曾慧蘭， 卜欠欠， 陳慧中， 覃永亮， 李 陽， 柏小芬， 鐘 啟， 余泮熹， 劉宏偉， 劉革修， 蘇澤軒

(暨南大學 1附屬第一醫(yī)院血液科， 2醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，廣東 廣州 510632；3江門市人民醫(yī)院血液科，廣東 江門 529020； 4廣東省第二人民醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510317；暨南大學 5國際學院， 6第一醫(yī)院整形外科，7血液病研究所，廣東 廣州 510632)

尼古丁對人臍帶間充質干細胞增殖和遷移的影響*

曾慧蘭1▲， 卜欠欠1▲， 陳慧中2， 覃永亮3， 李 陽1， 柏小芬1， 鐘 啟4， 余泮熹5， 劉宏偉6， 劉革修7△， 蘇澤軒6

(暨南大學1附屬第一醫(yī)院血液科，2醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，廣東 廣州 510632；3江門市人民醫(yī)院血液科，廣東 江門 529020；4廣東省第二人民醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510317；暨南大學5國際學院，6第一醫(yī)院整形外科，7血液病研究所，廣東 廣州 510632)

目的探討尼古丁對人臍帶間充質干細胞(MSCs)一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧(ROS)、線粒體膜電位及細胞因子生成的影響。方法尼古丁作用MSCs后，硝酸還原酶法測NO的釋放情況；分光光度計法測NOS和iNOS活性；流式細胞技術測ROS及線粒體膜電位的變化；ELISA法測培養(yǎng)上清液中細胞間黏附分子 1(ICAM-1)、基質細胞衍生因子 1(SDF-1)、基質金屬蛋白酶 9(MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制物 1(TIMP-1)、轉化生長因子 β1(TGF-β1)、胰島素樣生長因子 I(IGF-I)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)水平的變化。結果在24 h和36 h，NO水平隨尼古丁濃度上升而增加(P<0.05)，但在48 h，0.8 g/L與1.0 g/L組，NO水平低于對照組；NOS和iNOS活性隨尼古丁濃度上升而逐漸增加；尼古丁可增加MSCs的ROS水平，并降低線粒體膜電位；在尼古丁作用下，MSCs分泌SDF-1、TGF-β1、IGF-I及bFGF水平下降，ICAM-1、MMP-9及TIMP-1表達均上升。結論尼古丁通過增加NO、NOS、iNOS和ROS水平，降低線粒體膜電位，使SDF-1、TGF-β1、IGF-I及bFGF分泌下降，ICAM-1、MMP-9及TIMP-1表達上升，可能影響MSCs的增殖、黏附、遷移等特性。

尼古??； 間充質干細胞； 一氧化氮； 一氧化氮合酶； 活性氧； 線粒體膜電位； 細胞因子類

人臍帶間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有高度自我更新能力及多向分化潛能的多能干細胞，在細胞替代治療及組織工程方面有極大的應用價值[1-2]。煙草危害是當今世界公認的公共衛(wèi)生問題，其中尼古丁約占煙草生物堿總量的95%。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)尼古丁可促進MSCs凋亡[3]。本研究在此基礎上，觀察尼古丁對MSCs的一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、線粒體膜電位及細胞間黏附分子 1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、基質細胞衍生因子 1(stromal cell-derived factor 1 ，SDF-1)、基質金屬蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制物 1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)、轉化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、胰島素樣生長因子 I(insulin-like growth factor I，IGF-I)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)影響，以進一步闡明尼古丁致病機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞 人臍帶MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定見文獻[4]，取第3～7代細胞做實驗。

