張仁禮， 劉彩霞， 孟錦繡， 張麗麗， 韓 冬， 蔡佳杰， 聞安民

(廣東省醫(yī)學科學院，廣東省人民醫(yī)院 1生殖醫(yī)學中心， 2醫(yī)學研究中心，廣東 廣州 510080)

·論著·

胚胎干細胞分化為表皮樣細胞基因啟動子區(qū)差異甲基化的研究*

張仁禮1△， 劉彩霞1， 孟錦繡2， 張麗麗1， 韓 冬1， 蔡佳杰1， 聞安民1

(廣東省醫(yī)學科學院，廣東省人民醫(yī)院1生殖醫(yī)學中心，2醫(yī)學研究中心，廣東 廣州 510080)

目的用全基因組甲基化芯片探討可能參與小鼠胚胎干細胞(ESCs)分化為表皮樣細胞(ELCs)的基因DNA甲基化調控機制。方法利用人羊膜建立體外誘導體系，將小鼠ESCs誘導定向分化為ELCs，分別取未分化的ESCs和誘導分化后的ELCs進行芯片分析，利用甲基化免疫共沉淀技術將每組染色質DNA的甲基化片段共沉淀下來，和本底對照 (input)分別標記Cy3和Cy5熒光，一同上樣于Roche NimbleGen高密度(2.1M，芯片覆蓋22 425個啟動子)甲基化芯片，啟動子區(qū)采用UCSC數據庫進行注釋，啟動子覆蓋轉錄起始位點上游8 200 bp、下游3 000 bp，通過對這些啟動子區(qū)甲基化譜的分析，篩選出甲基化調控可能與ESCs向ELCs定向分化相關的基因。結果小鼠ESCs和ELCs 兩組細胞在基因組水平上有17 500個啟動子存在甲基化，其中有3 435個啟動子發(fā)生甲基化差異變化，高CpG島的啟動子有894個發(fā)生差異甲基化，中度CpG島的啟動子有974個發(fā)生差異甲基化，低CpG島的啟動子有1 567個發(fā)生差異甲基化。結論在ESCs向ELCs定向分化的過程中，眾多的基因啟動子區(qū)發(fā)生了甲基化程度的變化，說明細胞分化是一個復雜的表觀遺傳學事件。這些基因啟動子的差異甲基化在ESCs向ELCs定向分化過程中所起的作用及其機制尚有待進一步的功能學研究闡明。

DNA甲基化； 胚胎干細胞； 表皮樣細胞； 啟動子； 甲基化DNA免疫共沉淀

在前期研究中，我們利用人羊膜接觸或非接觸均能將小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)定向誘導為表皮樣細胞(epidermal-like cells, ELCs),分化后的ELCs呈現典型單層表皮樣細胞形態(tài)改變，表達表皮特異標志物β1整合素(β1-integrin)、角蛋白19(cytokeratin 19, CK19)和角蛋白15(CK15)[1]。誘導后的細胞植入裸鼠皮下，可形成邊界清晰的瘤體，瘤體內可見大量表皮樣和表皮附屬器樣結構。這表明人羊膜能夠將ESCs定向誘導分化為ELCs，誘導后的細胞具有分化為表皮及表皮附屬器的潛能[2]。但在ESCs分化為ELCs的過程中，基因表達譜的變化和相關的表觀遺傳學調控機制等尚不清楚。本研究通過甲基化DNA免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP)與甲基化芯片(methylation microarray)技術相結合，比較誘導分化前后兩組細胞樣本間DNA甲基化的差異，快速高通量篩選出與定向分化相關關鍵基因，并分析這些基因的功能，以進一步闡述ESCs分化為表皮樣干細胞的發(fā)生機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、小鼠白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)、胰蛋白酶和胎牛血清均為Gibco產品；DNA純化試劑盒(DNeasy Blood & Tissue Kit ,Qiagen)；磁珠(BioMagTMmagnetic beads, Bangs laboratories)；5-甲基胞嘧啶抗體[anti-5-methylcytidine(mouse) (1 g/L), Diagenode]；小鼠IgG [mouse IgG (1 g/L), Jackson]；酚/氯仿/異戊醇25∶24∶1；全基因組擴增試劑盒(Sigma)；QIA快速聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增試劑盒(QIAquick PCR purification kit，Qiagen)；β-巰基乙醇 (Sigma)；100 mmol/L dNTPs (Invitrogen)；Cy3/Cy5 染料標記隨機引物 (TriLink Biotechnologies)；Klenow片段(NEB)；雜交試劑盒40(NimbleGen)；Nimble芯片雜交爐(NimbleGen)；超聲破碎儀(Bioruptor, Diagenode)；熱循環(huán)儀(Thermal cycler)；分光光度計(Nanodrop ND-1000)；芯片掃描儀(GenePix 4000B)。

