施 慧，謝建軍，許文軍，余方平，郭 闖

（1.浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100；2.江蘇省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇南京 210036）

對(duì)蝦病毒病的流行和傳播成了養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一大困擾，每年因蝦病造成的損失非常大對(duì)海洋資源的可持續(xù)發(fā)展造成巨大威脅，因此對(duì)蝦病毒病的研究已成為當(dāng)前世界蝦病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[1]。至今為止，全世界已經(jīng)在養(yǎng)殖對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)20余種對(duì)蝦病毒病[1-4]，其中對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下組織壞死病毒（Infectious hypodermal&haematopoietic necrosis virus，IHHNV）和桃拉綜合癥病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）是當(dāng)前嚴(yán)重危害我國對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要對(duì)蝦病毒[5]。

對(duì)蝦苗種是養(yǎng)殖生產(chǎn)的基礎(chǔ)，沒有優(yōu)良的品種和健壯的苗種，就沒有高效的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)，蝦苗的健康狀況和帶病與否是影響?zhàn)B殖成敗的關(guān)鍵之一。目前浙江省凡納濱對(duì)蝦、日本對(duì)蝦大部分苗種是通過外省調(diào)運(yùn)經(jīng)過當(dāng)?shù)孛鐝S暫養(yǎng)馴化，生產(chǎn)秩序混亂，對(duì)蝦苗種中病毒的攜帶及病毒的傳播給浙江省的對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來了安全隱患。本研究通過對(duì)2009-2010年在舟山、寧波、三門等市縣凡納濱對(duì)蝦苗種養(yǎng)殖場調(diào)查取樣，采用OIE手冊[6]推薦的病毒檢測方法，對(duì)WSSV、IHHNV和TSV這三種我國報(bào)道的對(duì)蝦主要病毒進(jìn)行普查，旨在了解浙江地區(qū)WSSV、IHHNV和TSV在種苗中的流行情況，分析凡納濱對(duì)蝦海水養(yǎng)殖中苗種病毒流行的主要特點(diǎn)，全面摸清對(duì)蝦海水養(yǎng)殖苗種生產(chǎn)情況，提出控制對(duì)策，為進(jìn)一步提高水產(chǎn)苗種質(zhì)量安全水平，加快水生動(dòng)物疫病防治站建設(shè)，完善水生動(dòng)物防疫體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2009-2010 年從鄞州、慈溪、象山、舟山、三門等地區(qū)22家對(duì)蝦苗種養(yǎng)殖場采集的凡納濱對(duì)蝦苗種樣品共118份，其中2009年28份，2010年90份。采樣參照OIE《水生動(dòng)物疾病診斷手冊》[6]方法，樣品置95%乙醇中固定運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室4℃，TSV檢測用樣品置RNA保護(hù)劑中，-70℃保存。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品總DNA的提取

取已固定蝦樣，攪動(dòng)固定瓶中樣本，隨機(jī)取蝦樣碾碎，取上述勻漿樣本約50 mg懸浮于300 μL TE，使用DNA抽提試劑盒（Roche公司）制備檢測用DNA樣本，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品總RNA的提取

取已固定蝦樣，攪動(dòng)固定瓶中樣本，隨機(jī)取蝦樣碾碎，取上述勻漿樣本約50 mg，使用天凈沙柱式動(dòng)物RNAout試劑盒制備檢測用RNA樣本，-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 WSSV、IHHNV和TSV檢測引物的合成

WSSV采用KIMURA等[7]的nest-PCR引物，序列如下：

外引物：P1：5’ATCATGGCTGCTTCACAGAC 3’

P2：5’GGCTGGAGAGGACAAGACAT 3’

內(nèi)引物：P3：5’TCTTCATCAGATGCTACTGC 3’

P4：5’TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 3’

IHHNV采用OIE手冊（2009版）推薦的引物，序列如下：

389F：5’CGGAACACAACCCGACTTTA 3’

389R：5’GGCCAAGACCAAAATACGAA 3’

TSV采用OIE手冊（2009版）推薦的引物，序列如下:

9195：5 ’-TCA ATG AGA GCT TGG TCC-3’

9992：5 ’-AAG TAG ACA GCC GCG CTT-3’

1.4 WSSV的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增儀為美國BioRad DNA Engine PCR儀。25 μL PCR反應(yīng)體系，第一次PCR：引物為P1和P2，16.25 μL 滅菌雙蒸水，2 μL 10×Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L each），各 0.5 μL 5 μmol/L 引物，3 μL DNA模板，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。第二次PCR：除了引物換成P3和P4外，其它的與第一次PCR相同。

PCR反應(yīng)條件：第一次反應(yīng)條件：94℃變性4 min、94℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 1 min，共39個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，6℃保存。取5 μL PCR反應(yīng)液在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察照相（該反應(yīng)中特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物是982 bp）。第二次反應(yīng)條件：94℃變性4 min、94℃ 30 s、50.8℃ 45 s、72℃45 s，共39個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，6℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外檢測并拍照。（該反應(yīng)中特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物是570 bp）每次檢測反應(yīng)都設(shè)陽性對(duì)照（WSSV陽性DNA模板）和陰性對(duì)照（無模板和對(duì)蝦DNA樣本）。

