王 倩 ,馬躍美 ,孫 濤 ,劉艷榮 ,房東亮 ,田 原
(天津醫(yī)科大學1.外科手術學教研室;2.病理學教研室,天津300070)
白細胞介素-17(IL-17)在炎癥和自身免疫性疾病中具有重要的調節(jié)作用且在多種腫瘤中高表達,但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚未定論。目前關于IL-17對腫瘤細胞體外增殖作用的影響研究較少。近年來研究證明IL-17可以上調MMPs、IL-6和IL-8等促侵襲因子的表達促進腫瘤侵襲[1-2]。黑色素瘤是一種高侵襲性的惡性腫瘤,腫瘤細胞本身可以分泌MMP-2和MMP-9等基質金屬蛋白酶降解細胞外基質(ECM),促進腫瘤侵襲轉移。本研究在前期研究慢性炎癥與腫瘤關系的基礎上,通過體外實驗探討了IL-17對黑色素瘤B16細胞增殖和侵襲的影響,為進一步研究IL-17在慢性炎癥與腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調節(jié)作用奠定了基礎。
1.1 材料 小鼠黑色素瘤細胞株B16F10由天津醫(yī)科大學病理學教研室凍存。重組鼠IL-17購自美國PeproTech公司,transwell小室(直徑為 8μm)購自Invitrogen公司,MTT購自美國Sigma公司,Matrigel膠購自美國BD公司,細胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司,胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細胞B16F10,接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中 (加入青霉素、鏈霉素各100 U/mL),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以0.25%胰蛋白酶消化傳代。所有實驗均選用對數(shù)生長期的細胞。
1.2.2 MTT法檢測B16細胞的增殖能力 將B16細胞制備成1×104/mL單細胞懸液,按每孔200μL接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)液中加入終濃度分別為 5、10、20、50、100 ng/mL 的 IL-17,并設空白對照組,在培養(yǎng)箱中分別放置24、48、72 h后,加入MTT 100μL培養(yǎng)4 h,吸棄液體,每孔加入100μLDMSO充分溶解15min。用酶標儀于490 nm處測吸光度值(A值),以5復孔的平均A值為相應的A值。
1.2.3 transwell侵襲實驗檢測B16細胞的侵襲能力 用50mg/LMatrigel膠1∶8稀釋液包被transwell小室的上室面,37℃孵育過夜。實驗前細胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,次日消化重懸細胞,于下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基、上室中加入無血清和濃度為50 ng/mL IL-17的B16細胞懸液各200μL,并設空白對照組,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出小室,PBS淋洗,擦去上室中細胞,95%酒精固定10min,4 g/L結晶紫染色,PBS清洗,200倍倒置顯微鏡下拍照穿膜細胞,隨機選10個視野,計算平均數(shù)。實驗重復3次,每組各設3復孔。
1.2.4 明膠酶譜檢測B16細胞MMP-2和MMP-9的表達活性 將無血清的B16細胞接種到24孔板,每孔500μL,培養(yǎng)24 h后,在培養(yǎng)液中加入50 ng/mL IL-17,培養(yǎng)48 h后,收集上清液,12 000 r/min,離心10min,取上清液進行明膠酶譜檢測。以含0.1%明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳至溴酚蘭進入陽極緩沖液為止,分離凝膠,2.5%Triton-X100洗膠4次,每次30min。將膠完全浸入明膠酶孵育液(50mmol/L pH7.5Tris-HCl、10mmol/LCaCl2、200mol/LNaCl、1 μmol/L ZnCl2)中,37 ℃孵育 42 h,常規(guī)考馬斯亮藍染色,脫色液脫色至復染帶清晰,圖像分析系統(tǒng)測定凝膠中MMPs活性條帶活性水平,應用Gel-pro analyzer分析軟件測定條帶平均灰度值。
1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS17.0軟件做統(tǒng)計分析,多組比較采用方差分析,兩獨立樣本比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 IL-17對B16細胞增殖能力的影響 不同濃度IL-17作用于B16細胞24、48和72 h時,實驗組與對照組相比,細胞活力無變化,IL-17對細胞的增殖無影響,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。
2.2 IL-17對B16細胞侵襲能力的影響 50 ng/mL IL-17作用于B16細胞48 h后,與對照組相比,穿膜細胞數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表2 和圖 1)。