1.2ES-BALB/c小鼠胚胎干細胞 中山大學附屬眼科中心黃冰教授惠贈。

2方法

2.1ESCs體外誘導分化 首先制備羊膜取足月妊娠剖腹產的胎膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含慶大霉素的生理鹽水反復沖洗，去除血污，剪切成大小約為3 mm×5 mm方形，浸泡于ESCs培養(yǎng)液中備用。取傳代培養(yǎng)48 h的ES-BALB/c細胞，以0.125%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，按5×108cells/L接種于雙層6孔培養(yǎng)板的下層，然后將制備好的羊膜置于雙層培養(yǎng)板的上層，用無LIF的ESCs培養(yǎng)液培養(yǎng)。每隔24 h將培養(yǎng)液換掉一半，培養(yǎng)3 d，倒置鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

2.2DNA樣本的制備 采用Qiagen DNA抽提試劑盒抽提DNA(按DNeasy Blood & Tissue Kit實驗手冊進行)，收集細胞沉淀去上清加入180 μL ATL緩沖液，加入20 μL蛋白酶K渦旋振蕩均勻，56 ℃孵育直至細胞充分裂解；加入2 μL RNA酶A渦旋振蕩均勻，室溫孵育2 min；渦旋15 s，加入AL緩沖液到樣本中，渦旋混勻，而后加入200 μL 乙醇(96%～100%)，再次混勻；過柱6 000×g離心1 min收集；轉移到新的2 mL收集管，加入500 μL的AW1緩沖液，6 000×g離心1 min 收集；500 μL的AW2緩沖液處理，20 000×g離心3 min 收集；將DNA純化柱轉移至干凈的1.5 mL的離心管，加入200 μL的AE緩沖液室溫孵育1 min，6 000×g離心1 min洗脫收集純化后的DNA。對DNA濃度和純度進行分光光度檢測。

2.3啟動子區(qū)差異性甲基化芯片分析

2.3.1超聲打斷基因組 每份樣本11 μg DNA溶入300 μL的緩沖液進行超聲打斷；超聲儀調至L檔(低速檔)；將DNA試管周圍的容器裝滿冷水，不斷補充的0.5 cm大小的碎冰降溫；超聲10個循環(huán)，每個循環(huán)設置30開，30停；取5 μL DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測超聲效果。

2.3.2甲基化DNA免疫共沉淀 MeDIP樣本和擬免疫共沉淀樣本(mock immunoprecipitation,mock IP)(各5 μg基因組DNA)用IP緩沖液調到500 μL,本底對照樣本(input)用IP緩沖液調到200 μL；將DNA在250 r/min轉速下，94 ℃孵育10 min;然后在4 ℃下迅速冷卻并做一個迅速的旋轉；加入5 μg抗5-甲基胞嘧啶抗體于MeDIP樣本中，5 μg鼠IgG抗體于擬免疫共沉淀樣本中，本底對照樣本不加任何試劑；在4 ℃旋轉震動孵育過夜；加入50 μL偶聯抗鼠IgG抗體的磁珠混勻，在4 ℃反復渦旋2 h；孵育后，在4 ℃用磁珠分離試劑富集磁珠2 min;去上清和廢棄液；采用3種沖洗液按順序沖洗磁珠。采用1 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.5 mmol/L EDTA(pH 8.0)和10% 十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)配制洗脫液，向MeDIP和mock IP管各加入200 μL的洗脫液；65 ℃洗脫15 min；分離的磁珠轉移到另外的管子里；酚氯仿法提取MeDIP-DNA和實驗參照DNA；用Nanodrop ND-1000測定其質量和濃度。

2.3.3MeDIP與input DNA片段線性擴增

① 文庫制備 MeDIP和input樣本各10 ng，用水調至各10 μL總量；在MeDIP和input樣本中再各加入2 μL的文庫制備緩沖液，然后貼壁轉移至0.2 mL的PCR反應管中；各加入1 μL文庫穩(wěn)定液、混勻，快速旋轉、轉移熱循環(huán)儀95 ℃ 2 min；立刻在冰上冷卻，再次快速旋轉；再加1 μL文庫制備酶，混勻；熱循環(huán)儀孵育，反應設置：16 ℃ 20 s,24 ℃ 20 s,37 ℃ 20 s,75 ℃ 5 s,4 ℃保溫；快速旋轉，-20 ℃保溫3 d。