1.5 IHHNV的PCR擴(kuò)增

25 μL PCR 反應(yīng)體系，包含 16.25 μL 滅菌雙蒸水，2 μL 10×Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L each），各0.5 μL 5 μmol/L 引物，3 μL DNA 模板，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃變性 4 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，6℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外檢測并拍照。該反應(yīng)中特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物是389 bp，每次檢測反應(yīng)都設(shè)陽性對(duì)照（IHHNV陽性DNA模板）和陰性對(duì)照（無模板和對(duì)蝦DNA樣本）。

1.6 TSV的RT-PCR擴(kuò)增

PCR 體系和反應(yīng)參數(shù)如下：I.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（10 μL）：2 μL 5×RT buffer，1 μL dNTPs （10 mmol/L each），0.5 μL Oligo-dT,0.5 μL RNase inhibitor（40 μ/μL）0.5 μL AMV Reverse TranscriptaseT，RNA 模板 2 μL，3.5 μL RNase free H2O。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：42 °C 45 min，95 °C 5 min，冰浴5 min。II.PCR反應(yīng)體系（25 μL）：18 μL 滅菌雙蒸水，2.5 μL 10×Buffer，0.5 μL Dntp（10 mmol/L each)，各 0.5 μL 5 μmol/L 引物，2.5 μL cDNA 模板，0.5 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 5 min，然后 94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s，共 35循環(huán)，最后60℃10 min。（該反應(yīng)中特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物是213 bp）III。每次PCR檢測反應(yīng)都設(shè)陽性對(duì)照（TSV陽性cDNA模板）和陰性對(duì)照（無模板）。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外檢測并拍照。

1.7 跟蹤監(jiān)測

2010年采用PCR檢測方法對(duì)3個(gè)放養(yǎng)舟山某種苗場帶毒蝦苗的養(yǎng)殖戶蝦塘進(jìn)行WSSV的跟蹤監(jiān)測。

2 結(jié)果

2.1 苗種樣品中WSSV和IHHNV病毒檢測結(jié)果

從表1可以看出，采集的118份對(duì)蝦苗種樣品中，攜帶WSSV的有32份，占27.1%：攜帶IHHNV的有46份，占38.98%；同時(shí)攜帶WSSV和 IHHNV的有 20份，占16.95%，TSV均未見分離（圖1、圖2）。

圖1 對(duì)蝦苗種WSSV的套式PCR檢測結(jié)果Fig.1 Deteced the WSSV infection of postlarvae by nested PCR

表1 2009-2010年對(duì)蝦苗種樣品WSSV和IHHNV PCR檢測結(jié)果Tab.1 Detection of WSSV and IHHNV in Samples by PCR during 2009-2008

2.2 臨床跟蹤監(jiān)測結(jié)果

2010年8月放養(yǎng)攜帶WSSV病毒苗種的3個(gè)對(duì)蝦養(yǎng)殖塘陸續(xù)發(fā)病，并出現(xiàn)大量死亡。病蝦殼內(nèi)側(cè)呈現(xiàn)白色斑點(diǎn)，WSSV PCR檢測呈陽性（圖 3、圖 4）。

3 討論

本研究通過對(duì)鄞州、慈溪、象山、舟山、三門等市縣對(duì)蝦苗種養(yǎng)殖場調(diào)查取樣，采用OIE手冊推薦的病毒檢測方法，對(duì)WSSV、IHHNV和TSV這3種對(duì)蝦主要病毒進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所采集的凡納濱對(duì)蝦苗種樣品中：27.1%的攜帶WSSV，38.98%的攜帶IHHNV，且同時(shí)攜帶此2種病毒的占16.95%，而TSV未見分離。說明浙江地區(qū)凡納濱對(duì)蝦苗種中有WSSV和IHHNV兩種病毒攜帶，且常存在混合侵染的情況。同時(shí)跟蹤監(jiān)測結(jié)果顯示，放養(yǎng)攜帶WSSV蝦苗養(yǎng)殖塘的WSSV發(fā)病率明顯高于放養(yǎng)健康苗種的養(yǎng)殖塘，說明攜帶WSSV的蝦苗由于其抗逆性較差極易受外界環(huán)境影響而發(fā)病。

圖2 對(duì)蝦苗種IHHNV的PCR檢測結(jié)果Fig.2 Deteced the IHHNV infection of postlarvae by PCR

圖3 感染W(wǎng)SSV的凡納濱對(duì)蝦Fig.3 P.vannamei infected by WSSV

圖4 患病對(duì)蝦WSSV的PCR檢測結(jié)果Fig.4 Deteced the WSSV infection of diseased P.vannamei by P CR