2.3 IL-17對B16細胞MMP-2和MMP-9表達活性的影響 明膠酶譜檢測結果顯示,50 ng/mL IL-17作用于B16細胞48 h后,可明顯增強細胞MMP-2和MMP-9活性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表3和圖 2)。
表1 IL-17作用不同時間B16細胞的A值(n=5)Tab1 Absorbanceof B16 cells treated with IL-17 on different time(n=5,)
表1 IL-17作用不同時間B16細胞的A值(n=5)Tab1 Absorbanceof B16 cells treated with IL-17 on different time(n=5,)
分組對照組5 ng/mL組10 ng/mL組20 ng/mL組50 ng/mL組100 ng/mL組FP 72 h 0.466±0.042 0.485±0.043 0.449±0.045 0.507±0.007 0.503±0.023 0.487±0.015 2.29 0.08 48 h 0.364±0.039 0.376±0.038 0.358±0.049 0.377±0.035 0.408±0.028 0.364±0.039 1.16 0.36 24 h 0.226±0.018 0.237±0.020 0.219±0.018 0.235±0.017 0.260±0.033 0.236±0.028 1.77 0.16
表2 IL-17對B16細胞侵襲能力的影響)Tab2 Effectof IL-17 on invision ability of B16 cells
表2 IL-17對B16細胞侵襲能力的影響)Tab2 Effectof IL-17 on invision ability of B16 cells
與對照組相比*P<0.01
n99組別對照組50 ng/mL組t穿膜細胞數(shù)8.89±1.45 34.22±1.56*35.61
表3 IL-17作用下B16細胞MMP-2和MMP-9的活性分析Tab3 AnalysisofMMP-2 and MMP-9 activitiesof B16 cells treated with IL-17
表3 IL-17作用下B16細胞MMP-2和MMP-9的活性分析Tab3 AnalysisofMMP-2 and MMP-9 activitiesof B16 cells treated with IL-17
與對照組相比*P<0.01,**P<0.001
MMP-9 5.26±0.29 28.28±1.51**26.00 MMP-2 7.06±0.62 13.64±2.32*4.75組別對照組實驗組t
IL-17是一種主要由活化記憶CD4+T細胞即Th17細胞分泌的促炎因子。研究表明,Th17細胞及IL-17與炎癥和自身免疫性疾病如風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化等多種疾病相關。目前IL-17對腫瘤的作用尚存在爭論。有研究認為,IL-17通過T細胞依賴的機制產(chǎn)生抗腫瘤效應[3]。但多數(shù)研究傾向于IL-17的促腫瘤作用。IL-17通過激活IL-6依賴的Stat3信號通路促進腫瘤生長[4];IL-17可促進人促絨癌JEG-3細胞的增殖和侵襲,但其機制尚未闡明[5];結腸癌中,IL-17通過誘導癌細胞分泌VEGF促進腫瘤血管生成,且與患者預后呈負相關[6]。
本課題組在前期建立小鼠氣囊卡介苗慢性炎癥模型[7]的基礎上成功構建了氣囊卡介苗-黑色素瘤的慢性炎癥-腫瘤復合模型,結果表明實驗組腫瘤體積、重量、明膠酶表達活性、微血管密度(MVD)及VEGF 5項指標與生理鹽水-黑色素瘤對照組相比均升高。進一步檢測小鼠血清細胞因子發(fā)現(xiàn),實驗組與對照組相比,IL-17較其他細胞因子明顯升高,筆者推測在此氣囊卡介苗-黑色素瘤模型中IL-17可能對上述5項檢測指標發(fā)揮重要的調節(jié)作用。為了進一步探討IL-17是否對腫瘤生長有直接作用,筆者在體外用IL-17刺激B16細胞,結果顯示IL-17并不直接刺激黑色素瘤細胞增殖,推測其可能通過誘導黑色素瘤細胞或基質細胞分泌VEGF進而促進血管生成來促進腫瘤生長。
本研究transwell侵襲實驗結果顯示,IL-17處理后B16細胞穿膜細胞數(shù)明顯增多,提示IL-17可以促進B16細胞的體外侵襲。MMPs是一類與腫瘤侵襲相關的鋅依賴性肽鏈內切酶家族,通過降解和重塑細胞外基質(ECM),破壞基底膜,促進腫瘤侵襲和轉移,其生成和活化依賴多種細胞因子。近年來研究表明MMPs的表達與IL-17相關。在銀屑病性關節(jié)炎中,IL-17可誘導IL-6、IL-8和MMP-3的產(chǎn)生,阻斷IL-17RA抑制它們產(chǎn)生[8];在垂體腺瘤中研究發(fā)現(xiàn),浸潤組腫瘤組織IL-17及IL-17R表達水平明顯升高且與MMP-9表達呈正相關[9];而且IL-17通過激活AKT依賴的IL-6/JAK2/STAT 3信號途徑上調肝癌細胞IL-8、MMP-2、VEGF的表達,促進肝癌遷移、侵襲[2]。本研究顯示,IL-17處理B16細胞后其MMP-2和MMP-9的活性增強,提示IL-17可能通過上調MMP-2和MMP-9的活性來促進B16細胞的侵襲能力,但其具體機制尚待進一步研究。
綜上所述,IL-17對黑色素瘤B16細胞的增殖無明顯的刺激作用,但可增強細胞的體外侵襲能力,可能通過增強MMP-2和MMP-9的活性而發(fā)揮作用,其具體機制目前尚不清楚。本研究為探討IL-17在慢性炎癥與腫瘤進展中的調節(jié)作用提供了實驗依據(jù),也為通過調控IL-17等炎癥因子的方法抑制黑色素瘤的侵襲和轉移提供了新思路。
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