②擴增及純化片段 按Sigma全基因組擴增試劑盒的操作流程來進行擴增，配好60 μL的反應混合物加入到每份樣本中，渦旋混勻。按以下熱反應流程來孵育擴增：95 ℃預變性3 min,1個循環(huán)；94 ℃變性15 s，65 ℃退火、延伸20 s，設置14個循環(huán)；4 ℃保溫。最后采用Qiagen的QIA快速PCR純化試劑盒，對擴增的DNA進行純化回收。

2.3.4熒光標記 按照羅氏芯片標記手冊步驟操作，用1 OD/42 μL 的9 mer隨機探針緩沖液來稀釋Cy3(綠色熒光)和Cy5(紅色熒光)標記的9 mer長的探針，將稀釋液加入0.2 mL薄壁的PCR管中，等分每管稀釋液到40 μL，-20 ℃避光保存。將MeDIP樣本和Input樣本分別放入到PCR管中。98 ℃ 10 min熱變性，快速轉移冰上10 min，加入20 μL dNTP/Klenow 混合物到各管中，充分吸打10次，并將底部振蕩防止DNA沉淀到管底。避光37 ℃孵育2 h。之后用0.5 mol/L EDTA終止反應，每個管中加入5 mol/L NaCl ，簡單的渦旋振蕩后轉移至含有異丙醇的1.5 mL管中，避光室溫孵育10 min， 12 000×g離心10 min去上清，用500 μL的80%冰乙醇懸浮沉淀物，12 000×g離心10 min去上清。在真空離心蒸發(fā)濃縮器中，地熱避光干燥5 min。在打開前簡單地振蕩環(huán)氧樹脂管，之后用25 μL的純化水對干燥顆粒進行渦旋，振蕩水化處理。采用 Nanodrop ND-1000檢測標記的DNA，并用6 μg標記的MeDIP/Input DNA進行芯片雜交反應。

2.3.5芯片雜交 設置雜交系統(tǒng)恒溫到42 ℃，將6 μg的MeDIP樣本和6 μg的Input樣本懸浮與5 μL水中。加入合適的NimbleGen雜交液到每個管中，渦旋振蕩15 s，轉移到收集管中，95 ℃避光孵育5 min。渦旋振蕩后將樣本管放置于預熱到42 ℃的雜交系統(tǒng)中。將NimbleGen Chip 混合液迅速放入精密混合物比對儀(Precision Mixer Alignment Tool, PMAT)中，并將芯片放入PMAT中。使用Gilson Microman M100 移液器將15 μL樣本慢慢地加入到芯片槽中。MeDIP樣本和Input樣本在42 ℃芯片雜交反應16～20 h。雜交完成后，用洗脫液進行洗脫。

2.3.6圖像采集和數據分析 芯片結果由Axon的GenePix 4000B雙通道掃描儀進行掃描讀取，獲得原始信號值。使用GenePix Pro 6.0軟件分析芯片結果原始信號值進行標準化等數據分析。將芯片讀取后的數據采用NimbleScan 2.5軟件進行分析，比較誘導的ELCs組與ESCs組DNA啟動子區(qū)的甲基化差異。基因啟動子甲基化情況的判斷通過對啟動子區(qū)設計的探針的甲基化富集峰值來體現，NimbleScan檢測出的峰值必須至少2個探針P值的-log10值大于等于2。在500 bp范圍內的峰值合并在一起來判斷甲基化與否。

2.3.7數據分析處理 這里我們采用Bioconductor packages Ringo, Limma, and MEDME軟件對芯片結果的原始信號值進行中位數中心化、位數標準化和線性化處理，用于后期的數據分析。用以上分析軟件產生的log2標準化值被應用于檢測固定長度的染色質中所在探針的富集信號強度。每個探針有相關的P值分數-log10，并設定一個樣本中某個啟動子區(qū)域內甲基化與否的閾值。

