[15] Lopez-Cubero SO, Sullivan KM, Mcdonald GB. Course of Crohn's disease after allogeneic marrow transplantation[J]. Gastroenterology,1998,114(3):433-440.

[16] Matsumoto T, Okamoto R, Yajima T, et al. Increase of bone marrow-derived secretory lineage epithelial cells during regeneration in the human intestine[J]. Gastroenterology,2005,128 (7): 1851-1867.

[17] Tanaka H, Arimura Y, Yabana T, et al. Myogenic lineage differentiated mesenchymal stem cells enhance recovery from dextran sulfate sodium-induced colitis in the rat[J]. J Gastroenterol,2011, 46(2): 143-152.

[18] Kim DH, Yoo KH, Choi KS,et al. Gene expression profile of cytokine and growth factor during differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cell[J]. Cytokine,2004,31(2): 119-126.

[19] Kiss J, Urbn SV, Dudics V, et al. Mesenchymal stem cells and the immune system: immunosuppression without drugs[J]. Orvosi Hetilap,2008,149(8):339-346.

[20] 吳新環(huán)，鐘英強(qiáng). 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)炎癥性腸病腸上皮重建的作用機(jī)制[J]. 胃腸病學(xué), 2012, 17(4):245-247.

[21] 鐘英強(qiáng)，黃花榮，葉小研，等.結(jié)腸炎大鼠炎癥黏膜提取液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和表面分化抗原的影響[J]. 胃腸病學(xué)，2012，17(9)：531-535.

Effectsofmesenchymalstemcells,fusionproteinoftumornecrosisfactorreceptorⅡ-IgGFcandmesalazineondiseaseactivityindexandtissuedamageindexofTNBS-inducedcolitisinrats

WU Xin-huan1, HUANG Hua-rong2, ZHONG Ying-qiang1, YE Xiao-yan1, WANG Lin3

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofPediatrics,3DepartmentofPathology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:zhongyingqiang@21cn.com)

AIM: To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs), the fusion protein of tumor necrosis factor receptorⅡ-IgG Fc (TNFRⅡ-IgG) and mesalazine on the disease activity index (DAI) and tissue damage index (TDI) in the rat model of colitis induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).METHODSMSCs were cultured in low-glucose DMEM containing 10% FBS. Eighty-one Sprague-Dawley rats were used in the study and the model of colitis induced by TNBS/ethanol was established. The rats were randomly divided into 6 groups: normal control group (A), colitis group (B), MSCs treatment 1 (3×106MSCs) group (C), MSCs treatment 2 (5×106MSCs) group (D), TNFRⅡ-IgG treatment group (E) and mesalazine treatment group (F). The scores of DAI were used to record the manifestations of the rats, colon macroscopic damage index (CMDI) was used to describe the macroscopic features of the colon, and the scores of TDI were estimated by determining the pathological changes of the colon under microscope.RESULTSPure MSCs were gained by 3 times of passages. Compared with group A, the scores of DAI, CMDI and TDI in group B were always significantly increased. On day 6, these scores in every group except group A were not different obviously. On day 9, the scores in group C,group D and group F were lower than those in group B, and no statistic difference between group C and group D was observed. On day 14, the scores in group C, group D, group E and group F were lower than those in group B, and the scores in the groups were group F > group E > group C > group D.CONCLUSIONMSCs, TNFRⅡ-IgG and mesalazine used for 14 d significantly improve the scores of DAI, CMDI and TDI in the rats with colitis induced by TNBS. The method using MSCs is better than those using TNFRⅡ-IgG and mesalazine.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Tumor necrosis factor receptorⅡ-IgG Fc fusion protein; Mesalazine; Inflammatory bowel disease; Rats

R735

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.003

1000- 4718(2013)05- 0784- 06

2013- 02- 25

2013- 03- 25

中國(guó)醫(yī)療手牽手工程委員會(huì)、北京醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)勵(lì)基金會(huì)資助項(xiàng)目(No.XHYSGZZSDX-001);康哲IBD基金資助項(xiàng)目

△通訊作者 Tel: 020-81332598; E-mail: zhongyingqiang@21cn.com