1.2試劑與儀器 尼古丁(北京伊普瑞斯公司)；DMEM/F12、澳洲胎牛血清(Gibco)；青霉素、鏈霉素(華北制藥公司)；胰酶(Sigma)；NO試劑盒、NOS試劑盒和iNOS試劑盒(南京建成科技有限公司)；活性氧試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；TGF-β1、ICAM-1、MMP-9、VEGF、HGF、VCAM-1和TIMP-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；bFGF、SDF-1和IGF-I酶聯(lián)免疫分析試劑盒(華美生物工程有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)；分光光度計(BD FACSAria)；流式細胞儀(Becton Dickinson)；TECAN: Sunrise Remote/TonchScreen酶標儀(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)。

2方法

2.1硝酸還原酶法測MSCs NO釋放 MSCs以2×108/L接種于12孔板，培養(yǎng)24 h，實驗組加含10%FBS的DMEM/F12 配制的尼古丁液(0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L)，對照組加含10%FBS的DMEM/F12。分別于24 h、36 h和48 h取上清液，硝酸還原酶法測NO的釋放情況。

2.2分光光度計法測NOS和iNOS活性 MSCs以1×108/L接種于24孔板，培養(yǎng)24 h，實驗組加尼古丁液(0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L)，對照組加含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，分別作用24 h、36 h和48 h，取上清液，按說明書操作測NOS和iNOS活性。

2.3尼古丁對MSCs ROS影響 細胞以 2×108/L接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液。每孔加入10 mol/L DCFH-DA液1 mL，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，棄DCFH-DA液。對照組加含10%FBS的DMEM/F12，實驗組加尼古丁液(0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L)。孵育20 min，收集細胞。PBS洗滌3次，1 mL PBS重懸細胞，流式細胞術測ROS。

2.4流式細胞儀測線粒體膜電位改變 MSCs以 2×108/L接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液。對照組加入含10%FBS的DMEM/F12，實驗組加尼古丁液(0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L)。孵育24 h，收集細胞。加200 μL 10 mg/L JC-1熒光染料，避光染色30 min，離心，250 μL緩沖結合液重懸，流式細胞術測線粒體膜電位改變。

2.5ELISA法測MSCs細胞因子分泌水平 MSCs以2×108/L接種于6孔板，實驗組加尼古丁液(0.4 g/L、0.6 g/L和1.0 g/L)，對照組加含10%FBS的DMEM /F12培養(yǎng)液，24 h后，收集上清液于-80 ℃冷藏備用，按照ELISA試劑盒操作，酶標儀測450 nm處吸光度(A450)，CurveExpert 1.3軟件計算出ICAM-1、SDF-1、MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、IGF-I和bFGF濃度。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0軟件，數(shù)據以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1尼古丁對NO釋放的影響

在24 h及36 h，尼古丁各濃度組的NO含量均明顯高于對照組(P<0.05)；但在48 h，尼古丁0.6 g/L組NO含量顯著高于對照組(P<0.05)，而0.8 g/L與1.0 g/L組NO含量低于對照組，但無顯著差異(P>0.05),見圖1。

Figure 1. Effects of different concentrations of nicotine on NO release in MSCs for 24,36 and 48 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 g/L nicotine group.

圖1不同濃度尼古丁對MSCs釋放NO的影響

2尼古丁對NOS和iNOS活性的影響

NOS活性隨尼古丁濃度上升而逐漸增加，在36 h時最高，后逐漸降低，各組NOS活性在24 h和36 h時高于對照組(P<0.05),見圖2；隨尼古丁濃度上升iNOS活性逐漸增加，在36 h時最高，iNOS活性在24 h和48 h時高于對照組(P<0.05),見圖3。

3尼古丁對ROS影響

0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L尼古丁作用MSCs 20 min后，各實驗組熒光強度分別為284.56±5.92、301.69±11.37、368.46±10.13，均高于對照組(262.43±92.80；n=3，P<0.05),見圖4。

Figure 2. Effects of different concentrations of nicotine on NOS activity in MSCs for 24,36 and 48 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 g/L nicotine group.

圖2不同濃度尼古丁對MSCsNOS活性影響

Figure 3. Effects of different concentrations of nicotine on iNOS activity in MSCs for 24,36 and 48 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 g/L nicotine group.