2.4芯片分析結果的PCR驗證 將基因組DNA 超聲打斷成400～500 bp片段加熱變性，并將變性后的單鏈DNA樣品分為2份。其中一份單鏈DNA樣品加入抗5-甲基胞嘧啶抗體。使用親和層析分離共沉淀樣品中的甲基化DNA片段的抗體復合物，樣品中其余的非甲基化DNA片段被洗脫。純化得到甲基化DNA 片段(MeDIP DNA)。另一份作為總對照樣本DNA(total input DNA)樣品。Real-time PCR檢測。Total input DNA 樣品作為模板，用待測基因特異性的引物進行real-time PCR，得到標準曲線的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)，即Ct(input);MeDNA-IP DNA樣品作為模板進行檢測，得到Ct (MeDNA-IP)。待測基因MeDIP的效率(MeDNA-IP/total input，%)= 2^[Ct(input)-Ct (MeDNA-IP)]× 100%。

結 果

1小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)及定向誘導鑒定

ESCs在分化前呈現巢式生長，細胞集落多呈圓或橢圓形，邊界光滑，細胞排列緊密，無明顯細胞邊界，見圖1A；誘導3 d 后，細胞形態(tài)出現明顯變化，細胞大而扁平，呈多邊形，排列緊密，細胞邊界清晰，呈典型單層上皮樣改變,見圖1B。

2樣本DNA質量檢測

將ESCs組和ELCs組提取的基因組總DNA用ND-1000檢測，A260/A280值均大于1.8，DNA純度高，可用于后續(xù)實驗。濃度為70.27 mg/L和103.76 mg/L，每管樣本共100 μL的量，樣本起始量均超過5 μg,足夠實驗所需。瓊脂糖凝膠電泳見圖2A, 總DNA條帶清晰，DNA完整度好，未有降解，可用于后續(xù)實驗。

上芯片的DNA樣本需要進行超聲片段化處理，用Nanodrop ND-1000檢測,分析片段化的DNA大小的分布區(qū)域，通常標準的分布范圍應該在200～1 000 bp。本次實驗中，片段化的DNA基本符合上芯片的范圍標準,見圖2B。

Figure 1. Morphological changes of ESCs before and after differentiation (×200). A: undifferentiated ESCs; B: single layer of ELCs differentiated from ESCs.

圖1ESCs分化前后的形態(tài)學變化

Figure 2. DNA quality tested by agarose gel electrophoresis. A: DNA integrity test; B: the size of DNA fragmentated by ultrasound. M: DNA marker; Lane 1: ESCs; Lane 2: ELCs.

圖2樣本DNA質量檢測

3甲基化芯片及數據差異分析

Figure 3. Methylation chip images.A, B, C: ESCs; D, E, F: ELCs.

圖3甲基化芯片掃描圖

采用NimbleGen 1×2.1M小鼠高密度甲基化芯片進行雜交，樣本采用Cy3綠色熒光，Cy5紅色熒光雙色通道標記，見圖3，Cy3標記input對照組份，Cy5標記免疫共沉淀組份。從芯片掃描圖上可見每張芯片信號均勻，清晰沒有邊緣化效應、刮傷等影響信號值，陽性定位點和陰性對照區(qū)域結果明顯。利用小鼠高密度甲基化芯片對ESCs及誘導后的ELCs進行檢測發(fā)現，在總共22 425個啟動子中， 有17 500個啟動子區(qū)發(fā)生甲基化，其中未分化前ESCs組檢測有15 501個啟動子發(fā)生甲基化事件，占總啟動子的69.1%，誘導分化后ELCs組檢測到15 973個啟動子發(fā)生甲基化事件，占總啟動子的71.2%；應用軟件GenePix Pro 6.0，對結果進行差異分析，在差異甲基化譜中顯示ESCs與誘導后的ELCs多達3 435個啟動子發(fā)生甲基化差異變化，占總啟動子的15.3%，富含CpG島的啟動子區(qū)(high CpG-containing promoter，HCP)有894個發(fā)生差異甲基化的啟動子，含有CpG島中等程度的啟動子區(qū)(intermediate CpG-containing promoter，ICP)有974個發(fā)生差異甲基化的啟動子，CpG島含量微少的啟動子區(qū)(low CpG-containing promoter，LCP)有1 567個發(fā)生差異甲基化的啟動子。在HCP中，ESCs組基因啟動子有357個發(fā)生了甲基化而ELCs中不存在甲基化，ELCs組中有537個基因啟動子發(fā)生甲基化而ESCs組中沒有檢測到甲基化存在；在ICP中，ESCs組基因啟動子有412個發(fā)生了甲基化而ELCs中不存在甲基化，ELCs組中有562個基因啟動子發(fā)生甲基化而ESCs組中沒有檢測到甲基化存在；在LCP中，ESCs組基因啟動子有714個發(fā)生了甲基化而ELCs中不存在甲基化，ELCs組中有853個基因啟動子發(fā)生甲基化而ESCs組中沒有檢測到甲基化存在。