對(duì)蝦白斑綜合征于1992年首次發(fā)現(xiàn)于中國臺(tái)灣，此后在世界范圍內(nèi)傳播，每年給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成數(shù)百億元的經(jīng)濟(jì)損失，成為威脅對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病[8]。該病病原是WSSV，其主要的檢測方法有：目視觀察法、傳統(tǒng)組織學(xué)方法、電子顯微技術(shù)、生化檢驗(yàn)法、細(xì)胞培養(yǎng)方法、免疫學(xué)的ELISA技術(shù)、分子生物學(xué)的核酸探針和PCR技術(shù)等[9-14]。PCR特異性高、簡單、快速，它不僅在病毒基礎(chǔ)生物學(xué)研究、病毒間比較研究中廣泛應(yīng)用，而且在檢測對(duì)蝦是否攜帶病毒等方面也有較高的應(yīng)用價(jià)值，已廣泛應(yīng)用于WSSV檢測。一些學(xué)者還對(duì)PCR技術(shù)作了不同的改進(jìn)，發(fā)展出套式PCR、競爭式PCR等方法[15-16]，使檢測方法更快速、準(zhǔn)確。項(xiàng)目組應(yīng)用套式PCR方法對(duì)采集的苗種樣本進(jìn)行了檢測，但在次檢測過程中我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用OIE手冊推薦的引物對(duì)（146F1/146R1、146F2/146R2）檢測苗種樣本時(shí)，59份樣只檢出1份WSSV陽性，但是應(yīng)用Kimura的一組引物（P1/P2、P3/P4）檢出16份苗種樣本呈WSSV核酸陽性，說明該引物組更適于WSSV感染初期或潛伏期的蝦苗的檢測和環(huán)境監(jiān)測。在本次檢測中還發(fā)現(xiàn)經(jīng)一步PCR檢測為WSSV陰性的苗種樣品，套式PCR的檢測結(jié)果卻為陽性，說明套式PCR檢測法較普通的一步PCR有更高的靈敏度，適于WSSV感染初期或潛伏期的親蝦和蝦苗的檢測和環(huán)境監(jiān)測。戰(zhàn)文斌等[17]研究發(fā)現(xiàn)海捕親蝦有WSSV感染的陽性個(gè)體，由其產(chǎn)的卵培育出的仔蝦也檢測有WSSV感染的陽性個(gè)體，因此存在病毒由親蝦傳播給蝦苗的感染途徑。目前雖然垂直傳播尚不明了但親蝦的糞便等排泄物污染了海水,通過海水進(jìn)行水平傳播的可能性非常大，所以苗種養(yǎng)殖場的病毒檢測對(duì)苗種的質(zhì)量安全十分必要。

對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病也稱慢性矮小殘缺綜合癥，該病是流行于美洲養(yǎng)殖對(duì)蝦的主要疾病之一，隨著我國對(duì)蝦種苗及親蝦的大量引進(jìn)，我國部分對(duì)蝦養(yǎng)殖中已發(fā)現(xiàn)IHHNV，且呈流行趨勢。LIGHTNER等[18]研究發(fā)現(xiàn)，感染IHHNV或患病后存活下來的凡納濱對(duì)蝦會(huì)終生帶毒，并可通過垂直傳播把病毒傳給下一代和水平傳播傳給其他種群。本研究中對(duì)采集的118份苗種樣本進(jìn)行IHHNV病毒PCR檢測，其中陽性比例占38.98%，且有20份樣本IHHNV和WSSV均呈陽性，這也說明了浙江地區(qū)的養(yǎng)殖對(duì)蝦苗種受IHHNV危害的嚴(yán)重性，提示有關(guān)部門應(yīng)該加強(qiáng)防范，在蝦苗、親蝦的養(yǎng)殖、運(yùn)輸和流通過程中采取有效措施，防止疫病傳入。

苗種是水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，苗種的質(zhì)量直接影響水產(chǎn)養(yǎng)殖的效益和成敗，也是影響?zhàn)B殖產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素。浙江省無對(duì)蝦親本繁育基地，所有苗種均需外調(diào)，然后培育至商品苗規(guī)格。調(diào)查共采集凡納濱對(duì)蝦苗樣品118份，其中80%樣本來自福建，10%來自海南，10%來自廣東。而國內(nèi)苗種的親本大部分從國外引進(jìn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2010年國內(nèi)對(duì)蝦苗場總共從國外引進(jìn)親蝦11萬對(duì)，且進(jìn)口親蝦中80%以上都購于美國邁阿密SIS凡納濱對(duì)蝦育種基地。2010年，華南地區(qū)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖遭受近20年來最嚴(yán)重病害，發(fā)病率和排塘率都在50%以上，個(gè)別地區(qū)高達(dá)90%。國內(nèi)專家經(jīng)過一系列的調(diào)查研究認(rèn)為今年的病害不是由已知病源引起，有可能是新病原，但發(fā)病原因與跟環(huán)境、苗種有很大關(guān)系。目前要控制對(duì)蝦病毒病的進(jìn)一步發(fā)展，最有效的方法就是加強(qiáng)對(duì)蝦種苗的檢測工作，不允許把帶病毒的蝦苗流入到市場中去，同時(shí)要大力培育高健康蝦苗，從源頭上杜絕不良苗種的產(chǎn)生，這樣才是預(yù)防病毒病的根本所在。

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