圖3不同濃度尼古丁對MSCsiNOS活性的影響

Figure 4. Effects of nicotine on ROS production in MSCs for 20 min.

圖4尼古丁對MSCsROS的影響

4尼古丁對MSCs線粒體膜電位的影響

0.6 g/L、0.8 g/L和1.0 g/L尼古丁作用MSCs 24 h后，綠色熒光比率分別為(5.03±0.83)%、 (10.13±1.30)%和(19.10±1.25)%，均高于對照組[(2.56±0.40)%;n=3，P<0.05],見圖5，呈濃度依賴性。

5尼古丁對細胞因子分泌水平的影響

不同濃度尼古丁作用后，ICAM-1表達上升，呈濃度依賴性，0.6和1.0 g/L尼古丁組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1；SDF-1濃度隨尼古丁濃度的增加而逐漸降低(P<0.05),見表1；MMP-9表達上升，不同濃度尼古丁組TIMP-1濃度均高于對照組，0.4 g/L尼古丁組達高峰，后隨尼古丁濃度增加，TIMP-1濃度降低(P>0.05),見表1；TGF-β1的濃度下降，呈濃度依賴性,見表2；IGF-I表達下降(P<0.05),見表2；bFGF表達下降，呈濃度依賴性,見表2。

Figure 5. Effects of nicotine on mitochondrial membrane potential in MSCs for 24 h.

圖5尼古丁對MSCs線粒體膜電位的影響

表1 尼古丁對MSCs產生ICAM-1、SDF-1、MMP-9和TIMP-1的影響

*P<0.05vs0 g/L nicotine group.

表2 尼古丁對MSCs產生TGF-β1、IGF-I和bFGF的影響

*P<0.05vs0 g/L nicotine group.

討 論

近年來尼古丁對MSCs毒性研究引起關注，而其作用機制尚未十分明確，許多學者從形態(tài)學、增殖凋亡、Ca2+、尼古丁型乙酰膽堿受體表達變化等方面進行研究，證實尼古丁從多方面影響MSCs的活性及功能。本課題組也初步發(fā)現(xiàn)尼古丁對人臍帶MSCs有毒性作用[3]，但有關尼古丁對人臍帶MSCs的NO、NOS、ROS、線粒體膜電位及細胞因子ICAM-1、SDF-1、MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、IGF-I、bFGF水平影響如何，目前尚未見相關報道。

NO參與細胞凋亡的調控，有雙重效應，高濃度NO促進細胞凋亡，低濃度則延緩細胞凋亡[5]。本研究發(fā)現(xiàn)尼古丁作用MSCs 24 h與36 h后，NO水平升高，呈濃度依賴性，表明尼古丁可通過刺激MSCs釋放NO，導致細胞凋亡。但尼古丁作用48 h后，NO釋放下降，可能是尼古丁刺激MSCs釋放大量的NO，高濃度NO導致細胞凋亡，細胞數(shù)量減少，釋放的NO也隨之下降。NOS作為催化L-精氨酸合成NO唯一的限速酶，其中iNOS是被報道最多的亞型之一。iNOS由炎癥因子、內毒素等誘導激活，催化合成大量NO，并產生大量的活性氧物質，造成細胞氧化損傷[6]?？梢奛OS、iNOS和NO與氧化損傷有一定相關性。本研究NOS和iNOS活性隨尼古丁濃度上升而逐漸增加，同時通過催化生成大量NO，進而產生毒性很大的ONOO-而引起蛋白質、類脂質及DNA氧化，干擾多種酶而誘導細胞凋亡。