4基因啟動子甲基化差異的生物信息學分析

通過GeneSpring 11.0軟件對小鼠的高密度甲基化芯片中發(fā)生啟動子甲基化差異的基因進行基因本體(gene ontology,GO)分析和信號通路(Pathway)分析，探討這種表觀遺傳上的差異現象在生物學上的意義。甲基化基因的GO分析按照檢驗方法為Fisher’s exact test、P<0.01篩選，分析結果顯示在GO三大類中，即生物學過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)及細胞組分(cellular component，CC)。其中3 435個啟動子甲基化差異的基因在BP中含有2 994個，在MF中含有3 032個，在CC中含有3 080個。按照可信值由高到底排列各挑選前10位的注釋情況見表1。甲基化基因的信號通路(Pathway)分析按照檢驗方法為Fisher’s exact test、P<0.05篩選，在Pathway分析結果中顯示共有1 102個差異甲基化的基因，并挑選可信值高的前10位進行分析，見表2。應用軟件GenePix Pro 6.0，對在ESCs甲基化高ELCs中沒有檢測到的前10個基因，及在ELCs中甲基化高而在ESCs中沒有檢測到的前10個基因進行分析和注釋，見表3、4。

5MeDIP-PCR實驗對結果進行驗證分析

表1小鼠ESCs誘導分化成ELCs差異甲基化基因的GO分析結果

Table 1. The GO result of the differentially methylated genes of the mouse ESCs induced to be ELCs

GOIDTermCountPopHitsBiologicalprocess GO：0009987Cellularprocess164011097 GO：0008152Metabolicprocess10597156 GO：0044238Primarymetabolicprocess9146294 GO：0065007Biologicalregulation9056258 GO：0044237Cellularmetabolicprocess8516046 GO：0050789Regulationofbiologicalprocess8315922 GO：0050794Regulationofcellularprocess7875624 GO：0043170Macromoleculemetabolicprocess7335283 GO：0023052Signaling5553836 GO：0032501Multicellularorganismalprocess6194435Molecularfunction GO：0005488Binding157910643 GO：0003824Catalyticactivity7814895 GO：0043167Ionbinding5853760 GO：0043169Cationbinding5743712 GO：0046872Metalionbinding5683683 GO：0004871Signaltransduceractivity4532789 GO：0060089Moleculartransduceractivity4532789 GO：0004872Receptoractivity4232559 GO：0005515Proteinbinding7475293 GO：0004888Transmembranereceptoractivity3161956Cellularcomponent GO：0005623Cell219914268 GO：0044464Cellpart219814267 GO：0005622Intracellular14429624 GO：0044424Intracellularpart14119377 GO：0016020Membrane11557341 GO：0031224Intrinsictomembrane9305710 GO：0043229Intracellularorganelle11957973 GO：0043226Organelle11957977 GO：0044425Membranepart9896244 GO：0016021Integraltomembrane9095591

GO ID:the ID of gene ontology term；term:the name of gene ontology term；count：the number of DE genes associated with the listed GO ID；Pop Hits：the number of background population genes associated with the listed GO ID.

表2 小鼠ESCs誘導分化成ELCs差異甲基化基因在Pathway中分析結果

Definition: the definition of the Pathway ID；selectioncounts：the count of the DE gene entities directly associated with the listed Pathway ID；count：the count of the chosen background population gene entities associated with the listed Pathway ID；enrichment score：the enrichment score value of the Pathway ID, which equals to “-log10(Pvalue)”。

表3 ESCs高甲基化水平的基因

表4 ELCs高甲基化水平的基因

結合甲基化芯片的差異甲基化基因與GO分類分析挑選出可信值高，并可能與小鼠ESCs分化為ELCs相關的基因做進一步的芯片驗證實驗，以證實芯片的結果的可靠性。根據GO和Pathway分析結果，我們挑選參與細胞黏附和細胞周期的5個基因做驗證，這5個基因分別為：細胞周期蛋白依賴性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7)、鈣黏蛋白17 (cadherin 17,CDH17)、原鈣黏蛋白12 (protocadherin 12,PCDH12)、內皮細胞特異性黏附分子(endothelial cell-specific adhesion molecule,ESAM)和接觸蛋白1 (contactin 1,CNTN1)。驗證顯示挑選的差異甲基化基因的啟動子甲基化差異結果和RT-PCR結果趨勢基本一致，見表5，表明芯片數據真實可靠，可為后續(xù)的功能研究提供依據。

表5 差異甲基化基因啟動子芯片的甲基化情況與MeDIP-PCR對應情況

Number 0 or 1:a fragment of the gene promoter methylation number；IP/neg(MeDIP-PCR):the ratio of immunoprecipitation to negative control PCR result.

討 論

表觀遺傳在正常的發(fā)育和細胞生長過程中起作用，并且在基因、環(huán)境與疾病的關系之間也可能起到至關重要的作用[3-4]。細胞分化是一個從全能到多能，最后到專能，外延不斷縮小，內函不斷擴大的過程。在這個過程中，基因組并未發(fā)生明顯的序列變化，而是通過表觀遺傳有序的時空變化實現的，即基因啟動子區(qū)甲基化水平的變化?；騿幼訁^(qū)的DNA甲基化的變化有可能直接調控了基因的表達，進而控制細胞功能和表型，因此，基因啟動子區(qū)的甲基化有序的時空變化是個體發(fā)育過程中非常重要的調控環(huán)節(jié)，其中隱藏著大量與生命發(fā)生有關的玄機。從對基因啟動子區(qū)的甲基化譜入手，可望闡明細胞定向分化的關鍵調控機制，為細胞分化、個體發(fā)育研究進行理論和方法學探索。

DNA甲基化芯片技術作為基因組學研究的工具，經過多年的發(fā)展和檢驗，已是一種成熟，可靠的常用技術[5]。這種技術可以將某一空間和時間的樣本基因啟動子甲基化情況整體地展現出來。這里我們研究采用的是NimbleGen公司的高密度芯片1×2.1M的芯片，甲基化啟動子區(qū)的設計源于NCBI MM9權威數據庫，每張芯片含有2.1兆根探針含有22 425個小鼠基因啟動子信息，探針覆蓋基因啟動子轉錄起始位點上游8.2 kb,轉錄起始位點下游3 kb，還包含CpG島及miRNA啟動子甲基化信息。探針覆蓋區(qū)域為tilling設計，每個基因的長寡核苷酸探針的長度為60 mer,可以提供更高的信噪比、靈敏度、專一性和辨別能力。使用該芯片檢測出小鼠ESCs及誘導后的ELCs的差異甲基化，得到關于影響小鼠ESCs誘導為ELCs的大量寶貴的基礎信息，為進一步研究其中的發(fā)生機制提供了依據。

跟據CpG島的密集程度，基因啟動子分為3類： HCP、ICP和LCP。CpG通常被認為是甲基化高發(fā)區(qū)段，在眾多疾病研究領域中起著關鍵的作用[6-7]，而在細胞分化過程中，我們通過數據統(tǒng)計可以看到ICP的甲基化占多數。

我們這里應用軟件GenePix Pro 6.0，對甲基化芯片中基因啟動子區(qū)進行了一種表達調控極端模式的篩選，即ESCs中存在基因啟動子甲基化事件但ELCs中相應的基因卻沒有檢測到甲基化信號的基因作為備選，進行后期研究，同樣的ELCs中存在基因啟動子甲基化事件，但是ESCs中相應的基因沒有信號值的基因也作為備選后期研究的基因。這樣總共篩選到了3 435個基因，有些基因在啟動子區(qū)有多條探針信息顯示發(fā)生了甲基化，也有微量發(fā)生甲基化。將這些基因按照GO和Pathway進行歸類[8]，并進行討論其可能在ESCs誘導分化為ELCs的機理機制。

本文的GO分析是對發(fā)生了甲基化差異的基因的生物學功能進行注釋。之前在全基因表達的研究成果中對GO分析做了非常詳盡的介紹[9]。同樣選擇基因分類錯誤率(false discovery rate of the GOID, FDR)最小、且P值也是最小的前10位進行一個探討，在生物學過程中，主要是以一系列的細胞基礎代謝及生物分子調控為主，提示在小鼠ESCs定向分化為ELCs的過程正如其在胚胎發(fā)育的程中的表現情況類似，開啟或關閉細胞中代謝過程的基因表達，調控與成熟分化后細胞所行使生物學功能相關的蛋白組分合成與降解，由量變上升為質變，改變生物學表型。在生物學過程中，某些基因收到相關DNA甲基化表觀遺傳的調控，使得表達上升或者下降，引導合成分化后細胞的功能相關蛋白，抑制影響分化合成的功能性蛋白的合成。其中我們會選取具有代表性意義的基因，進行下一步的功能分析，看此基因的表達情況能否影響其表型的發(fā)生。在分子功能的GO條目中，我們可以看出小鼠ESCs在誘導分化為ELCs的過程中DNA甲基化基因啟動子調控是處于一種高度活躍的狀態(tài)，激活或抑制某些跟受體激活、蛋白結合等調控相關的因子基因的表達，這些基因的表達調控可能與組織的特化相關。在細胞成分GO分類中，我們可以看出DNA甲基化的調控對細胞膜相關的基因占主導地位。本身表皮是屬于生物體的一種不同于其它細胞器樣的膜基質的細胞成分，故細胞膜上的基因表達明顯受到DNA甲基化的表觀調控。這一系列的DNA甲基化的變化對于ESCs分化為ELCs均可能是必要的。