ROS主要由線粒體產生，造血干細胞的增殖、分化及遷移需要適當水平的ROS維持，但高水平的ROS則會使造血干細胞廣泛性氧化損傷，導致細胞的死亡[7]。有學者認為線粒體DNA的損傷可促進ROS的產生，線粒體膜受到ROS攻擊后發(fā)生脂質過氧化，導致凋亡誘導因子的釋放[8]。本研究線粒體膜電位降低，而ROS水平增高，說明尼古丁使MSCs線粒體DNA損傷，從而促進ROS的產生。而高濃度的ROS攻擊線粒體膜，線粒體膜發(fā)生脂質過氧化，通透性改變，釋放凋亡誘導因子，形成ROS-線粒體DNA損傷的惡性循環(huán)，使細胞進入不可逆的凋亡過程。以上這些機制相互聯(lián)系，通過協(xié)同作用，導致細胞氧化損傷，最終促使凋亡。

ICAM-1不僅調節(jié)細胞和細胞之間、細胞和基質之間的黏附，也影響和調節(jié)細胞對周圍環(huán)境的反應，因而細胞黏附行為的改變勢必影響到細胞的增殖活力、遷移等功能[9]。周衛(wèi)輝等[10]報道尼古丁可增加內皮細胞ICAM-1表達，促進中性粒細胞與內皮細胞黏附，在COPD慢性炎癥發(fā)病中起重要作用。本實驗示尼古丁可促進MSCs的ICAM-1表達，使得MSCs與周圍細胞及細胞外基質黏附異常，可能影響 MSCs的遷移等，與文獻結果類似[11-12]。

MSCs歸巢涉及多種趨化因子及其受體，最為典型的是SDF-1及其受體CXCR4。MSCs除了表達SDF-1，還可通過自分泌表達其受體CXCR4。SDF-1/CXCR4信號途徑主要作用是促進MSCs的遷移，也可促進MSCs生長、轉錄激活、抗凋亡等[13-15]。MSCs在低氧條件下SDF-1表達增加，促進與其受體CXCR4的結合，從而增加了對MSCs的遷移和向缺血組織歸巢的特性，可見SDF-1不僅介導趨化，還促進MSCs進入機體局部缺血的損傷區(qū)[16-17]。本研究中尼古丁抑制SDF-1表達，可能使MSCs的遷移能力下降。

MMP-9可降解基底膜和細胞外基質的大多數(shù)蛋白質，在細胞外基質降解、結構重塑、細胞遷移等過程中都發(fā)揮重要作用，TIMP-1以1∶1的比例形成非共價鍵與MMP-9形成復合物，從而阻斷MMP-9與底物的結合，兩者共同調解細胞外基質降解，一旦MMP-9/TIMP-1比例失衡，導致細胞外基質降解紊亂，嚴重破壞細胞的活性及遷移等功能。劉菲等[18]證實吸煙使大鼠腦血管內皮細胞MMP-9 的上調而致血管壁動脈粥樣硬化的形成，最終致血栓的形成。本研究MMP-9和TIMP-1表達上升，但MMP-9/TIMP-1比例失衡，引起蛋白酶-抗蛋白酶失衡，細胞外基質等出現(xiàn)降解紊亂，除了使MSCs受損，也可能影響MSCs遷移等功能。上述結果與Katono等[19]研究的尼古丁致使人成骨細胞MMP-9/TIMP-1失衡結果類似。

李麗艷等[20]報道TGF-β1可誘導MSCs增殖和向軟骨細胞分化，合成軟骨特異性Ⅱ型膠原甚至蛋白多糖，為軟骨組織工程修復缺損提供大量的種子細胞。TGF-β1對MSCs增殖、分化的促進作用已被廣泛證實[21-22]。 IGF-I既有胰島素樣合成作用又有生長促進作用，是一種有絲分裂原，與其相應受體結合后可經過一系列信號轉導把有絲分裂和代謝信號傳遞到細胞核，通過增加 DNA的合成、上調細胞周期蛋白的表達，發(fā)揮促進細胞分裂增殖等生物學效應[23]。MSCs可分泌IGF-I、bFGF等多種細胞因子，參與促進血管生成、降低心肌細胞凋亡等過程，對損傷心肌具有一定的保護作用。bFGF能促進多種細胞生長、增殖和分化，不僅能提高MSCs的增殖速度及其壽命，且能在增殖過程中保留MSCs的多向分化潛能[24-25]。巴云濤等[26]從人臍帶Wharton’s jelly 中分離出MSCs和bFGF能使該細胞從組織塊游出時間提前和有助于促使細胞貼壁，也在一定程度上維持細胞形態(tài)穩(wěn)定性，提高增殖能力，且不改變細胞的表面標志物表達。本實驗TGF-β1、IGF-I和bFGF分泌減少，抑制MSCs增殖，也可能通過影響新生血管形成，間接抑制MSCs增殖。

尼古丁刺激人臍帶MSCs釋放NO，增加NOS和iNOS活性，使線粒體DNA損傷，促進ROS產生，導致細胞氧化損傷；使細胞的ICAM-1分泌增加，SDF-1表達下降，MMP-9/TIMP-1比例失衡，破壞MSCs的黏附和遷移特性；使分泌TGF-β1、IGF-I和bFGF水平均下降，抑制MSCs增殖。

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Effectsofnicotineonproliferationandmigrationofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells

ZENG Hui-lan1, BU Qian-qian1, CHEN Hui-zhong2, QIN Yong-liang3, LI Yang1, BAI Xiao-fen1, ZHONG Qi4, YU Pan-xi5, LIU Hong-wei6, LIU Ge-xiu7, SU Ze-xuan6

(1DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofStomatology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3DepartmentofHematology,thePeople’sHospitalofJiangmen,Jiangmen529020,China;4DepartmentofHematology,GuangdongNo.2ProvincialPeople'sHospital,Guangzhou510317,China;5InternationalAcademy,6DepartmentofPlasticSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,7InstituteofHematology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail: 53483119@qq.com)

AIM: To explore the effects of nicotine on nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS), inducible nitric oxide synthase (iNOS), reactive oxygen species (ROS), mitochondrial membrane potential and cytokine secretion in human umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs).METHODSMSCs were treated with different concentrations of nicotine. The content of NO was detected by nitrate reductase method. The activity of NOS and iNOS was mea-sured by ultraviolet spectrophotometry. ROS and mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry. The levels of intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1), stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP-1), transforming growth factor β1(TGF-β1), insulin-like growth factor I (IGF-I) and basic fibroblast growth factor (bFGF) were determined by ELISA.RESULTSAt 24 h and 36 h after exposure to nicotine, the levels of NO were significantly increased in a dose-dependent manner. However, at 48 h, the levels of NO in 0.8 g/L group and 1.0 g/L group were lower than that in control group. The activity of NOS and iNOS were significantly increased in a dose-dependent manner. The level of ROS increased, while mitochondrial membrane potential decreased. After nicotine treatment, the secretions of SDF-1, TGF-β1, IGF-I and bFGF declined, while the levels of ICAM-1, MMP-9 and TIMP-1 increased.CONCLUSIONNicotine may affect the proliferation, adhesion and migration of MSCs by increasing the levels of NO, NOS, iNOS and ROS and the production of ICAM-1, MMP-9 and TIMP-1, and decreasing the mitochondrial membrane potential and the secretion of SDF-1, TGF-β1, IGF-I and bFGF.

Nicotine; Mesenchymal stem cells; Nitric oxide; Nitric oxide synthase; Reactive oxygen species; Mitochondrial membrane potential; Cytokines

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.002

1000- 4718(2013)05- 0778- 06

2012- 12- 26

2013- 03- 21

國家自然科學基金資助項目 (No.81270568；No.30973127)；2011年廣州市第二批科技攻關項目(No.2011Y-00003)；2011年廣東省醫(yī)學科研項目(No.A2011339)；2012年暨南大學“國家級大學生創(chuàng)新實驗計劃”(No.1210559045)

△通訊作者Tel: 020-85220262; E-mail: 53483119@qq.com

▲并列第1作者