ESCs分化為ELCs，主要是研究表皮方面的分化，在本研究中，我們著重對跟細胞黏附相關的基因的啟動子區(qū)的DNA甲基化的情況做了篩選和進一步驗證，從細胞黏附相關的基因中我們發(fā)現鈣黏蛋白基因CDH17的DNA甲基化情況在ESCs分化為ELCs過程中是升高的，定量驗證實驗也證實了這個趨勢。CDH17的主要功能是需要鈣離子依賴活性、轉運各種寡肽在膜上的一個功能團，它起源于脊椎動物發(fā)育早期的染色體復制[10]。CDH17基因的啟動子屬于LCP，是一種低CpG島含量的啟動子區(qū)，用芯片檢測到一個甲基化區(qū)域內發(fā)生了甲基化事件，定量檢測的趨勢很明顯，在本研究中定向誘導分化為ELCs的發(fā)育研究的結果是符合生長發(fā)育的基本規(guī)律，CDH17基因啟動子區(qū)的甲基化水平升高，這很有可能在定向分化的過程中還是起到某種重要的表觀調控作用，跟之前的基因譜檢測結果也相一致，相應的基因也發(fā)生了下調[8]；PCDH12也是一種鈣依賴性跨膜蛋白，有研究報道它確實會影響到組織形態(tài)的形成，血管生成，細胞-基質的黏附和遷移，免疫反應和染色質重塑[11]。在本研究中PCDH12的啟動子區(qū)的甲基化也屬于LCP，芯片檢測到有存在甲基化的可能，但在相應的位置上用定量檢測，未發(fā)現有甲基化的片段存在，這可能說明PCDH12基因的DNA甲基化表觀不是直接調控PCDH12的基因表達發(fā)送差異變化的主要因素，研究中檢測到PCDH12基因表達差異很有可能與其它的表觀調控模式有關，才會導致PCDH12的表達差異，例如組蛋白的修飾，有可能羥甲基化這種表觀遺傳修飾也會導致PCDH12的表達差異，這些都有待我們進一步的研究和證實。CNTN1 參與DNA甲基化、細胞黏附、Notch 信號通路生物學過程，也是一種膜上蛋白，具有與DNA結合、與蛋白結合、N端轉移酶活性、GPI錨定的分子功能。DNA甲基化在定向分化的過程中起著非常重要的作用，某些基因的甲基化和去甲基化，直接決定分化后的生物表型和功能，在生長發(fā)育和疾病發(fā)生中有指導作用[12-13]，CNTN1基因的啟動子區(qū)屬于ICP，是一種中度甲基化啟動子區(qū)，在芯片檢測中我們發(fā)現它從ESCs分化為ELCs的過程是甲基化程度升高的，并且在定量檢測中我們也證實這一明顯的趨勢。ICP的基因啟動子的定量檢測數據中也發(fā)現，確實是比LCP要更高些。這個甲基化的趨勢和之前基因表達的情況對比也是負相關的，CNTN1的表達也是隨著分化而下降的[8]。這對今后更深入地研究胚胎干細胞分化為ELCs的發(fā)生機制給予提示和奠定基礎。在細胞黏附過程中，我們還發(fā)現了一個ICP的ESAM基因啟動子，定量檢測發(fā)現它的甲基化變化差異特別大，我們對應之前的研究發(fā)現，它在表達譜中的表達也是明顯下調的。ESAM基因位于小鼠第9號染色體，翻譯的蛋白屬于鈣依賴的細胞黏附因子，主要在膜基質中起一定作用，具有受體激活和蛋白結合一類的分子功能[14]，這提示我們這個基因在ESCs分化為ELCs的過程中可能存在比較重要的作用。

在信號通路的分析結果中，按通路中的基因啟動子甲基化的富集分值大小，選擇富集程度高的前10個同路的情況進行分析，發(fā)現其中在誘導成為ELCs過程中有一個很典型的信號通路，PPAR信號通路，這個信號通路研究發(fā)現與哺乳動物的生殖有很大關系，也符合我們的研究標準。并且在通路分析中，我們同樣看到跟合成和代謝相關的通路也發(fā)生了比較大的變化。這里我們著重挑選一個我們感興趣基因進行了討論,CDK7基因啟動子屬于HCP，即它的啟動子區(qū)富含CpG島。CDK7參與轉錄過程、DNA依賴的轉錄調控、蛋白氨基酸的磷酸化、細胞周期和細胞分裂過程，是核內的一種分子結構，具有核苷酸結合、蛋白激酶活性、蛋白絲氨酸蘇氨酸激酶活性、細胞周期依賴的蛋白激酶活性、ATP結合、轉移酶活性等功能。本實驗中，此基因的啟動子DNA甲基化是一個去甲基化的過程，則按照調控負相關的原理，它對應的基因表達上也會有所升高，前期的研究也證實了這一點。CDK7基因無任是芯片檢測結果還是定量檢測中都是上升的趨勢，提示CDK7在ESCs定向分化為ELCs后在維持ELCs細胞形態(tài)和功能上有一定作用。

綜合以上分析，在ESCs體外定向分化為ELCs的過程中，基因的啟動子區(qū)的DNA甲基化發(fā)生了巨大的變化，包括眾多信號分子、酶和細胞結構蛋白基因的啟動子區(qū)的甲基化變化，提示細胞分化不是一簡單的分子事件，而是由一系列分子通過網絡關聯事件共同協(xié)作完成。該定向分化的關鍵分子調控機制在DNA甲基化水平已得到初步數據的展示，尚需要進一步大量功能實驗研究闡明。我們的后續(xù)實驗將從這些篩選出的結果中，挑選感興趣的基因，深入功能研究討探其在分化過程中表觀調控所起作用及作用機制。

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Genome-widescreeningofpromotermethylationinembryonicstemcellsandembryonicstemcell-derivedepidermal-likecells

ZHANG Ren-li1, LIU Cai-xia1, MENG Jin-xiu2, ZHANG Li-li1, HAN Dong1, CAI Jia-jie1, WEN An-min1

(1ReproductiveMedicineCenter,2MedicalResearchCenter,GuangdongAcademyofMedicalScience/GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China.E-mail:renlizhangm@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the differential methylation of the promoters of the genes involved in the process of differentiation from embryonic stem cells (ESCs) into epidermal-like cells (ELCs).METHODSMouse ESCs were induced to differentiate into ELCsinvitroby using human amnion. Whole-genome DNA differential methylation between undifferentiated ESCs and ELCs was analyzed by DNA methylation chip. Immunoprecipitation of methylated DNA was performed using BiomagTMmagnetic beads coupled with mouse monoclonal antibody against 5-methylcytidine. The total input and immunoprecipitated DNA were labeled with Cy3- and Cy5-labeled random 9-mers, respectively, and hybridized to NimbleGen MM9 CpG promoter arrays (a 2.1M format array containing all known CpG islands annotated by UCSC and all well-characterized RefSeq promoter regions, from about -8 200 to +3 000 bp of the transcriptional start sites,totally covering 22 425 promoters). DNA methylation of promoter regions was analyzed to discover the potentially related genes.RESULTSAmong all the 17 500 DNA mathylation regions of the gene promoters in both ESCs and ELCs, 3 435 gene promoters showed to be differentially methylated, with 894 in high CpG-containing promoter,974 in intermediate CpG-containing promoter and 1 567 in low CpG-containing promoter.CONCLUSIONGreat changes of methylation in a large quantity of gene promoters occur during the differentiation of ESCs to ELCs, indicating that the differentiation is a complex process regulated by many genes, and how these genes work and co-work to regulate the differentiation procedure needs further investigation.

DNA methylation; Embryonic stem cells; Epidermal-like cells; Promoter; Immunoprecipitation of methylated DNA

R329.2+8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.001

1000- 4718(2013)05- 0769- 09

2012- 11- 07

2013- 02- 05

國家自然科學基金資助項目(No. 30700327);廣東省醫(yī)學科學基金資助項目(No. WSTJJ201112062107021969052-10211)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 9151009101000011)

△通訊作者 Tel： 020-83827812-60613; E-mail: renlizhangm@yahoo.com.cn